1、LOGO小组成员：王哲鉴、钟 鑫 陈 阳、刘一宁指导教师：綦 霞所在院系：检验医学院 Company Logo摘摘 要要1实验方法实验方法2结果讨论结果讨论3 4致致 谢谢Company Logo 目的：检测伤寒O抗体一般采用肥达实验（直接凝集实验），在临床诊断中有重要的意义。能否建立一个用酶联免疫吸附法检测血清中抗伤寒“O”抗体的实验体系，提高临床诊断效果是本实验要解决的关键问题。原理：以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O抗体，将后者纯化，与酶连接制备成酶标抗体，以伤寒O抗原包被酶标板，以制备的伤寒酶标抗体为竞争抗体，可以构成竞争法检测伤寒抗体的酶联免疫实验。结果：成功建立了一个酶联免疫吸附
2、试验检结果：成功建立了一个酶联免疫吸附试验检测伤寒测伤寒O抗体的实验体系抗体的实验体系结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤结论：酶联免疫吸附法可以检测血清中抗伤寒寒“O”抗体抗体实验材料：实验动物：家兔（1.性格温顺，一般不咬人，但其爪锐利，挣扎时易抓伤操作人员 2.与伤寒沙门菌种属差异大，可保证产生抗体 3.体重大，血量多，得到的血清可保证实验顺利进行）实验试剂：饱和硫酸铵溶液 PBS透析液 辣根过氧化物酶(HRP)NaIO4溶液 2.5%乙二醇溶液 硼氢化钠溶液 包被稀释液 酶标抗体 待测抗体 稀释液 洗涤液 底物液实验器材：兔笼 透析膜 离心机 加样器 酶标板Company LogoC
3、ompany Logo1234制备伤寒制备伤寒O抗体抗体 纯化纯化 抗体抗体 酶与抗酶与抗体的连接体的连接 ELISA竞争检测竞争检测伤寒伤寒O抗抗体（预实验体（预实验和正式实验）和正式实验）颗粒性抗原伤寒杆菌颗粒性抗原伤寒杆菌备注备注第一周第一周第一天第一天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.1ml0.1ml之前取血之前取血0.7-0.7-1ml1ml，分离血清，分离血清，待用待用第二天第二天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第三天第三天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.2ml0.2ml第四天第四天耳缘静脉注射耳缘静脉注射0.5ml0.5ml第二周第二周加强免疫：皮下注射加强免疫：皮下注射1.0
4、ml1.0ml（两（两侧各侧各0.5ml0.5ml）第三周第三周耳中央动脉采血，分离血清耳中央动脉采血，分离血清 1份血清（份血清（5ml）+1份生理盐水份生理盐水+2份饱和硫酸铵份饱和硫酸铵 置试管中置试管中 2000转离心转离心20min 弃上清弃上清 1.52ml NS 溶解沉淀溶解沉淀 透析透析24h 收集、标记、冰冻收集、标记、冰冻 5管管缓缓摇缓缓摇动动 ,室温室温2h（1.5h）盐析法盐析法实验原理：实验原理：NaIO4NaIO4是强氧化剂，能将是强氧化剂，能将HRPHRP的甘露糖部分（与的甘露糖部分（与酶活性无关的部分）的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨酶活性无关的部分）的羟基氧
5、化成醛基，然后与抗体的氨基结合，形成酶标抗体，反应式如下：基结合，形成酶标抗体，反应式如下：实验方法：实验方法：标记过程：标记过程：1.1.将将HRP 5mgHRP 5mg溶于溶于0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 0.5 ml PH5.6 HAC-NaAc 缓冲液中（老师缓冲液中（老师做）。做）。2.2.滴入滴入NaIO4 0.25ml,NaIO4 0.25ml,此时酶的颜色由黄变绿。此时酶的颜色由黄变绿。4 4作用作用30min30min。3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（稳定剂）终止反应，室温30min。4.加入待标Ab1.52.0ml,用pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的p
6、H至 9.0左右，4过夜。5.加入0.1ml硼氢化钠，42小时。6.pH7.4 PBS液透析过夜，收集、标记成酶标记抗体和冻存（一）.酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体预实验1.包被Ag：抗原（伤寒）用包被液稀释，每孔加入100l，置37作用4h或4作用24h。2.洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次1min，于吸水纸上充分拍干。3.加入样品：每孔加入酶标Ab及Ab各100l，放入37恒温箱中孵育30min。（如图1）4.洗涤：同上5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置约5-15min，密切观察。6.终止反应 待测待测酶标酶标原液原液1：51：251：125阴性阴性对照对照1：2
7、51：501：1001：200（图（图1）选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度选择每一排阴阳色差最明显者为最佳工作浓度 稀释方法：1.酶标抗体1:251200ul(牛奶）+50ul（酶标）=1250ul1:50600ul(牛奶）+600=1200ul1:100 600ul(牛奶）+600=1200ul1:200600ul(牛奶）+600=1200ul 2.待测抗体1:5600ul(牛奶)+150ul(待测)=750ul1:25600ul(牛奶)+150ul=750ul 1:125600ul(牛奶)+150ul=750ul （二）酶联免疫竞争法检测伤寒O抗体正式实验 选取预实验所选定的最佳工
8、作浓度对酶标抗体及待测抗选取预实验所选定的最佳工作浓度对酶标抗体及待测抗体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：体进行稀释，验证该检测方法的可行性。方法如下：1.1.包被包被 2.2.洗涤洗涤 3.3.加样加样(如图如图2)2)4.4.洗涤洗涤 5.5.显色显色 6.6.判断检出率判断检出率自己的待测自己的待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul别组的待测别组的待测Ab100ul+酶标酶标Ab100ul稀释液稀释液100ul+酶酶标标Ab100ul 阳性阳性 对照对照 待测待测1 待测待测2 待测待测3 待测待测4 阴性阴性 对照对照图图(2)经洗涤显色后经洗涤显色后,根据颜色深浅判断
9、检出率根据颜色深浅判断检出率,若待测组颜色若待测组颜色更接近于阳性对照更接近于阳性对照,则记为则记为“+”+”，反之则记为，反之则记为“-”-”。（一）实验结果 阴 阳 以酶标抗体1：100稀释和待测抗体原液为最佳工作浓度做正式实验，得到以下结果，待测1“+”,待测2“+”,待测3“+”,待测4“+”;4组待测抗体均被成功检出，检出率100%。（二）实验讨论 伤寒，由伤寒杆菌引起，检测伤寒O抗体在伤寒杆菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达实验可对抗体进行半定量检测。但近年来发现，随着轻型和亚型病人的增多，伤寒杆菌变异株增多，或发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂抑制抗体的形成，肥达实验阳性率有下降的趋势，难以满足临床要求。ELISA法检测伤寒杆菌抗原或抗体，灵敏度好、特异性强、二者均达到70%以上，反应时间短，操作简便，结果易于判断。对伤寒早起诊断，有较高的临床价值，因此，早起诊断以ELISA法检测血液中伤寒特异性或抗体为依据。LOGO
