1、一、培养基的配置与灭菌一、培养基的配置与灭菌 取取2个个250ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养液体培养基和基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基液体培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体培养基固体培养基细菌的划线分离细菌的划线分离封口膜：既通气封口膜：既通气又不使菌进入又不使菌进入二、倒平板二、倒平板 灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后个培养皿中，倒后立即置于立即置于水平水平位置上
2、，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面待凝，使之形成平面注意事项：注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三另外三指持三角瓶角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的
3、瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染基，造成污染.三、大肠杆菌的扩大培养三、大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼
4、烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。在培养后如何判断是否有杂菌污染?在培养后如何判断是否有杂菌污染?霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?在培养后如何判断是否有杂菌污染?划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.需要使锥形瓶的瓶口通过火
5、焰，灼烧灭菌一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一四四、大肠杆菌的划线分离、大肠杆菌的划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法1、划线分离法、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线平板上连续划线.不能使用脱不能使用脱脂棉，否则脂棉，否则容易吸水，容易吸水，造成污染。造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二
6、是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划每次划线前灼烧接种环是为了线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后
7、，杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧划线结束后灼烧接种环，能及时接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。免细菌污染环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度
8、太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,
9、然后取一定量然后取一定量稀释液加在固体培养基上稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌便会形成一个菌落落,这是这是消除污染消除污染杂菌的通用方法杂菌的通用方法,也是用于也是用于筛选高筛选高表达量菌株表达量菌株的最的最简便方法之一简便方法之一五五、大肠杆菌分离后保存、大肠杆菌分离后保存1 1、临
10、时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法、长期保存：甘油冷冻管藏法1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。（胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3 3）注意微生物生长条件，如注意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温度等。、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜细菌喜碱，喜蛋白质，喜3737度；霉菌喜酸，喜度；霉菌喜酸，喜糖，喜糖，喜2
11、5-3025-30度度小结小结2.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用学和进一步的形态观察，如用革兰
12、氏染色法革兰氏染色法等。等。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。的。例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）五、大肠杆菌分离
13、后保存为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。桌面及人手用酒精棉球消毒为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于
14、筛选高表达量菌株的最简便方法之一划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。4.实验完成后实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃弃物也要高压灭菌后再抛弃（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。（4）表中营
15、养成分共有 类。桌面及人手用酒精棉球消毒在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。一、培养基的配置与灭菌三、大肠杆菌的扩大培养五、大肠杆菌分离后保存答：以免接种环温度太高，杀死菌种。在培养后如何判断是否有杂菌污染?5.如果分离的是转基因的大肠杆菌如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的如何保证不被普通的大肠杆菌所污染大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的过改造的，通常加入了抗性基因的DNADNA序列，序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进所以可用含有相
16、应抗生素的培养基对菌体进行培养。行培养。【课堂练习课堂练习】例例1 1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量D例例2 2下面对发酵工程中灭菌的理解下面对发酵工程中灭菌的理解的是的是（）A.A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.接种前菌种要进行灭菌接种前菌种要进行灭菌C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必
17、须在接种前灭菌必须在接种前B编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例例3 3右表是某微生物培右表是某微生物培养基成分，请据此回答：养基成分，请据此回答：（1 1）右表培养基可培养）右表培养基可培养的微生物类型的微生物类型是是 。（2 2）若不慎将过量）若不慎将过量NaClNaCl加入培养基中。加入培养基中。如不想浪费此培养基，如不想浪费
18、此培养基，可再加入可再加入 .自养型微生物自养型微生物 含碳有机物含碳有机物（3 3）若除去成分，加入（）若除去成分，加入（CH2OCH2O），），该培养基可用于培养该培养基可用于培养 。（4 4）表中营养成分共有）表中营养成分共有 类。类。（5 5）不论何种培养基，在各种成分都）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是溶化后分装前，要进行的是 。（6 6）右表中各成分重量确定的原则）右表中各成分重量确定的原则是是 。（7 7）若右表培养基用于菌种鉴定，应）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分该增加的成分 。固氮微生物固氮微生物 3 调整调整pHpH 依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定 琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）
