1、阿尔茨海默病模型大鼠的构阿尔茨海默病模型大鼠的构建建动物 模 型 阿尔茨海默病（AlzheimerS disease，AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。主要表现为进行性认知功能障碍、记忆力减退、运动行为失常和人格改变等；其主要组织病理学特征是神经元胞外出现 淀粉样蛋白（A）聚集形成的神经炎性斑NPs，亦称老年斑（SPs）、胞内tau蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结（NFTs）、神经元凋亡或缺失、突触缺失等。随着我国近年来人口老龄化越来越严峻，AD发病率显著提高，在阿尔茨海默病相关研究中，建立理想的动物模型颇受关注，这有利于促进阿尔茨海默病病因、发病机制、病理过程，以及寻找
2、和筛选预防与治疗药物等研究的深入。背背景景ADAD模型大鼠的研究模型大鼠的研究方案方案目录目录CATALOGADAD动物模型学动物模型学习评价习评价ADAD动物模型研动物模型研究进展究进展ADAD动物模型研动物模型研究进展究进展01代 许多动物都可以成为模拟阿尔茨海默病病理学特征的模型，包括鼠、猫、犬、兔、山羊、绵羊、北极 熊和非人类灵长类动物等。其中，小鼠和大鼠相对于其他动物价格便宜、繁殖力强、生存率高、易饲养，有利于进行大样本实验研究，而且具有较强的快速学习能力，生理过程接近人类，因此小鼠和大鼠是目前最广泛用于制备阿尔茨海默病模型的动物。01 自然衰老的动自然衰老的动物模型物模型 快速老化
3、小鼠快速老化小鼠模型模型以衰老为基础以衰老为基础的的ADAD模型模型03 APP APP 转基因模型转基因模型 PS1 PS1 转基因模型转基因模型tau tau 相关模型相关模型 多重转基因模型多重转基因模型 转基因转基因ADAD模型模型02化学损伤化学损伤物理损伤物理损伤饮食诱导饮食诱导 各种因素诱各种因素诱发的发的ADAD模型模型 AD AD 是一个与年龄密切相关的疾病，衰老因素在是一个与年龄密切相关的疾病，衰老因素在AD AD 发病过程中起着重要作用。以衰发病过程中起着重要作用。以衰老为老为 AD AD 发病基础的动物模型成为实验研究中不可或缺的发病基础的动物模型成为实验研究中不可或缺
4、的部分部分 自然衰老自然衰老ADAD模型模型 自然衰老动物模型脑内神经元萎缩，胆碱能功能低下，同时自然衰老动物模型脑内神经元萎缩，胆碱能功能低下，同时表现为感觉、运动以及学习记忆力等多种功能的减退，这符合表现为感觉、运动以及学习记忆力等多种功能的减退，这符合 ADAD 患者的临床表现。患者的临床表现。造模方法：将造模方法：将1212月龄小鼠或月龄小鼠或3535月龄大鼠，雌性或雄性，饲月龄大鼠，雌性或雄性，饲养在屏障环境的动物实验室，直至饲养所需的年龄。常用老年养在屏障环境的动物实验室，直至饲养所需的年龄。常用老年动物的年龄为小鼠动物的年龄为小鼠12241224月龄，大鼠衰老早期月龄，大鼠衰老早
5、期2126 2126 月龄，衰老月龄，衰老晚期晚期 30323032 月龄。月龄。此模型的优点：动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发此模型的优点：动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发生的，与生的，与 ADAD 真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、干预。干预。缺点：只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺缺点：只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺乏乏 AD AD 相关相关 AA沉积及沉积及 NFTNFT，并不能全面模拟并不能全面模拟 ADAD 的变化。且动的变化。且动物饲养周期和实验周期长、病死率高。物饲养周期和实验周期长、
6、病死率高。快速老化小鼠模型快速老化小鼠模型 19751975年日本京都大学年日本京都大学Take-da Take-da 教授培养出快速老化小鼠教授培养出快速老化小鼠（senescence accelerated mouse/pronesenescence accelerated mouse/prone，SAMPSAMP）。此后，。此后，根据小鼠衰老程度、寿命和病理表现进行选择性繁殖，其中根据小鼠衰老程度、寿命和病理表现进行选择性繁殖，其中 SAMP8SAMP8 作为作为 AD AD 动物模型被广泛认可。动物模型被广泛认可。此模型优点：此模型优点：SAMP8 SAMP8 既有自然衰老小鼠特征，又
7、有类似既有自然衰老小鼠特征，又有类似 AD AD 脑部病理改变及学习记忆障碍，已被广泛应用于研究与年龄脑部病理改变及学习记忆障碍，已被广泛应用于研究与年龄相关的学习记忆障碍的机制及相关的药物研发中相关的学习记忆障碍的机制及相关的药物研发中 缺点：该模型成本较高，小鼠寿命短，不适合用于长周期缺点：该模型成本较高，小鼠寿命短，不适合用于长周期实验。实验。010203 AA注射诱导模型注射诱导模型东莨菪碱诱导的模型东莨菪碱诱导的模型侧脑室注射链脲菌素诱侧脑室注射链脲菌素诱导导模型模型 化学化学高脂饮食诱导模高脂饮食诱导模型型硫胺素缺乏诱导硫胺素缺乏诱导模型模型饮食饮食物理物理 剥夺动物供氧的模型剥夺
8、动物供氧的模型 AA注射诱导模型注射诱导模型 脑内脑内AA代谢产物的沉积是代谢产物的沉积是 AD AD 发病机制中最重要的一点。发病机制中最重要的一点。AA的的沉积可引起神经元的局灶性坏死、神经元缺失和神经胶质细胞增生，沉积可引起神经元的局灶性坏死、神经元缺失和神经胶质细胞增生，最终引起相应的胆碱能神经元功能的丧失和学习记忆减退的损害。最终引起相应的胆碱能神经元功能的丧失和学习记忆减退的损害。造模方法：大多数是通过注射造模方法：大多数是通过注射AA到实验动物海马区来实现，剂量到实验动物海马区来实现，剂量范围在范围在510g510g 之间，体积多为之间，体积多为5L5L。方法有单侧海马内注射、双
9、。方法有单侧海马内注射、双侧海马内注射等，注射后应留针侧海马内注射等，注射后应留针 10 min10 min，以保证溶液充分弥散。，以保证溶液充分弥散。此模型的优点：动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发生的，此模型的优点：动物脑内的神经递质及形态学改变是自然发生的，与与 ADAD 真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、干预。真实的病理生理改变更为接近，不需要人为损伤、干预。缺点：只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺乏缺点：只是模拟了部分与人类正常衰老相关的神经改变，缺乏 AD AD 相关相关 AA沉积及沉积及 NFTNFT，并不能全面模拟并不能全面模拟 ADAD 的变化。且动
10、物饲养周期的变化。且动物饲养周期和实验周期长、病死率高。和实验周期长、病死率高。东莨菪碱诱导的模型东莨菪碱诱导的模型 乙酰胆碱乙酰胆碱（acetylcholineacetylcholine，AChACh）是一种重要的中枢神经递质，是一种重要的中枢神经递质，在学习、记忆方面起着非常重要的作用。在学习、记忆方面起着非常重要的作用。ADAD患者基底前脑胆碱能患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的合成、神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的合成、Ch ATCh AT的活性及的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降。这些变化的程度与患者认知功能损对胆碱的摄取能力都明显下降。这些变化的程度与患
11、者认知功能损害的程度呈正相关。害的程度呈正相关。造模方法：东莨菪碱为造模方法：东莨菪碱为M M胆碱受体阻断剂，胆碱受体阻断剂，3mgkg-13mgkg-1东莨菪东莨菪碱腹腔注射碱腹腔注射60d60d，可阻断小鼠大脑皮层中乙酰胆碱受体的结合，可阻断小鼠大脑皮层中乙酰胆碱受体的结合位点，小鼠出现胆碱能神经系统障碍的一系列行为学改变，如位点，小鼠出现胆碱能神经系统障碍的一系列行为学改变，如记忆力下降、认知障碍等。记忆力下降、认知障碍等。此模型的优点：简便易行、不需手术、费用较低，是应用广此模型的优点：简便易行、不需手术、费用较低，是应用广泛的泛的 AD 模型建立方法之一，主要用于考察胆碱能系统与模型
12、建立方法之一，主要用于考察胆碱能系统与 AD AD 的关系及相关药物临床前评价。的关系及相关药物临床前评价。缺点：只模拟了胆碱能功能减退的特征，缺乏缺点：只模拟了胆碱能功能减退的特征，缺乏 ADAD 典型病理典型病理特征，如神经元变性、特征，如神经元变性、AA沉积等。沉积等。侧脑室注射链脲菌素诱导模型侧脑室注射链脲菌素诱导模型 链脲菌素（链脲菌素（streptozotocin，STZ）是一种烷基化物，腹腔注射）是一种烷基化物，腹腔注射可通过破坏胰腺可通过破坏胰腺细胞引起糖尿病。细胞引起糖尿病。1998年年 Lannert和他的同事首和他的同事首次建立侧脑室注射次建立侧脑室注射 STZ 动物模型
13、，动物出现类似动物模型，动物出现类似 AD 的记忆障碍。的记忆障碍。方法：将大鼠固定于脑立体定位仪上，在前卤后方法：将大鼠固定于脑立体定位仪上，在前卤后 1.5 mm，矢状，矢状缝侧方缝侧方 1.5 mm处钻孔，微量进样器注射处钻孔，微量进样器注射 STZ 3 mgkg-1，于手术，于手术的第的第 1天和第天和第 3 天分别二次向侧脑室注射。小剂量天分别二次向侧脑室注射。小剂量 STZ 侧脑室注侧脑室注射可以制备痴呆模型。射可以制备痴呆模型。此模型优点：模拟了散发性老年痴呆病的许多重要的特点。此模型优点：模拟了散发性老年痴呆病的许多重要的特点。缺点：造模过程中动物的死亡率较高。缺点：造模过程中
14、动物的死亡率较高。冈田酸诱导的损伤模型冈田酸诱导的损伤模型 tau tau 蛋白过度磷酸化是引起蛋白过度磷酸化是引起ADAD病理改变的重要机制。调节病理改变的重要机制。调节tautau去磷酸去磷酸化的蛋白磷酸酶主要有蛋白磷酸酶化的蛋白磷酸酶主要有蛋白磷酸酶-2A-2A（PP2APP2A）、）、PP2BPP2B、PP2C PP2C 和和PP1PP1冈冈田酸（田酸（OAOA）是一种海洋生物提取物，对）是一种海洋生物提取物，对 PP2APP2A和和 PP1 PP1 有有 选选 择择 性性 抑抑 制制 作作 用。用。方法：大鼠侧脑室注射方法：大鼠侧脑室注射OA0.4mmolL1OA0.4mmolL1，
15、1.5 L1.5 L，可引起神经细胞，可引起神经细胞的变性、坏死，同时促进脑内异常磷酸化的变性、坏死，同时促进脑内异常磷酸化tautau蛋白的形成，还能造成蛋白的形成，还能造成 AA聚积，产生类似聚积，产生类似 AD AD 样病理特征。样病理特征。兴奋性毒素损伤模型兴奋性毒素损伤模型 在在ADAD患者中，兴奋性毒素过度刺激谷氨酸受体导致神经元死亡。患者中，兴奋性毒素过度刺激谷氨酸受体导致神经元死亡。造模方法：将溶于人工脑脊液的造模方法：将溶于人工脑脊液的IBOIBO注入大鼠注入大鼠MeynertMeynert基底核基底核（nucleus basalis of meynertnucleus ba
16、salis of meynert，NBMNBM），每只），每只 10 g10 g，通过损毁大鼠单侧，通过损毁大鼠单侧NBMNBM来建立来建立ADAD模型，动物表现出明显的学习记忆障碍。模型，动物表现出明显的学习记忆障碍。秋水仙碱诱导秋水仙碱诱导模型模型 秋水仙碱可选择性破坏海马神经元，破坏胆碱能神经通路，使动物秋水仙碱可选择性破坏海马神经元，破坏胆碱能神经通路，使动物出现短期学习记忆障碍。出现短期学习记忆障碍。方法：侧脑室注射秋水仙碱（大鼠方法：侧脑室注射秋水仙碱（大鼠 15g15g、小鼠、小鼠2.8g2.8g）可导致动物）可导致动物在在2 2 周后出现明显的学习记忆障碍。周后出现明显的学习记
17、忆障碍。重金属诱导模型重金属诱导模型 AD AD脑组织内铝的含量明显高于正常人，高浓度铝对神经系统有毒脑组织内铝的含量明显高于正常人，高浓度铝对神经系统有毒害作用，促进大脑内害作用，促进大脑内 NFT NFT 和和 AA聚集，使神经元变性或死亡，表现为聚集，使神经元变性或死亡，表现为大脑皮质萎缩，出现记忆，认知功能障碍。大脑皮质萎缩，出现记忆，认知功能障碍。方法：利用这一机制，小鼠侧脑室注射方法：利用这一机制，小鼠侧脑室注射0.5%Al Cl3 2 L0.5%Al Cl3 2 L，每天，每天 1 1 次，次，连续连续 5 d5 d，末次注射，末次注射 15 d 15 d 后，小鼠表现出明显的空
18、间学习障碍。此外后，小鼠表现出明显的空间学习障碍。此外小鼠连续腹腔注射小鼠连续腹腔注射 Al Cl3 100 mgkg-1Al Cl3 100 mgkg-1，周期，周期 50 d50 d，隔日，隔日 1 1 次，也可次，也可造成记忆损伤模型。造成记忆损伤模型。叠氮钠诱导模型叠氮钠诱导模型 有研究表明，有研究表明，AD AD 患者线粒体功能存在明显异常。叠氮钠（患者线粒体功能存在明显异常。叠氮钠（Na N3Na N3）通过抑制线粒体呼吸链，产生自由基，抑制能量代谢，造成线粒体损伤，通过抑制线粒体呼吸链，产生自由基，抑制能量代谢，造成线粒体损伤，导导 致致 一一 系系 列列 类类 似似 AD AD
19、 的病的病 理理 改改 变。变。方法：大鼠皮下长期给予方法：大鼠皮下长期给予Na N33mgkg-1Na N33mgkg-1，2h2h皮下间断注射，每天皮下间断注射，每天8 8次，连续注射次，连续注射4 4周，可诱导周，可诱导AA沉积，出现类似沉积，出现类似ADAD的认知障碍。的认知障碍。谷氨酸损伤模谷氨酸损伤模型型 过量的谷氨酸可产生严重的神经兴奋毒性，造成神经元损伤或死亡，过量的谷氨酸可产生严重的神经兴奋毒性，造成神经元损伤或死亡，与与AD AD 的发生、发展有密切的关系。的发生、发展有密切的关系。方法：利用新生乳鼠血脑屏障功能不全，外周注射谷氨酸方法：利用新生乳鼠血脑屏障功能不全，外周注
20、射谷氨酸25mgkg-125mgkg-1，40d 40d 后小鼠肥胖，基底前脑多处神经元变性，脑内后小鼠肥胖，基底前脑多处神经元变性，脑内 APP APP 免疫阳性改变，免疫阳性改变，细胞间隙的细胞间隙的 AA大量沉积。大量沉积。慢性缺氧动物模型慢性缺氧动物模型 ADAD 模型研究发现模型研究发现 AD AD 患者处于长期慢性缺氧的状态。通过剥夺啮患者处于长期慢性缺氧的状态。通过剥夺啮齿类动物的供氧，可诱导与老化脑功能相似的能量代谢障碍。齿类动物的供氧，可诱导与老化脑功能相似的能量代谢障碍。方法：研究提示动物经由双侧颈总动脉结扎致全脑缺血方法：研究提示动物经由双侧颈总动脉结扎致全脑缺血12 m
21、in12 min，后复灌后复灌24 h24 h，会引起行为学上的障碍，并且脑组织出现与，会引起行为学上的障碍，并且脑组织出现与ADAD患者相患者相似的病理特征。似的病理特征。该模型的缺点：可以模拟该模型的缺点：可以模拟ADAD的临床症状，但缺乏的临床症状，但缺乏ADAD特异性胆碱神特异性胆碱神经损伤以及经损伤以及AA沉积。且由于创伤较大，不相关的干扰因素过多，易沉积。且由于创伤较大，不相关的干扰因素过多，易引起脑内其他部位的损伤及造模动物的死亡。因此，该模型成功率引起脑内其他部位的损伤及造模动物的死亡。因此，该模型成功率低，现在已很少使用。低，现在已很少使用。高脂饮食诱导模型高脂饮食诱导模型
22、有报道指出动物给予高脂饲料饲养可降低大脑对葡萄糖的摄取，诱导动物模有报道指出动物给予高脂饲料饲养可降低大脑对葡萄糖的摄取，诱导动物模型产生糖耐量降低及胰岛素抵抗，亦可损伤神经元胰岛素受体功能，引起型产生糖耐量降低及胰岛素抵抗，亦可损伤神经元胰岛素受体功能，引起tau 蛋白过度磷酸化，从而导致蛋白过度磷酸化，从而导致 NFT。方法：大鼠给予高脂饮食方法：大鼠给予高脂饮食 2 个月后，即出现胰岛素抵抗，表现出明显的空间个月后，即出现胰岛素抵抗，表现出明显的空间学习记忆障碍。学习记忆障碍。该模型可以模拟该模型可以模拟 AD 的一些病理特征，例如认知障碍及的一些病理特征，例如认知障碍及 tau 蛋白过
23、度磷酸化，蛋白过度磷酸化，主要的缺点是造模时间较长。主要的缺点是造模时间较长。硫胺素硫胺素缺乏（缺乏（thiamine deficiency，TD）诱导的能量代谢下降、糖代谢异常、）诱导的能量代谢下降、糖代谢异常、氧化应激损伤、胶质细胞激活、选择性神经元丢失以及认知功能损害，与氧化应激损伤、胶质细胞激活、选择性神经元丢失以及认知功能损害，与 AD 的病理生理过程极为相似。的病理生理过程极为相似。方法方法：8周周龄龄C57C57小小鼠，通过给予硫胺素剥夺饮食结合腹腔注射硫胺素焦磷酸鼠，通过给予硫胺素剥夺饮食结合腹腔注射硫胺素焦磷酸激酶抑制剂激酶抑制剂吡啶硫胺制作硫胺素缺乏模型，造吡啶硫胺制作硫胺
24、素缺乏模型，造模模13d13d后后取脑，模型组小鼠内侧取脑，模型组小鼠内侧丘脑出现典型的对称性针尖样出血，小鼠皮质、海马及丘脑均丘脑出现典型的对称性针尖样出血，小鼠皮质、海马及丘脑均出现出现AA沉积，沉积，tautau蛋白蛋白磷酸化。磷酸化。TDTD可引起可引起AA沉积、沉积、tautau蛋白蛋白磷酸化增加等磷酸化增加等 ADAD的的特征性病理改变。特征性病理改变。硫胺素缺乏诱导模型硫胺素缺乏诱导模型转基因模型是研究转基因模型是研究 AD AD 发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的热点。热点。APP APP 转基因
25、模型转基因模型 APP APP正常情况下代谢多经过正常情况下代谢多经过-分泌酶和分泌酶和-分分泌酶。基因突变时，激活了泌酶。基因突变时，激活了-分泌酶和分泌酶和-分泌酶，分泌酶，导致导致AA增多，尤其是增多，尤其是A42A42。AA聚集可形成具有聚集可形成具有神经毒性的原纤维，进而形成神经毒性的原纤维，进而形成SPSP，加重，加重ADAD的发展。的发展。方法：将突变方法：将突变APPAPP基因基因（Val717-PheVal717-Phe）与血小板与血小板衍生因子衍生因子（platelet derived growth factorplatelet derived growth factor，
26、PDGFPDGF）相结合形成相结合形成PDAPPPDAPP基因，导入到小鼠体内，基因，导入到小鼠体内，获得获得PDAPPPDAPP小鼠。小鼠。位于位于1212号染色体上的早老素号染色体上的早老素1(PS1)1(PS1)基因，基因，及及位于位于1 1号号染色体上的早老染色体上的早老素素 2(PS2)2(PS2)基因发基因发生突变与家族生突变与家族性性ADAD发病发病有着密切关系。有着密切关系。PS1M146VPS1M146V小鼠是比较典型的小鼠是比较典型的转转PS1PS1基因基因动物。动物。CatadoCatado等利用等利用血小板源性生长因子血小板源性生长因子22启动启动子子促进神经元的表达，
27、构建了几种过度表达突变促进神经元的表达，构建了几种过度表达突变型型 PS1 PS1 的转基因鼠，发现可导致选择性增加的转基因鼠，发现可导致选择性增加 A42A42。PS1 PS1 转基因模型转基因模型 优点优点：APP APP 转基因小鼠转基因小鼠及及APP/PS-1APP/PS-1双双转基因小鼠是目前国际最为认可转基因小鼠是目前国际最为认可的的ADAD动物动物模型，其病理变化出现较早且明显，模拟了模型，其病理变化出现较早且明显，模拟了 AD AD 患者脑内的患者脑内的 AA增多、增多、SP SP 形成形成。缺点缺点：模型小鼠脑内产生的：模型小鼠脑内产生的 AA与与 AD AD 患者脑内的患者
28、脑内的 AA存在生化组成存在生化组成的差别，并且这些小鼠脑内没有发的差别，并且这些小鼠脑内没有发tau tau 蛋白磷酸化及蛋白磷酸化及 NFTNFT，也没有表现出，也没有表现出 AD AD 患者特有的海马及皮层神经元丢失。这也是多数转基因小鼠模型的患者特有的海马及皮层神经元丢失。这也是多数转基因小鼠模型的缺陷。缺陷。转基因模型是研究转基因模型是研究 AD AD 发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的发病机制及相关药物研发的较理想工具，同时也成为了近年研究的热点。热点。神经元纤维缠结、神经元纤维缠结、tau tau 相关模型相关模型 AD AD 患者大脑皮质及海马区出现患者
29、大脑皮质及海马区出现NFTNFT的主要原因是的主要原因是tautau蛋白的过度磷酸蛋白的过度磷酸化。因此认为化。因此认为tautau基因突变将直接影响基因突变将直接影响tautau蛋白的结构和功能，引发神经系蛋白的结构和功能，引发神经系统疾病，可能是诱发统疾病，可能是诱发 AD AD 的因素之一的因素之一。JNPL3JNPL3小鼠是将人类小鼠是将人类FTDP-17FTDP-17突突变变tautau基因导入基因导入B6D2B6D2（F1F1）小鼠，然后将其小鼠，然后将其下一代小鼠与下一代小鼠与 C57BL/6C57BL/6回交而获得。回交而获得。AD AD 的发病过程复杂，与脑内多种基因调控失调
30、有着密切联系，多的发病过程复杂，与脑内多种基因调控失调有着密切联系，多种转基因组合方法可以非常成功模拟种转基因组合方法可以非常成功模拟AD AD 病理变化和行为学改变特征，是病理变化和行为学改变特征，是较为理想的较为理想的 AD AD 动物模型。动物模型。双转基因小鼠双转基因小鼠Tg2576/tau P301LTg2576/tau P301L小鼠是由小鼠是由 Tg2576 Tg2576 小鼠和小鼠和tau tau P301LP301L（JNPL3JNPL3）小鼠杂交而来，其行为学的发病方式及出现时间和）小鼠杂交而来，其行为学的发病方式及出现时间和JNPL3 JNPL3 相似，相似，AA的沉积同
31、的沉积同 Tg2576Tg2576小与表达人基因组小与表达人基因组MAPT MAPT 基因的小鼠杂交获得。基因的小鼠杂交获得。此模型已经成为研究此模型已经成为研究 NFT NFT 病理特征及相关病理特征及相关tau tau 蛋白生化的有力蛋白生化的有力工具。工具。多重转基因模型多重转基因模型 转基因果蝇模型转基因果蝇模型 研究表明，在已知的人类疾病致病基因中，果蝇具有约研究表明，在已知的人类疾病致病基因中，果蝇具有约75%75%的同源基因，的同源基因，包括包括ADAD所涉及所涉及的的 ApplAppl，Pen-2Pen-2，NicastrinNicastrin，tautau以及以及GSK-3G
32、SK-3等基因。等基因。除了具除了具有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病有大量的同源基因外，果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型，如迟发性、进程性和神经系统的高毒性。因此，果还有许多相似的表型，如迟发性、进程性和神经系统的高毒性。因此，果蝇为研究蝇为研究 ADAD 发病机制以及进行治疗药物的筛选和验证提供了另一种模式发病机制以及进行治疗药物的筛选和验证提供了另一种模式生物方法。生物方法。常用的转基因果蝇模型主要有常用的转基因果蝇模型主要有APPAPP转基因模型、转基因模型、BACEBACE转基因模型、转基因模型、AA转基因模型、转基因模型、
33、tautau蛋白转基因模型、双重或多重转基因模型等。蛋白转基因模型、双重或多重转基因模型等。优点：果蝇因其基因背景清晰、生命周期短暂、与年龄相关的神经元退优点：果蝇因其基因背景清晰、生命周期短暂、与年龄相关的神经元退化明显、繁殖迅速以及易于培养观察等特点在化明显、繁殖迅速以及易于培养观察等特点在 AD 模型中具有独特优势。模型中具有独特优势。另一方面，可以用果蝇模型直接对已有的大量药物进行筛选，以期获得改另一方面，可以用果蝇模型直接对已有的大量药物进行筛选，以期获得改善疾病症状的药物，加快哺乳动物乃至人类的药物实验。善疾病症状的药物，加快哺乳动物乃至人类的药物实验。缺点：是其肠胃酸碱度以及吸收
34、食物的途径与哺乳动物差别较大。缺点：是其肠胃酸碱度以及吸收食物的途径与哺乳动物差别较大。ADAD动物模型学习动物模型学习评价评价02 上上述述 AD AD 动物模型各有其优缺点，动物模型各有其优缺点，多数仅能部分模拟多数仅能部分模拟 AD AD 的病理学特征及的病理学特征及临床症状，尚无一种公认最理想的模型。临床症状，尚无一种公认最理想的模型。即使是目前最为广泛使用并认可的多重即使是目前最为广泛使用并认可的多重转基因动物，也有待于进一步完善转基因动物，也有待于进一步完善。理想理想的的 AD AD 动物模型应具备以下动物模型应具备以下 3 3 个个方面的特征方面的特征：l 具有具有 AD AD
35、的主要神经病理学特征的主要神经病理学特征SP SP 和和NFTNFT；l 出现出现大脑神经元死亡、突触丢失和反大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质应性胶质细胞增生细胞增生等等 AD AD 的重要病理的重要病理变化变化；l 出现出现认知和记忆能障碍认知和记忆能障碍。ADAD模型大鼠的研究模型大鼠的研究方案方案03增殖细胞标增殖细胞标记记动物处理动物处理检测指标检测指标 研究目标、研研究目标、研究内容究内容动物模型制备、分动物模型制备、分组给药组给药干预措施干预措施 0102030605041 1 2 2明确毛冬青甲素影响阿尔茨海默大鼠脑海马组织神明确毛冬青甲素影响阿尔茨海默大鼠脑海马组织神经元再
36、生的作用。经元再生的作用。从从BDNFBDNF表达水平的影响揭示毛冬青甲素促进神经元表达水平的影响揭示毛冬青甲素促进神经元再生的作用机制，为中医药防治阿尔茨海默病提供再生的作用机制，为中医药防治阿尔茨海默病提供实验依据和作用靶点实验依据和作用靶点。1 1 2 2检测毛冬青甲素对阿尔检测毛冬青甲素对阿尔茨海默模型大鼠海马神茨海默模型大鼠海马神经元再生的影响，通过经元再生的影响，通过A海马注射大鼠模型，海马注射大鼠模型，采用尼式染色法观察、采用尼式染色法观察、BrduBrdu标记增殖细胞，用标记增殖细胞，用Image Pro Plus 6.0Image Pro Plus 6.0图图像处理系统进行细
37、胞计像处理系统进行细胞计数。数。检测毛冬青甲素对阿尔茨海检测毛冬青甲素对阿尔茨海默 模 型 大 鼠 海 马 神 经 元默 模 型 大 鼠 海 马 神 经 元BDNF水平的影响，采用免水平的影响，采用免疫组化法检测海马组织中疫组化法检测海马组织中BDNFBDNF的表达，采用分子探针的表达，采用分子探针检测检测BDNF mRNABDNF mRNA的表达情况。的表达情况。药物药物毛冬青甲素毛冬青甲素 购于广东省博罗先锋药业集购于广东省博罗先锋药业集团有限公司团有限公司实验动物实验动物SDSD大鼠大鼠3636只，清洁级，只，清洁级，180-220g180-220g，雌雄各半，雌雄各半。湖南中医药大学。
38、湖南中医药大学SPFSPF级动物实级动物实验中心提供验中心提供 大大鼠适应性喂养一周后，参考相关文献选择鼠适应性喂养一周后，参考相关文献选择 AA海马注射大鼠模型，海马注射大鼠模型，将将SDSD大鼠用大鼠用 10%10%水合氯醛按水合氯醛按4 m Lkg-14 m Lkg-1的剂量行腹膜麻醉后，固定于脑的剂量行腹膜麻醉后，固定于脑立体定位仪上，备皮，消毒，沿颅顶中线做立体定位仪上，备皮，消毒，沿颅顶中线做1-2cm1-2cm切口，分离骨膜，找到切口，分离骨膜，找到前囱位置，参照前囱位置，参照大鼠脑立体定位图谱大鼠脑立体定位图谱，确定前囟后，确定前囟后3.0 mm3.0 mm，中线旁，中线旁2.
39、0 mm2.0 mm为海马为海马CA1CA1所在部位体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，微量注所在部位体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，微量注射器固定于立体定位仪上，自脑表面垂直进针约射器固定于立体定位仪上，自脑表面垂直进针约2.8mm2.8mm，假手术组脑内注，假手术组脑内注射等体积的生理盐水；其余各组两侧海马各缓慢均匀注入射等体积的生理盐水；其余各组两侧海马各缓慢均匀注入1lA25-351lA25-35，5 min5 min注射完毕，留针注射完毕，留针5min5min，然后缓慢撤针，缝合皮肤并涂红霉素软膏，然后缓慢撤针，缝合皮肤并涂红霉素软膏，肌注青霉素，预防感染。清醒后放回笼中常规饲养。肌
40、注青霉素，预防感染。清醒后放回笼中常规饲养。动物造模动物造模模型评价模型评价在造模第在造模第2020天，对所有大鼠称重，并进行蔗糖水消耗实验和天，对所有大鼠称重，并进行蔗糖水消耗实验和MorrsiMorrsi水迷宫实水迷宫实验，验，最后根据实验结果评定大鼠是否造模成功。最后根据实验结果评定大鼠是否造模成功。动物分组动物分组对造模成功的大鼠随机分成对造模成功的大鼠随机分成3 3组，每组组，每组1212只，分别为假手术组、模型组、毛只，分别为假手术组、模型组、毛冬青甲素组。冬青甲素组。010203 于造模后第于造模后第3d3d起开起开始用药，毛冬青甲素始用药，毛冬青甲素组 舌 下 静 脉 注 射组
41、 舌 下 静 脉 注 射30mg30mgkgdkgd-1-1，每天两次，连续给药每天两次，连续给药4 4周。周。毛冬青组毛冬青组无干预措施无干预措施假手术组假手术组模型组模型组无干预措施无干预措施增殖细胞标记增殖细胞标记 给药给药2525天后，每组取天后，每组取6 6只，雌雄各半，将只，雌雄各半，将BrduBrdu按照按照50mg/kg 50mg/kg 的剂量，的剂量，10mg/ml 10mg/ml 浓度溶于生理盐水，腹腔注射浓度溶于生理盐水，腹腔注射2 2次次/天，每次间隔天，每次间隔2h2h，其中最后一次，其中最后一次在处死前在处死前24h24h注射。注射。动物处理动物处理 在给药后的第在
42、给药后的第2828天，将大鼠用天，将大鼠用10%10%水合氯醛按水合氯醛按4mLkg-14mLkg-1的剂量腹膜的剂量腹膜麻醉。麻醉成功后，取仰卧位固定四肢。剖开胸腹充分暴露心脏与肝脏，麻醉。麻醉成功后，取仰卧位固定四肢。剖开胸腹充分暴露心脏与肝脏，剪开左侧心尖部，剪开右心耳，插导管于左心室并固定，穿刺针经左心室剪开左侧心尖部，剪开右心耳，插导管于左心室并固定，穿刺针经左心室穿刺至升主动脉，快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出完全清穿刺至升主动脉，快速灌注生理盐水至肝脏完全变白，右心耳流出完全清亮液体后，予亮液体后，予4%4%的多聚甲醛液灌注的多聚甲醛液灌注先快后慢先快后慢，见大鼠尾巴、
43、四肢僵硬，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意。然后将注射了视为满意。然后将注射了BrduBrdu的大鼠开颅完整取出鼠脑，保留海马部位，的大鼠开颅完整取出鼠脑，保留海马部位，切去多余部分，经后固定切去多余部分，经后固定 48 h48 h后常规石蜡包埋。其余大鼠断头取脑，取出后常规石蜡包埋。其余大鼠断头取脑，取出海马组织，投入液氮保存。海马组织，投入液氮保存。海马组织细胞形态结海马组织细胞形态结构观察构观察采用采用NisslNissl染色法进行观察染色法进行观察海马增殖细胞检测海马增殖细胞检测免疫组织化学检测免疫组织化学检测BrduBrdu标记的增殖细胞标记的增殖细胞采用免疫组化法检测海马组织中采用免疫组化法检测海马组织中BDNFBDNF的表达，采用分子探针检测的表达，采用分子探针检测BDNF BDNF mRNAmRNA的表达情况。的表达情况。脑源性神经营养因子的脑源性神经营养因子的检测检测THANKS FOR THANKS FOR WATCHING!WATCHING!谢谢 谢谢 观观 看看
