1、 第二章第二章 菌种选育菌种选育 本章主要内容v第一节第一节 菌种的分离筛选菌种的分离筛选v第二节第二节 菌种选育菌种选育v第三节第三节 生产菌种的扩大培养生产菌种的扩大培养v第四节第四节 菌种的保藏与复壮菌种的保藏与复壮第一节第一节 菌种的分离筛选菌种的分离筛选 一、菌种的来源一、菌种的来源v根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、分离思路二、分离思路 v新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。v实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离
2、纯化。v有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。v定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。v采样：采样：有针对性地采集样品。v增殖：增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。v分离筛选：分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。v发酵性能测定：发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤（一）采样一）采样1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田
3、土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选v2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。v3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采取土壤样品要考虑的几个问题采取土壤样品要考虑的几个问题v土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植
4、物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。v离地面520cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。v采土季节以春秋两季最好。v采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。v多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（二）增殖培养（二）增殖培养v含有目的菌较多的土样不需要富集培养v如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。v富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种
5、在群体中比例上升的目的。v 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。v一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。某些细菌的富集条件某些细菌的富集条件 富集对象 接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒 好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒 厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6 厌氧八叠球菌土壤 葡萄糖20厌
6、氧，pH23 乳酸菌植物体或牛奶 葡萄糖20厌氧，pH6.5 肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0 丙酸菌干酪 乳酸钠20厌氧，pH7.0 醋酸菌果实或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水1000ml。一般培养在30下。（三）培养分离（三）培养分离v 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。稀释分离法稀释分离法 稀
7、释倒稀释倒 平板法平板法 平板平板 涂布法涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。划线分离法划线分离法平板划线法平板划线法（四）筛（四）筛 选选1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程。筛选出来的过程。常用的初选方法：常用的初选方法：水解酶产生菌的筛选：水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。酶产生菌。一般采用平板筛选。一般采用
8、平板筛选。拮抗菌的筛选拮抗菌的筛选对峙培养：对峙培养：将病原指示菌与待测菌株将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。况筛选出拮抗性菌株。分初筛、复筛。分初筛、复筛。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。发酵滤液进行活力测定。2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。生产能力强弱的过程。复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法复筛采用摇瓶培养后，
9、发酵液采用精确的分析方法 进行测定。进行测定。复筛过程中，要结合培养条件进行。复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基培养条件包括：培养基 pH值值 发酵温度发酵温度 供氧量等。供氧量等。（五）菌种鉴定（五）菌种鉴定v 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。征、血清学试验等。v现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值分析。分、计算机数值分析。（五）毒性试验（五）毒性试验v 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。
10、据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节第二节 菌种选育菌种选育v菌种选育菌种选育是一门应用科学技术应用科学技术，其理论基础理论基础是微生物遗传学、生物化学遗传学、生物化学等，而其研究目的目的是微生物产品的高产优质高产优质和发展新品种新品种为生产不断地提供优良提供优良菌种菌种，从而促进生产发展。v 目前菌种选育常采用自然选育自然选育和和诱变育种诱变育种等方法，带有一定的盲目性盲目性，尚属于经典育种经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转化、转导、原生质体融合、代谢
11、调控和基因工程转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法定向的育种方法。2.1 自然选育自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变自然突变而进行菌种筛选菌种筛选的过程叫做自然选育自然选育。所谓自然突变自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因两个原因：即多因素低多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应剂量的诱变效应和互变异构效应。菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退,生产性能下降;代谢更加旺盛,生产性能提高。v所谓多因素低剂量的诱变效应多因素低剂量的诱变效应，是指自然突自然突变实质上变实质上是由一些原因不详的低剂量诱
12、变因低剂量诱变因素素引起的长期综合效应。v所谓互变异构效应互变异构效应是指四种碱基的第六位第六位上的酮基和氨基酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式酮式和氨基式。碱基对发生自然突变的机率约为机率约为108一一109。PurinespyrimidinesAdenine(A)Guanine(G)Cytosine(C)Thymine(T)N9N12.2诱变育种诱变育种2.2.l 诱变育种的基本原理诱变育种的基本原理诱变育种的理论基础是理论基础是基因突变基因突变，所谓突变突
13、变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变染色体畸变和和基因突变基因突变二大类。（1）染色体畸变染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易缺失、易位、逆位、重复位、逆位、重复等。（2）基因突变基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变点突变）。根据突变发生的原因又可分为自然突变自然突变和和诱发突变诱发突变。诱发突变诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类物理的、化学的和生物的三大类，见表表21。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA的化学结构化学结构发生改变，从而引
14、起微生物的遗传变异遗传变异。2.2.2 诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤 1、出发菌株的选择v自然界直接分离到的野生型菌株v经历过生产条件考验的菌株v已经历多次育种处理的菌株2、制备菌悬液v待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件；v尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免表型延迟。v表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。3、诱变处理v根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处理剂量。v一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，突变率会下降。4、突变菌株的筛选（1）营养缺陷型突变株的筛选v 生物合成途径的
15、某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。（2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选v 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不再起反馈阻遏作用；v编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。v抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。v营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。（3）组成型突变株的筛选v分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖v交替培养法（4）抗性突变株的筛选v抗生素抗性突变v抗噬菌体菌株的选育v条件
16、抗性突变v敏感突变2.2.3 诱变育种工作中几个应注意的问题诱变育种工作中几个应注意的问题A 选择好出发菌株选择好出发菌株选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出作出发菌株则不适宜发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生产量、形态、生理理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大对诱变剂的敏感性大、变异幅度广变异幅度广，再确定诱再确定诱变剂的使用及筛选条件变剂的使用及筛选条件。B 复合诱变因素的使用复合诱变因素的使用在微生物诱变育
17、种诱变育种中，可利用各种物理、化学物理、化学诱变因素诱变因素来处理菌种。对野生型菌株野生型菌株单诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素复合因素来扩大诱变幅度诱变幅度，提高诱变效果诱变效果。C 剂量选择剂量选择各种诱变因素诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如紫外线剂量单位用焦耳，紫外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑）一射线剂量单位是库（仑）每千克，中子剂量单位是戈。每千克，中子剂量单位是戈。化学诱变因素一般是以溶液浓度溶液浓度来计算剂量单位的。对不同微生物使用的剂量是不同的，致死率取决于诱变剂量，而致死率和变异率致死率和变异率之间
18、有一定关系。因此因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。D 变异菌株的筛选变异菌株的筛选诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌高产变异菌株。株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容易的事。因为不同的菌种表现的变异形式变异形式是不同的，从一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性产量有关的特性，并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型菌株进行发酵和鉴定发酵和鉴定，以确定各种类型与产量类型与产量之间的之间的关系关系。这样，可大大提高筛选的工作效率工作效率。E 高产菌株的获得需要筛选条件的配合高产菌株的获得需要筛选条件的配合在诱变育种过程中高产菌株的
19、获得还必须有合适的筛选筛选条件的配合。条件的配合。诱变与筛选诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须用辩证的观点来看待。总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系和筛选条件三者的关系。2.2.4 几种常见的物理、化学诱变剂的使用方法几种常见的物理、化学诱变剂的使用方法1）物理诱变剂：紫外线、）物理诱变剂：紫外线、X射线、射线、射线，快中子；射线，快中子；电离辐射特点：电离辐射特点：导致导致DNA断裂缺失，造成不可回复断裂缺失，造成不可回复 的缺失突变。诱变效率高，但它可能的缺失突变。诱变效率高，但它可能 影响邻近基因的性能。影响邻近基因的性能。紫
20、外线是常用的诱变剂。紫外线是常用的诱变剂。2）化学诱变剂：碱基类似物（）化学诱变剂：碱基类似物（5-BU）、脱氨剂（羟胺、）、脱氨剂（羟胺、亚硝酸）、亚硝酸）、嵌入剂（吖啶类）等。嵌入剂（吖啶类）等。特点：特点：碱基类似物：取代相应碱基进入碱基类似物：取代相应碱基进入DNA链，具有链，具有 很高的特异性，但回复突变率高，很少使用。很高的特异性，但回复突变率高，很少使用。脱氨剂：碱基脱氨或脱氮，引起碱基对转换，脱氨剂：碱基脱氨或脱氮，引起碱基对转换，造成的遗传损伤较多。应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。应用的范围较广，嵌入剂：引起移码突变。可以造成生化代谢途径嵌入剂：引起移码突变。可以造成生化
21、代谢途径 完全中断。完全中断。5BU 酮式酮式T 烯醇式烯醇式CA：TBU(酮酮)：AT：AA：TG):BU(烯烯BU(酮酮)：AC：GA：TC：GT：T：AX：U：AHNO2XG：CA：TT：A2.3 杂交育种杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法诱变育种方法。但是，一个菌种长长期使用诱变剂处理之后期使用诱变剂处理之后，其生活能力生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长，生长周期延长，孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性降低降低等。因此，有必要利用杂交育种方法杂交育种方法。杂交育种杂
22、交育种是指将两个基因基因型不同的菌株经吻合（或接合）吻合（或接合）使遗传物质重遗传物质重新组合新组合，从中分离和筛选分离和筛选具有新性状的菌株。1、杂交育种的目的杂交育种的目的在于：1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体重组体）；2）可以通过杂交把不同菌株不同菌株的优良生产性能集中于重组体中优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷菌株生活力下降等缺陷；3）通过杂交）通过杂交，可以扩大变异范围扩大变异范围，改变产品的质量和产量改变产品的质量和产量，甚至出现新的
23、品种新的品种；4）分析杂交结果）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学促进遗传学理论的发展理论的发展。微生物杂交育种杂交育种所使用的配对菌株配对菌株称为直接亲本直接亲本。由于多数微生物尚未多数微生物尚未发现其有性世代发现其有性世代，因此，直接亲本菌株应带有适当的遗传标记遗传标记。常用的遗传标记有颜色、营养要求和抗药性颜色、营养要求和抗药性等。营养标记菌株营养标记菌株（即营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。所谓营养缺陷型菌株营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体生化突变体。由于基因突变基因突变，它失去了合成某种物质合
24、成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力的能力，在基本培养基上不能生长基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定一定种类的有机物质种类的有机物质后才能生长才能生长。2、遗传标记2.4原生质体融合技术原生质体融合技术所谓原生质体融合原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换由接触到交换，从而实现遗传重组实现遗传重组。在再生成细胞的菌落
25、中就有可能获得具有理想性状的重组子重组子。2.4.1 原生质体融合的优越性原生质体融合的优越性从现有资料看，原生质体融合技术原生质体融合技术有以下优点优点 （l）去除了细胞壁的障碍）去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统现重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌相同接合型的真菌细胞细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进行转化转化和转染和转染。（2）原生质体融合后两亲株的基因组之间两亲株的基因组之间有机会发生多次交多次交换换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三
26、个、四个参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个，这足一般常规杂交所达不到的。（3）重组频率特别高重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。（4）可以和其他育种方法相结合可以和其他育种方法相结合，把由其它方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。（5）可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，双方，然后使之融合然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子筛选重组子。这样往往可以提高筛选效率。由于以上优点，利用原生质体融合来培育工业新菌株已受到国内外普遍重视。2.4.2 原生质体融合技术一般步骤原生质体融合技术一般步骤1、选
27、择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株；亲株带上遗传标记；测定遗传标记的稳定性。2、原生质体制备 一般采用酶解法除壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，采用不同的酶，有时还要采取一些措施，如添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性；原生质体对渗透压极其敏感，低渗易引起细胞破裂。一般将原生质体放在高渗的环境中维持它的稳定。3、原生质体融合 两亲本的原生质体在高渗条件下高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换由接触到交换，从而实现遗传重组实现遗传重组。在再生细胞的菌落中就有可能获得具有理想性
28、状的重组子重组子。4、原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构；为获得较高的再生率，在实验过程中应避免剪切力过大使原生质体破裂；涂布时，原生质体浓度不宜过高；菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。5、筛选优良性状融合重组子v原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。v融合重组子的检出方法：直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子。间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择
29、培养基上检出重组子。v筛选出来的融合重组子还需要对它们进行生理生化及生产性能的测定。第三节第三节 生产菌种的扩大培养生产菌种的扩大培养v种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。作为种子的准则v菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；v生理性状稳定；v菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；v无杂菌污染；v保持稳定的生产能力。种子扩培的目的q 接种量的需要q 菌种的驯化q 缩短发酵时间、保证生产水平3.1 种子的制备过程v种子制备的过程大致
30、可分为：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 一、实验室种子的制备v实验室种子的制备一般采用两种方式对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基或斜面（静置培养）培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧）。（一）孢子的制备1、细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37C。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。2、霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的
31、温度一般为2528C。培养时间一般为414天。3、放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天。（二）液体种子制备1、好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体（短菌丝），作为种子。试管三角瓶摇床种子罐 2、厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试管三角瓶卡式罐种子罐
32、 二、生产车间种子制备 v实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。1、种子罐的作用v主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。2、种子罐级数的确定 v种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。v种子罐级数取决于：菌种生长特性（如菌种传代后的稳定性）、孢子发芽
33、及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积另外还与发酵罐中种子培养液的最低接种量（种子液体积/培养液体积）以及种子罐与发酵罐的容积比等有关。细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 （二级发酵）。v确定种子罐级数需注意的问题种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染
34、菌机会虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。3.2 种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制v培养基v培养条件v培养时间和冷藏时间1、培养基v生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。v原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成
35、。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。v水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。v菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。v措施培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用严格控制灭菌后培养基的质量斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源2、培养条件（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一
36、般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。3、培养时间和冷藏时间（1）培养时间v一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产
37、能力的下降。v措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。（2）冷藏时间v斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。v冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。4、接种量v接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。二、影响种子质量的因素及控制v孢子的质量v培养基v培养条件v种龄v接种量1、培养基v营养成分适合种子培养的需要
38、选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高v营养成分要尽可能与发酵培养基相近。2、培养条件（1）温度（2）通气量（3）pH 3、种龄v种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。v通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。v不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。Ru 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。4、接种量v接种量的大小决
39、定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。v通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%三、种子质量的控制措施v种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查无杂菌检查四、种子质量标准1、形态v单细胞：菌体健壮、
40、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；v霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。2、生化指标v种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。3、产物生成量v在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。4、酶活力v种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。五、种子异常分析 v菌种生长速度，过快或过慢 v菌丝结团v菌丝粘壁 第四节 菌种的保藏与复壮一、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不
41、开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。菌种保藏的方法很多，一般有下面几种一般有下面几种：A 斜面冰箱保藏法（酵母）斜面冰箱保藏法
42、（酵母）斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月月到六个月。B 石蜡油封存法（酵母）石蜡油封存法（酵母）向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面高出斜面一厘米一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。保存期约一年左右。三、菌种保藏的方法C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌沙土管保藏法（细菌，霉菌
43、，防线菌）这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法制备方法是：首先，将沙与土洗净烘干过筛洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为按沙与土的比例为l2 l混合均匀混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右厘米左右，121C间歇灭菌三次间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用沙用80目过筛目过筛，土用土用30100目过筛目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为保存期为1年左右年左右。D真空冷冻干燥保藏法（真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌）真空冷冻干燥
44、保藏法真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理基本原理是在较低的温度下（15），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一般一般5年左右年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基本操作基本操作过程是先将微生物制成悬浮液制成悬浮液，再与保护剂混合与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管
45、真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用支持作用，使微生物疏松地固定在上面。E 液氮超低温保藏法（液氮超低温保藏法（细菌，真菌）细菌，真菌）液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产不产孢子的菌丝体孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法液氮保藏法。其保存
46、期最长。a 原理原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一一196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一新陈代谢作用停止的温度（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止代谢活动已停止，化学作用亦随之消失化学作用亦随之消失。b 操作方法及步骤操作方法及步骤（1）安瓿管要求安瓿管要求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料或料或GCl7的玻璃的玻璃管管，安瓿管选好后印上标记印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用加棉塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过超低温的冷冻过
47、程程。所以也需要保护剂保护剂，常用的保护剂为保护剂为10甘油甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。（3）冻结）冻结液氮法的关键关键是先把微生物从常温过渡到低温先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触接触低温前低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC采用先将菌液降温到先将菌液降温到0，再以每分钟降低每分钟降低1的速度的速度，一直一直降低到降低到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化冰晶状
48、态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加常常注意液氮的残存量，定期补加。（4）重新培养）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或室温或3540水浴中迅速解冻水浴中迅速解冻，当升温至升温至0时即可打开安瓿管时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种部分单位采用液氮法保存菌种。四、菌种的衰退与复壮 1、菌种衰退 菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。v菌种退化的原因 基因突变；变异菌株性状分离；诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成菌落由个孢子或单个细
49、胞形成，但它是多核细胞单核孢子发生突变时，双链DNA上仅条链上某个位点发生变化连续传代其它因素菌种保藏不当 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）v防止菌种退化的措施控制传代次数选择合适的培养条件选择合适的保藏方法菌种稳定性检查 分离复壮2、菌种复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。v复壮措施：对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体选择合适的培养基思考题1、名词解释多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应、染色体畸变、基因突变、表型延迟、营养缺陷型、杂交育种、原生质体融合、原生质体再生、菌种的扩培、接种量、菌种退化、菌种复壮2、采集土壤微生物样品时应该注意哪些问题？3、什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？4、土壤中分离纯化微生物的方法有哪些？请简述之。5、什么是微生物的初筛？请例举两种初筛方法，并简述之。6、菌种保藏的原理是什么？常见的军种保藏方法有哪些？7、菌种退化的原因有哪些？简述防止菌种退化的措施。8、常见的菌种复壮措施有哪些？
