酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞课件.ppt

1、酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞文档ppt固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺简化了提纯工艺(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性在绝大多数情况下提高了酶的稳定性(5)较能适应于多酶反应较能适应于多酶反应(6)酶的

2、使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低 固定化酶固定化酶 固定化酶也存在一些缺点：固定化酶也存在一些缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大使工厂开始投资大(2)比较适应水溶性底物和小分子底物比较适应水溶性底物和小分子底物(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。同时，对胞内酶需经分离后才能固定化同时，对胞内酶需经分离后才能固定化 固定化酶固定化酶酶的固定化方

3、法酶的固定化方法吸附法；共价结合法；交联法；包埋法吸附法；共价结合法；交联法；包埋法 固定化酶固定化酶吸附法吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法 物理吸附法物理吸附法:通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，制成固定化酶用，将酶固定于水不溶载体上，制成固定化酶 有机载体，纤维素、骨胶原、淀粉等 如，用纤维素作为吸附剂吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70 mg/cm2无机载体，氧化铅、高岭土、多孔硅、多孔玻璃等 如，用多孔硅为载

4、体吸附淀粉酶，在45进行固定化，用高浓度底物 进行连续反应。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落 固定化酶固定化酶(2)离子交换吸附法离子交换吸附法:将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法合而达到固定化的一种方法 酶吸附较牢，在工业上具广泛用途酶吸附较牢，在工业上具广泛用途常用载体：阴离子交换剂，二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶阳离子交换剂，羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐 固定化酶固定化酶 酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基和Glu残基

5、的羧基这种方法也用于制备交联的结晶酶。6 NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。酶吸附较牢，在工业上具广泛用途固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进行交联反应，以制备固定化酶的方法当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，不会再被螯合剂溶解。酶分子和载体连接的功能基团运用弱水性或稍具疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚合，可用于一般生

6、物物质的固定化，这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，长期使用后仍有较高的活性如，1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆茵而成载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或吸附于中空纤维外壁上80年代开始研究，目前一般采用包埋法和吸附法pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出如,将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖对变性剂、抑制剂的抵抗能

7、力 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法 通过酶蛋白化学修饰增加蛋白质分子上电荷，能有效的通过酶蛋白化学修饰增加蛋白质分子上电荷，能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关浓度及酶和载体的特性相关 pHpH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响

8、载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少 盐可以促进蛋白质的吸附，即所谓盐析吸附 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降 载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附 固定化酶固定化酶 吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用 但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程

9、度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性 固定化酶固定化酶交联法交联法 利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进行交联反应，以制备固定化酶的方法行交联反应，以制备固定化酶的方法最常用的交联试剂是戊二醛，用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下：固定化酶固定化酶交联方法：交联方法：(1)交联酶法交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶

10、溶液中，生成不溶性固定化酶中，生成不溶性固定化酶 如：木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH 5.2-7.2、0 下 交联24h，可形成固定化酶 这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力酶活力如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L 醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置10-30min，会有沉淀析出，1-3h内反应结束。形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶 固定化酶固定化酶(2)载体交联法载体交联法 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功用多或双功能试剂的一

11、部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法 单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，常将单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果的活力，又起到加固的效果 固定化酶固定化酶共价结合法共价结合法 酶蛋白侧链基团和载体表面功能基团之间形成共价键酶蛋白侧链基团和载体表面功能基团之间形成共价键而固定的方法而固定的方法其优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较

12、繁琐酶分子和载体连接的功能基团酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：酶蛋白N-N-端的氨基或赖氨酸残基氨基 酶蛋白C-C-端的羧基以及AspAsp残基和GluGlu残基的羧基 CysCys残基的巯基 SerSer、TyrTyr、ThrThr残基的羟基 PhePhe和TyrTyr残基的苯环 HisHis残基的咪唑基 TrpTrp残基的吲哚基 固定化酶固定化酶在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性(2)载体的选择载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般亲水

13、载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团载体没有或很少有非专一性吸附载体来源容易，并能反复使用(3)偶联反应偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素 固定化酶固定化酶如，重氮法如，重氮法 将带芳香族氨基的载体，先用将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2

14、和稀盐酸处理和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH 8-9)条件下与酶蛋白发生偶条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶联反应，得到固定化酶 固定化酶固定化酶含醛基高聚物、多糖类，如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸含醛基高聚物、多糖类，如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两每一葡萄糖产生两个醛基个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶 固定化酶固定化酶例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木

15、瓜蛋白酶载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6 NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL尿素溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处理12h，用水洗涤，除去过量甲醛加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下4-8固定18h，用pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即为固定化酶包埋法包埋法 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助

16、于聚合助进剂(包括交包括交联剂联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶。对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低 包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法 固定化酶固定化酶阻挡不利因素对酶的侵袭将产酶菌株用包埋剂，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作

17、用大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高热稳定性，这种性质对工业上的应用有益运用弱水性或稍具疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚合，可用于一般生物物质的固定化，这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，长期使用后仍有较高的活性美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺载体直接关系到固定化酶的性质和形成。1)选择合适的微载体类型 对细胞在不同微载体上的贴附性能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数,并绘制成曲线,比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进行交联反应，以制备固定化酶的方

18、法例如，利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株；加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低中空纤维生物反应器（hollow fiber bioreactor）是理查德克瑞克（Richard Kncazek）等在1972年发明的如，将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；用生理盐水配制3-4的琼脂，加热溶解，灭菌后冷至50左右，与等体积这种固定几乎是不可逆的吸附用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多

19、酶)菌株；动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化置于IL尿素溶液中，搅拌。加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.(1)(1)凝胶包埋法凝胶包埋法 将酶分子包埋在凝胶格子中将酶分子包埋在凝胶格子中 聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N-甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸铵(引发剂)，混合，于室温保温10min，便得含酶凝胶。

20、将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶 聚丙烯酰胺包埋法的缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质聚丙烯酰胺包埋法的缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服 固定化酶固定化酶 辐射包埋法辐射包埋法酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中，在常温或低温下，用X-射线、Y-射线或电子束辐照，可得到包埋酶的亲水凝胶如，用X-射线引发丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶1973年

21、HMaeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶运用弱水性或稍具疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚合，可用于一般生物物质的固定化，这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，长期使用后仍有较高的活性 固定化酶固定化酶(2)微囊化法微囊化法 将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内 酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性 小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出 微囊一般直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡 可用不同类型、

22、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞因此，此法在医疗上应用极为广泛。例如，固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊 固定化酶固定化酶 界面沉淀法界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法 界面聚合法界面聚合法 将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中 固定化酶固定化酶微胶囊的制备方法微胶囊的制备方法 红血球包埋法红血球包埋法 在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球，再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出 脂

23、质体包埋法脂质体包埋法 采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶固定化酶的性质固定化酶的性质固定化酶活力固定化酶活力 与溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶与不溶性载体相结合引起结构变化；酶活性中心重要氨基酸残基与载体相结合；载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降 在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致活力回收和相对活力活力回收和相对活力 酶固定化一般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力酶固定化一般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收的百分数称为活力回收 固定化酶固定化酶固定化

24、酶活力测定固定化酶活力测定 基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示。即每毫克干重基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分钟转化固定化酶每分钟转化1 1molmol底物量或形成底物量或形成1 1molmol产物的酶量为一个产物的酶量为一个单位单位(mol/mgmin)(mol/mgmin)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cmcm2 2）的初速度来表示）的初速度来表示 固定化酶固定化酶固定化酶的稳定性固定化酶的稳定性 大多数酶在固定化后都不同程度提高了稳定性，延长了有效大多数酶在固定化后都不同程度提高了稳定性，延长了有效寿命寿命

25、 固定化增加酶构象的牢固程度 阻挡不利因素对酶的侵袭 限制了酶分子间的相互作用但如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降但如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降热稳定性热稳定性 大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高热稳定性，大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高热稳定性，这种性这种性质对工业上的应用有益质对工业上的应用有益如，氨基酰化酶，溶液酶在75保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力。CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5-15其他，如固定化乳酸脱

26、氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高 固定化酶固定化酶pH-酶活力关系酶活力关系 反应的最适反应的最适pH和和pH-酶活力曲线的变动依据酶蛋白和载体的电酶活力曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反移动；带正电荷的载体则相反 尽管大多数固定化酶的活力尽管大多数固定化酶的活力-pH关系曲线仍为钟形曲线，但与溶关系曲线仍为钟形曲线，但与溶液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移对蛋白酶的抵抗能力对蛋白酶的抵抗

27、能力 溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力 如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80的活力可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中 固定化酶固定化酶对变性剂、抑制剂的抵抗能力对变性剂、抑制剂的抵抗能力 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力如，氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶

28、液中活力分别为9、49、1和55，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138操作稳定性操作稳定性 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期（固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期（t1/2，即酶活性，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间）较长达到原有酶活性一半时所需的时间）较长贮藏稳定性贮藏稳定性 大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在白酶（琼脂）在4下，下，120天酶活力无变化天酶活力无变化 固定化酶固定化酶固定化细胞固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的固定化细胞是在固定化酶的基础上发

29、展起来的优点:(1)省去了酶的分离程序(2)细胞生长快、多、反应快(3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子抵抗力增加 固定化细胞固定化细胞缺点：(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：载体没有或很少有非专一性吸附当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，

30、不会再被螯合剂溶解。（1）琼脂多孔醋酸纤维固定法形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下4-8固定18h，用pH7.无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞6)细胞消化与收获 通常采用酶消化法收获细胞。活，同时，制作手续亦较繁琐阴离子交换剂，二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶中空纤维生物反应器（hollow fiber bioreactor）是理查德克瑞克（Richard Kncaz

31、ek）等在1972年发明的 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法 红血球包埋法 在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球，再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出固定化酶也存在一些缺点：用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。聚丙烯酰胺凝胶包埋法为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有

32、机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用DEAE-纤维素载体有效固定。在环境保护中用木片、石砾等固定微生物细胞作为污水处理的过滤器将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或吸附于中空纤维外壁上加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.然后加入1/2的新鲜PBS再洗1次。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大如，将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；活，同时，制作手续亦较繁琐(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。固定化增加酶构象的牢固程度阻挡不利因素对酶的侵袭海藻

33、酸盐多聚赖氨酸微囊化如，用纤维素作为吸附剂吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。中空纤维生物反应器（hollow fiber bioreactor）是理查德克瑞克（Richard Kncazek）等在1972年发明的对于回收率要求不高的细胞种类分组沉降简单易行,而若要求高回收率,则可用过滤方法,采用100m孔径的尼龙网、不锈钢网、多孔玻璃滤器等将细胞与微载体分离开但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性然后加入1/2的新鲜PBS再洗1次。如，用X-射线引发丙烯酰胺聚合，可以

34、固定胰蛋白酶琼脂糖包埋：将1-2.80年代开始研究，目前一般采用包埋法和吸附法悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。中空纤维生物反应器培养微生物细胞的固定化方法微生物细胞的固定化方法 菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法等埋法、吸附法等 包埋法包埋法 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法包埋法是制备固定化细胞最常用的方法 将产酶菌株用包埋剂，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用 如，1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、

35、戊二醛包埋大肠杆茵而成 美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺 固定化细胞固定化细胞 固定化细胞固定化细胞(2)吸附法吸附法 分物理吸附法和离子交换吸附法分物理吸附法和离子交换吸附法 物理吸附法物理吸附法 物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。载体常用的多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等如，将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。在环境保护中用木片、石砾等固定微生物细胞作为污水处理的过滤器物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大

36、，但细胞极物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大，但细胞极容易脱落而流失容易脱落而流失 固定化细胞固定化细胞离子交换吸附法离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离子交换树脂例如，利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用离子交换纤维素吸附无色杆菌(含头孢霉素酰化酶菌株)；用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞 固定化细胞固定化细胞动植物细胞固定化动植物细胞固定化植物细胞固定化植物细胞固定化 植物细胞比菌体细

37、胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用包埋法和吸附法年代开始研究，目前一般采用包埋法和吸附法 固定化细胞固定化细胞包埋法包埋法 将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞在在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，在细胞表面形成凝胶之间形成离子键。因海藻酸钙不溶于水，在细胞表面形成凝胶如果采用磷酸

38、、柠檬酸、如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等螯合剂处理将等螯合剂处理将Ca2+离子除去，离子除去，又能使胶体溶解释放出细胞又能使胶体溶解释放出细胞当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，当海藻酸钙微囊用多聚赖氨酸处理后，使凝胶微球表面成膜，不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠不会再被螯合剂溶解。再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内成液态，细胞悬浮在微囊内海藻酸盐海藻酸盐多聚赖氨酸微囊化多聚赖氨酸微囊化 固定化细胞固定化细胞植物细胞微囊化示意图 固定化细胞固定化细胞吸附法吸附法 将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或吸附于中空纤维外壁上 如

39、,将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月 如,将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖 固定化细胞固定化细胞动物细胞固定化动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温和的固定化方法。目前，动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸方法。目前，动物细胞固定

40、的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多附法用的最多吸附法吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，在培养过程中趋向于附着固体由于大多数动物细胞属于附着细胞，在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞主要载体及固定方法有：主要载体及固定方法有：(1)转瓶法转瓶法 转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养.若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力 固定化细胞固定化细胞(2)微载体法微载体法 微载体是指直径为

41、100-200um，相对密度接近于1.0的颗粒固定化载体。由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如用于生产干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的细胞固定化 固定化细胞固定化细胞(3)中空纤维法中空纤维法 中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。将细胞胞置于管外壁扣容器外壳之间，则细胞附着于外壁上，培养液从管内流动，能透过管壁进行质热传递，中空纤维起着体内微血管的作用，有利细胞生长及其新陈代谢。已有多种中空纤维固定化细

42、胞用于生产各种单克降抗体和疫苗微载体培养微载体培养 1967年，维尔茨（van Wezel）开发了微载体系统 微载体系统将传统的一维平面一维平面贴附扩展为三维立体三维立体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）的限制 微载体使利用生物反应器进行动物细胞大规模培养成为可能，既能满足能满足动物细胞的贴壁动物细胞的贴壁要求，又能充分利用生物反应器内部空间充分利用生物反应器内部空间 固定化细胞固定化细胞微载体制作方法微载体制作方法制作方法包括：高温烧结法、聚合物快速凝聚法、高分子材料成球聚合法、锐孔喷液冷冻凝固法 固定化细胞固定化细胞1)1)选择合适的微载体类型选择合适的微载体类型 对细胞在不同微载体上的贴附性

43、能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数,并绘制成曲线,比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体2)2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒 在玻璃容器内加入适量的微载体,加入无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS)浸泡3h以上,轻轻搅动。然后加入1/2的新鲜PBS再洗1次。高压蒸汽灭菌3)3)接种接种 根据细胞类型决定接种浓度。微载体的浓度一般按2-3g/L配制,搅拌速度控制在50-70 r/min微载体培养基本流程微载体培养基本流程 固定化细胞固定化细胞4)4)培养观察与细胞计数培养观察与细胞计数 在显微镜下直接观察微载体上细胞的生长情况，将微载体上的细胞消化后计数并计算其浓度5)5

44、)传代培养传代培养 微载体上分离后的细胞可进一步做微载体传代培养。如果放大培养,可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增加培养体积，也可在微载体长满细胞后直接加入新的微载体进行球传球接种6)6)细胞消化与收获细胞消化与收获 通常采用酶消化法收获细胞。对于回收率要求不高的细胞种类分组沉降简单易行,而若要求高回收率,则可用过滤过滤方法,采用100m孔径的尼龙网、不锈钢网、多孔玻璃滤器等将细胞与微载体分离开 固定化细胞固定化细胞中空纤维生物反应器培养中空纤维生物反应器培养中空纤维生物反应器（hollow fiber bioreactor）是理查德克瑞克（Richard Kncazek）等在197

45、2年发明的最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也能在上面贴附生长 固定化细胞固定化细胞目前，动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多(1)转瓶法 转瓶是由玻璃或塑料制成。锐孔喷液冷冻凝固法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用在Ca2+离子等多价阳离子的存在下，海藻酸盐的羧基和阳离子之间形成离子键。这种方法也用于制备交联的结晶酶。如：将500mg酶溶于5m1 0.如，用多孔硅为载体吸附淀粉酶，在45进行固定化，用高浓度底物用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功

46、再用柠檬酸去除钙离子，球内海藻酸钠成液态，细胞悬浮在微囊内 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化利用离子交换吸附细胞常用的载体是离子交换树脂2)浸泡水化及消毒 在玻璃容器内加入适量的微载体,加入无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS)浸泡3h以上,轻轻搅动。运用弱水性或稍具疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚合，可用于一般生物物质的固定化，这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，长期使用后仍有较高的活性1)选择合适的微载体类型 对细胞在不同微载体上的贴附性

47、能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数,并绘制成曲线,比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体1)选择合适的微载体类型 对细胞在不同微载体上的贴附性能进行评价，计算细胞贴壁率和细胞数,并绘制成曲线,比较细胞容纳量、微载体用量、搅拌速度,由此选出适当的微载体2mol/L 醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.微生物细胞的固定化方法如果放大培养,可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增加培养体积，也可在微载体长满细胞后直接加入新的微载体进行球传球接种(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；(1)凝胶包埋法 将酶分子包埋在凝胶格子中柱状中空纤维反应器柱状中空纤维反应器 固定化细胞固定

48、化细胞板框式中空纤维反应器板框式中空纤维反应器 固定化细胞固定化细胞中心灌流式反应器中心灌流式反应器 固定化细胞固定化细胞包埋法包埋法 根据载体与方法不同，有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种根据载体与方法不同，有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种 凝胶包埋法凝胶包埋法 用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白 琼脂糖包埋：将1-2.5的琼脂糖加热溶解后冷至37-38,与一定量动物细胞混合后，分布于石蜡油中，使温度湖37降至10左右，可得到直径为0.1-0.3mm的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产 固定化细胞固定化细胞海藻酸钙凝胶包埋：将动物细胞与一定浓度的海藻

49、酸凝胶溶液混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定CaCl2溶液中即成 (2)半透膜包埋法半透膜包埋法 利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋，形成微囊形固定化动物细胞。例如：先用海藻酸钙包埋动物细胞制成胶粒后，再在外面包一层聚Lys膜，然后放入柠檬酸钠溶液中去除海藻酸钙，便可获得由多聚Lys包埋的动物细胞 固定化细胞固定化细胞原生质体固定化原生质体固定化 首先要制备较稳定的原生质体，然后用凝胶进行包埋首先要制备较稳定的原生质体，然后用凝胶进行包埋（1）琼脂多孔醋酸纤维固定法）琼脂多孔醋酸纤维固定法 用生理盐水配制3-4的琼脂，加热溶解，灭菌后冷至50左右，与等体积 一定浓度的原生质体混合，将

50、混合液滴加于多孔醋酸纤维上，置冰箱冷却凝固（2）海藻酸钙凝胶固定法）海藻酸钙凝胶固定法 以3-6海藻酸钙溶液与等体积一定浓度的原生质体混合，混合液滴入CaCl2 溶液中，并浸泡1-2h 固定化细胞固定化细胞5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸铵(引发剂)，混合，于室温保温10min，便得含酶凝胶。同时，对胞内酶需经分离后才能固定化吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡如，将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定