1、血清血清球蛋白的球蛋白的 分离纯化与鉴定分离纯化与鉴定 【实验目的实验目的】 1 1学习凝胶层析和离子交换层析分离纯化学习凝胶层析和离子交换层析分离纯化 蛋白质的基本原理及应用蛋白质的基本原理及应用 2 2掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 3 3了解蛋白质分离纯化的总体思路了解蛋白质分离纯化的总体思路 【实验方法实验方法】 一、盐析法粗分一、盐析法粗分- -球蛋白球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化三、离子交换层析方法纯化- -球蛋白球蛋白 四四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定- -球蛋白的纯度球蛋
2、白的纯度 【基本原理基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性是研究蛋白质化学性 质及生物学功能的重要手段之一。质及生物学功能的重要手段之一。 分离纯化蛋白质的方法分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些是利用不同蛋白质的某些 物理、化学性质的不同物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、而建立的方法，其中有盐析、 离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。 在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才 能达到分离纯化一种蛋白质的目的。能达到分离纯化一
3、种蛋白质的目的。 分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法 分离方法分离方法 沉淀法沉淀法 盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 层析法层析法 电学法电学法 电泳法电泳法 等电聚焦等电聚焦 超速离心法超速离心法 离子交换层析离子交换层析 吸附层析吸附层析 凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛） 亲和层析亲和层析 【基本原理基本原理】 本实验采用本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过 滤、离子交换层析滤、离子交换层析方法，分离纯化血清方法，分离纯化血清- - 球蛋白。最后用球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定鉴定 - -球蛋白的纯度。球蛋白的纯度。 实验思路
4、实验思路 分段盐析去除杂蛋白分段盐析去除杂蛋白 凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐 交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 先先 粗粗 后后 细细 离子交换层析纯化离子交换层析纯化 一、盐析法粗分离血清一、盐析法粗分离血清- -球蛋白球蛋白 盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的 中性盐溶液中中性盐溶液中溶解度溶解度不同，分别析出，达到不同，分别析出，达到 彼此分离的方法。彼此分离的方法。 本实验在本实验在半饱和硫酸铵溶液半饱和硫酸铵溶液中中，清蛋白清蛋白 溶解溶解，球蛋白将沉淀析出球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉经离心所得的沉
5、淀即为球蛋白的粗提液淀即为球蛋白的粗提液。 定义：定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳 定因素并使从溶液中沉淀析出的现象定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。 原理原理: : 破坏蛋白质两个稳定因素：破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层水化膜和电荷层 中性盐：中性盐：(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl等等。 优点：优点：蛋白质不变性蛋白质不变性，常用常用。 盐析法盐析法 盐析步骤盐析步骤 取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清 2ml2ml 加入加入2ml 0.9%氯化钠氯化钠摇匀摇匀 边搅拌混匀边缓慢滴
6、加饱和边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml 上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白） 倾去倾去 静止静止1010分钟，再离心（分钟，再离心（50005000转转/ /分）分）1010分钟分钟 沉淀用沉淀用1ml 0.9%氯化钠氯化钠搅拌溶解搅拌溶解 逐滴加饱和逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀摇匀 静止静止10分钟，再离心分钟，再离心 （5000转转/分）分）10分钟分钟 倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含 、球蛋白）球蛋白） 沉淀即为初步纯沉淀即为初步纯 化的化的球蛋白球蛋白 加入加入0.0175mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解溶解 球蛋
7、白球蛋白 粗提液粗提液 二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量 盐，通常有盐，通常有两种方法两种方法： 凝胶层析法；透析凝胶层析法；透析 本试验采用本试验采用葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex G 25Sephadex G 25层析方法层析方法 除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子，以便下一步用离子 交换层析方法进一步提纯球蛋白。交换层析方法进一步提纯球蛋白。 凝胶层析凝胶层析原理：原理： 凝胶层析法是按混合物各组分凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小分子量大小不
8、同随不同随 流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一当吸收一 定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质 相互作用的惰性物质，相互作用的惰性物质，凝胶凝胶层析以其为固定相。层析时，层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的直径大于凝胶网孔的大分子物质大分子物质不能进入凝胶内部，只不能进入凝胶内部，只 能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流
9、程短、 流速快，首先流出层析柱；而流速快，首先流出层析柱；而小分子物质小分子物质直径小于凝胶直径小于凝胶 网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定 时间时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目 的的。 凝胶层析法脱盐凝胶层析法脱盐 凝胶柱层析脱盐凝胶柱层析脱盐 数学模型 Vo Vi Vt ViVi凝胶孔内水（内水）凝胶孔内水（内水） VoVo颗粒间水（外水）颗粒间水（外水） VgVg凝胶体积凝胶体积 总体积总体积VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVg Kd Kd
10、 分配系数：精确衡量混合物分配系数：精确衡量混合物 中某一待分离成分在凝胶柱内的洗中某一待分离成分在凝胶柱内的洗 脱行为，反映物质分子进入凝胶颗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗 粒的程度，是溶质分子大小的一个粒的程度，是溶质分子大小的一个 函数函数 VeVe洗脱体积：分离物被洗脱时所洗脱体积：分离物被洗脱时所 用的洗脱液体积用的洗脱液体积 VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标， 各物质浓度各物质浓度/ /吸光度为纵坐标作图吸光度为纵坐标作图 （1 1）完全被排阻的极端大分子，）完全被排阻的极端大分子，VeVe= =VoVo，Kd
11、Kd=0=0 （2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd11 （3 3）完全渗透的小分子，）完全渗透的小分子，VeVe= =VoVo+ +ViVi， KdKd=1=1 Sephadex GSephadex G- -2525的准备的准备 装柱（装柱（1520cm1520cm） 操作步骤：操作步骤： 1 1、层析柱保持垂直。、层析柱保持垂直。 2 2、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。、放蒸馏水，排沙芯下空气，关闭出口。 3 3、加入搅拌均匀的、加入搅拌均匀的SephadexGSephadexG- -2525悬液，调节流速悬液，调节流速1010滴滴/
12、min/min， 使凝胶均匀沉降，不断补充，直至使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm18cm。 4 4、上留、上留1 1- -2mm2mm的水，关闭出口。的水，关闭出口。 注意：注意： 床面上要保持少许水，床面上要保持少许水，防止胶床露出液面防止胶床露出液面。 胶面不平胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。使表面平整。 加样与洗脱加样与洗脱 凝胶的再生凝胶的再生 1 1、加样：、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样 品品 溶液渗入凝胶。溶液渗入凝胶。 2 2、洗脱：、洗脱：加入洗脱液，打开
13、出口，保持流速加入洗脱液，打开出口，保持流速1010滴滴/min/min，收，收 集洗脱液，每管收集集洗脱液，每管收集1ml1ml。用。用奈氏试剂检测铵奈氏试剂检测铵。 3 3、保存：、保存：20%20%璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质，保存含，保存含 量高的进一步纯化。量高的进一步纯化。 不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。 脱盐脱盐 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 上样上样 球蛋白，球蛋白， 粗提液粗提液 装柱装柱 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G G- -2525， 柱高柱高1818- -20cm20
14、cm 流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 加入洗脱剂加入洗脱剂 收集收集 20滴换滴换 一支试管一支试管 . .层析后洗脱液检测层析后洗脱液检测 白色比色板白色比色板, ,洗净备用。洗净备用。 一块在各孔滴加奈氏试剂（检测一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NHNH4 4+ +）, ,另一块另一块 滴加滴加20%20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。璜基水杨酸（检测蛋白质）。 不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒 用用“- -”表示无现象，用表示无现象，用“+ +”, , “+”, , “+”等表示颜色深浅等表示颜色深浅 回收凝胶回收凝胶 注意事项：注意事项： 1 . 凝胶柱的制备
15、质量决定分离效果的好坏凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2 . 加样分离时，滴速慢，分离效果越好。加样分离时，滴速慢，分离效果越好。 以管号为横轴，蛋白以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。曲线，分析实验结果。 三、三、DEAEDEAE纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析 【实验目的实验目的】 1 1. . 通过使用通过使用DEAEDEAE纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析法法，进一步进一步 纯化纯化- -球蛋白脱盐液球蛋白脱盐液，得到较纯的得到较纯的- -球蛋白溶液球蛋白溶液 2 2. . 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用学习了解离
16、子交换层析方法的基本原理和应用 离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理 离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到离子交换剂是通过化学反应将带电基团引入到 惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定惰性支持物上形成的固体物质，在实验中作为固定 相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为相。如果其带负电，则能结合阳离子，成为阳离子阳离子 交换剂交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子，称为；如果其带正电，则能结合阴离子，称为阴阴 离子交换剂离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交。可根据实验需要，选择不同的离子交 换剂进行离子交换层析。换剂进行离子交换层析。 DEAE DEAE （二乙基氨基乙
17、基）纤维素（二乙基氨基乙基）纤维素含有可离含有可离 子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的子化的碱基，可与氢离子结合，成为带正电荷的阴阴 离子交换剂离子交换剂。 DEAEDEAE纤维素离子交换层析纯化纤维素离子交换层析纯化球蛋白球蛋白 清蛋白清蛋白pI=pI=4 4. .6464， 2 2球蛋白球蛋白 pI=pI=5 5. .0606， 球蛋白球蛋白pI=pI=5 5. .1212， 球蛋白球蛋白pI=pI=7 7. .3 3 本实验采用本实验采用0 0. .01750175 mol/lmol/l pHpH6 6. .5 5 NHNH4 4AcAc缓冲液进缓冲液进 行洗脱行洗脱。DEAED
18、EAE带正电荷带正电荷，可与带负电荷的可与带负电荷的、- -球蛋球蛋 白和清蛋白结合白和清蛋白结合，而而带正电荷的带正电荷的- -球蛋白不与球蛋白不与DEAEDEAE结结 合合，首先从层析柱中洗脱出来首先从层析柱中洗脱出来。 操操 作作 将脱盐后的球蛋白加于将脱盐后的球蛋白加于DEAEDEAE柱上（方法同凝柱上（方法同凝 胶过滤），用胶过滤），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac缓冲缓冲 液洗脱，流速液洗脱，流速1010滴滴1515滴滴/ /分，用小试管连续收分，用小试管连续收 集流出液（约集流出液（约1.0 ml/1.0 ml
19、/管），用管），用20%20%磺基水杨酸溶磺基水杨酸溶 液检查蛋白质分布情况液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部分，收集含量最高的部分， 浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是 球蛋白。球蛋白。 . .使用离心机的操作注意事项。使用离心机的操作注意事项。 . .装柱时检查是否漏水。装柱时检查是否漏水。 . .装柱后凝胶装柱后凝胶均一无断层，无气泡，柱床面平整均一无断层，无气泡，柱床面平整。 . .柱床面保持有缓冲液。柱床面保持有缓冲液。 . .加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。 . .每用一次滴管，请用水
20、清洗干净，防止试剂及被每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被 测样品交叉污染。测样品交叉污染。 四、四、球蛋白纯化液的浓缩球蛋白纯化液的浓缩 利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大 分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量 凝胶，离心，浓缩蛋白。凝胶，离心，浓缩蛋白。 每每mlml纯化纯化球蛋白溶液加球蛋白溶液加Sephadex GSephadex G- -25 0.25 g25 0.25 g， 摇动摇动2 23 3分钟，离心分钟，离心3000r/min3000r/min，5 5分钟，上清即为浓缩分钟，上清即
21、为浓缩 - -球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。 五、五、球蛋白鉴定球蛋白鉴定 用用醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以的方法，以 血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋 白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸 纤维素薄膜电泳）。纤维素薄膜电泳）。 蛋白质的电离示意图蛋白质的电离示意图 基本原理基本原理 1 1、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。 2 2、在、在pH8.6pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电
22、场中 均带负电荷，向正极移动均带负电荷，向正极移动。 3 3、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷 少、分子量相对大的泳动速度慢。少、分子量相对大的泳动速度慢。 血清蛋白质乙酸纤维血清蛋白质乙酸纤维 素薄膜电泳素薄膜电泳 清蛋白清蛋白 1 2 加样线加样线 加样线加样线 纯化蛋白纯化蛋白 对照对照 样品样品 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 点样点样 ： 全血清：点样一次全血清：点样一次 脱盐后的粗蛋白溶液：点样脱盐后的粗蛋白溶液：点样1 1次次 浓缩后的纯浓缩后的纯球蛋白溶液：点样球蛋白溶液：点样1 1次次 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸
23、纤维素薄膜电泳 电泳条件电泳条件： 电压：电压：90110 V； 时间：时间：50分钟。分钟。 染染 色色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基 黑黑10B10B染色液的染色缸中染色染色液的染色缸中染色5 5分钟，用分钟，用2.5 %2.5 %醋酸洗脱醋酸洗脱 液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白图谱为对照，液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白图谱为对照， 观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？ 操作步骤：操作步骤： 1 1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。 2 2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻
24、轻吸、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干干 半干燥态。半干燥态。 铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。 3 3、放入电泳槽，使膜保持水平。、放入电泳槽，使膜保持水平。 4 4、通电：、通电：110110伏，伏，1 1小时。断电后，取膜。小时。断电后，取膜。 5 5、染色：氨基黑、染色：氨基黑10B10B染色染色5min5min。 6 6、漂洗：漂洗液浸洗、漂洗：漂洗液浸洗3 3次，每次次，每次5 5- -10min10min。 快快 + 铅笔标记铅笔标记 ，垂直点样，垂直点样 保持膜不下垂保持膜不下垂 半干燥半干燥 态态 按泳动快慢顺序分为按泳动快慢顺序分为： 清蛋白、清蛋白、1 1、2 2、球蛋白球蛋白。 注意事项：注意事项： 1 1、区分电泳槽正负极。、区分电泳槽正负极。 2 2、点样处放在负极端，保持膜水平。、点样处放在负极端，保持膜水平。 3 3、点样面朝下，以防样品蒸发。、点样面朝下，以防样品蒸发。 41 实验报告实验报告 一、实验目的 二、实验原理 三、实验操作 四、实验结果
