1、13 下游加工过程概论下游加工过程概论v生物分离工程：生物分离工程：回收生物产品分离过程 原理与方法v生物技术下游加工过程生物技术下游加工过程（Downstream Processing）生物化工产品通过微生物发酵过程,酶反应过程或动植物细胞大量培养获得,从发酵液或培养液中分离精制有关产品的过程 概概 论论知识点：知识点：l 下游加工过程在生物技术中的地位 l 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较 l 生物技术下游加工过程的特点 l 生化分离工程的一般流程和单元操作 l 选择纯化方法的依据 l 非蛋白质类杂质的去除重点：重点：掌握下游加工过程的概念、特点及其操作的常规程序 了解生化工程的地
2、位及其发展趋势难点：难点：不同种类的产品分离纯化的一般流程和单元操作天然产物研究研发平台天然产物研究研发平台n生物碱产品：生物碱产品：n有机酸产品有机酸产品:n黄酮产品：黄酮产品：n皂苷产品：皂苷产品：n活性多糖产品：活性多糖产品：n天然色素产品：天然色素产品：n现代分离组合技术和集成技术：现代分离组合技术和集成技术：“银杏叶综合利用技术银杏叶综合利用技术”项目项目 银银杏杏叶叶黄黄酮酮 银杏叶 聚聚戊戊烯烯醇醇 银银杏杏酸酸 保健食品 降脂药、降压药 抗菌药 银银杏杏叶叶内内酯酯抗癌药 银杏叶黄酮银杏叶黄酮OOOHHOOR1R2OH山萘酚R1=H，R2=H檞皮素R1=H，R2=OH异鼠李素R
3、1=H，R2=OMe银杏内酯银杏内酯OOOHR1OOHOHtBuR2HOOHOOOOOHOOHOHtBuHOG-A：R1=R2=HG-B：R1=OH，R2=HG-C：R1=R2=OHG-J：R1=H，R2=OH白果内酯银杏酸银杏酸OHCOOHRR=C13H27(C13:0)R=C15H31(C15:0)R=C15H29(C15:1)R=C17H33(C17:1)R=C17H31(C17:2)聚戊烯醇聚戊烯醇ORn聚戊烯醇：RH，n1020聚戊烯醇乙酸酯：R=Ac,n=1020“柚子全组分综合利用技术柚子全组分综合利用技术”项目项目 柚子果囊 平平和和文文旦旦柚柚 柚柚皮皮糖糖 里层白皮 外层青
4、皮 柚子叶 柚子果皮 果果酒酒 粒粒粒粒柚柚饮饮料料 果果胶胶 柚柚皮皮苷苷 天天然然色色素素“枇杷全组分综合利用技术枇杷全组分综合利用技术”项目项目 枇杷叶 枇杷 枇杷果 枇枇杷杷核核 三三萜萜酸酸、苦苦杏杏仁仁苷苷、皂皂苷苷 抗癌药 枇杷花 淀淀粉粉 化痰、止咳、平喘药 保健食品 膳膳食食纤纤维维 果酒 饮料 香香精精香香料料 特种淀粉添加剂 化妆品不同蛋白质的溶解度与硫酸铵浓度关系不同蛋白质的溶解度与硫酸铵浓度关系2.1 生物技术树生物技术树生物科学与生物技术及其产业的关系生物科学与生物技术及其产业的关系生物技术多学科性生物技术多学科性2.2 生物技术所涉及的行业种类生物技术所涉及的行业
5、种类2.3 美国生物技术产品销售预测美国生物技术产品销售预测 美国工业化生物技术研究与发展基金分布图美国工业化生物技术研究与发展基金分布图传统发酵与现代发酵比较传统发酵与现代发酵比较生物技术各分类间关系生物技术各分类间关系生物技术发展简史生物技术发展简史生物 4000年前 中国、埃及、两河流域 酿酒造醋初期生物技术 1680年 荷兰Leenwen hoek 显微镜 1857年 法国Pasteur 酒精发酵 灭菌法 1897年 德国Buchner 酶近代生物技术 1943年 美英 青霉素 深层发酵现代生物技术v 1953年 1944年阐明了DNA是遗传信息的携带者。1953年提出了DNA的双螺旋
6、结构模型，阐明了DNA的半保留复制模式，从而开辟了分子生物学研究的新纪元。1961年等破译了遗传密码，揭开了DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密。DNA的双螺旋结构模型v 1972年首先实现了DNA体外重组技术，标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。生物技术的最新进展生物技术的最新进展 (1)基因工程方面试管婴儿、细胞融合、蛋白质序列分析，人参培养(2)生物反应器连续式，柱式、固定化酶、固定化细胞反应器 (3)发酵技术 如：固定化酶、固定化细胞技术 13.1 生物下游加工在生物技术中的地位生物下游加工在生物技术中的地位v分离工程研发费用与成本 研究费用：50%以上产品成本：40
7、-80%人力物力：70-90%13.2 传统生物产品与基因工程传统生物产品与基因工程产品回收方法的比较产品回收方法的比较v传统产品 v(1)小分子（少数工业用粗酶）v(2)理化性质清楚v(3)易于放大v基因产品v(1)大分子v(2)胞内v(3)不稳定v(4)放大困难生物技术产品的类型生物技术产品的类型按分子量大小v小分子产品：（小于1000）抗生素，有机酸，氨基酸v大分子产品：（大于1000）酶,抗体，多肽，蛋白质v按产品所处的位置v细胞内:胰岛素，干扰素，重组蛋白质v细胞外：抗生素，胞外酶 13.3 生物技术下游加工过程特点生物技术下游加工过程特点v生物产品特点：v 产物浓度低的水溶液(原因
8、：a 氧传递限 制；b 细胞量;c 产物抑制 v 组分复杂(a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d v 不可溶物;e 化学添加物v 产物稳定性差(a 化学降解(pH,温度);b 微生物降解（酶作用，染菌）v 分批操作，生物变异性大v 质量要求高（药品或食品）发酵液中目标物浓度与产品售价发酵液中目标物浓度与分离步聚的关系 13.4 生物分离的流程与单元操作生物分离的流程与单元操作v 细胞回收技术:絮凝，离心，过滤，微过滤。v 细胞破碎技术:球磨，高压匀浆，化学破碎技术v 初步纯化技术:吸附剂，离子交换，沉淀（盐析 法，有机溶剂沉淀，等电点，沉淀剂），溶剂萃 取，两水相萃取，超临界萃取，逆胶束萃取
9、，膜 分离技术v 高度纯化技术:各类层析，亲和，疏水，聚焦，离 子交换，结晶v 成品加工：浓缩，除菌与热原，喷雾干燥，气流干 燥，沸腾干燥，冷冻燥13.4 生物下游加工过程的一般步生物下游加工过程的一般步聚聚 逆胶束示意图表面活性剂溶于水在水中聚集一起形成（正胶束）表面活性剂溶于水在水中聚集一起形成（正胶束）;极性基团极性基团在外在外,非极性基团在内非极性基团在内,溶解非极性物质溶解非极性物质;将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度(CMC)(CMC)时，时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常表面活性剂就会在水溶液中聚集
10、在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束情况下，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束(normal micelle)(normal micelle)。结构示意见图。结构示意见图a a。1、胶束与反胶束的形成胶束与反胶束的形成a在胶束中，表面活性剂的排列方向是在胶束中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与水接触，非极性基极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。此核心可以溶解非极性物质。正胶束正胶束表面活性剂表面活性剂(双亲物质双亲物质)在非极性有机溶剂中在非极性有机溶剂中,并
11、使其浓度超过临界胶并使其浓度超过临界胶束浓度束浓度(CMC)(CMC)，便会在有机溶剂内自发形成聚集体，便会在有机溶剂内自发形成聚集体,又称为反胶团、又称为反胶团、逆胶束逆胶束(inverse micelle),极核具溶解极性物能力极核具溶解极性物能力;其结构示意见其结构示意见图图b b。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(po1ar core)(po1ar core)。极性核溶解水后，就形成了极性核溶解水后，就形成了“水池水池”(wat
12、er pool)(water pool)。当含有此种反。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此能够通过螯合作用进入此“水池水池”。由于周围水层和极性基团的保。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图和溶解后的情况示意于图c c中。中。bc反胶束反胶束13.5 13.5 生物下游加工过程的选择准则生物下游加工过程的选择准则v 步聚少v 次序合理v 产品规格（注射，
13、非注射）v 生产规模 v 物料组成v 产品形式 固体 适当结晶，液体，适当浓缩v 产品稳定性v 物性 溶解度，分子电荷，分子大小，功能团，稳 定性，挥发性v 危害性v 废水处理13.6 非蛋白类杂质的去除非蛋白类杂质的去除v（1）DNA v A 阴离子交换（pH 4.0)v B 亲和层析（不被吸附）v C 疏水层析v（2）热原（蛋白质溶液中的去热原）v A 生产过程无菌v B 所有层析介质无菌v C 所用溶液无菌v D 亲和层析（多粘菌素）v（3）去病毒v A 加热（60 C)v B 过滤v C 灭活剂13.7 目标蛋白的表征和分析方法目标蛋白的表征和分析方法v（1）HPLCv（2）SDS-P
14、AGEv（3）氨基酸顺序分析v（4）氨基酸，肽图，免疫化学v（5）与标准品对照分析 操作集成化 方法集成化 大分子与大分子分离方法的相互渗透 亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成 优质层析介质的开发基因工程对下游过程的影响发酵与提取相耦合13.8 发展趋向13.9 下游加工过程的沿革下游加工过程的沿革v传统产业（第一代）v19世纪60年代-20世纪50年代 酒精，丙酮，丁醇v第二代生物技术产品 20世纪40年代 v抗生素，有机酸，核酸，酶制剂，单细胞蛋白v第三代 20世纪70年代中期v动物细胞培养v植物细胞培养v基因工程发酵产品13.10 13.10 生物分离工程的发展动向生物分离工程的发展
15、动向v（1 1）操作集成化（扩张床，两水相）操作集成化（扩张床，两水相）v（2 2）方法集成化（亲和与膜结合）方法集成化（亲和与膜结合）v（3 3）大分子与小分子相互渗透大分子与小分子相互渗透（两水相（两水相 大分子向小大分子向小 分子分配）分子分配）v（4 4）亲和技术推广与配基合成（分子印迹）亲和技术推广与配基合成（分子印迹）v（5 5）优质层析介质开发优质层析介质开发（大孔亲水介质，贯注层析介质）（大孔亲水介质，贯注层析介质）v（6 6）下游技术与上游技术相结合下游技术与上游技术相结合(藕合分离）藕合分离）v（7 7）改进上游因素（改进上游因素（改进菌种，培养基与发酵条件改进菌种，培养基与发酵条件）v（8 8）改善环境相容性改善环境相容性 13.11 分离效率评价13.11 分离效率评价思考题：v1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？v2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？v3 初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？v4 如何除去蛋白质溶液中的热原质？v5 生物分离为何主张采用集成化技术？v6 纯化生物产品的得率是如何计算的？若每一步 纯化产物得率为90%，共6步纯化得到符合要 求产品，其总收率是多少？
