1、第二章 微生物工业的菌种一、生产菌种的分离、筛选二、高产菌株的选育三、菌种退化四、菌种保藏 在微生物工业中，起决定作用的是微生物的菌种，要获得一个具有潜在工业应用价值的微生物菌种的第一步是必须从自然界中分离出这种微生物。一、生产菌种的分离、筛选（一）材料的选择（二）材料的预处理（三）分离、筛选方案的设计（四）菌种的培养和选择（一）材料的选择土壤水域(海洋、湖泊、河流)生物体内极端环境和特殊的生态环境（二）材料的预处理热处理法膜过滤法化学药品处理 用0.01N的NaOH处理样品，可分离得到小单孢菌。用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。（三）分离、筛选方案的
2、设计筛选模型加选择性压力富集培养、诱饵法反应特性随机分离 在抗生素的筛选过程中，为避免致病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌而又能代表致病菌的其它微生物作为试验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛选模型。筛选模型加选择性压力 加入不同的抗生素或试剂来增加选择性，如分离真菌时，可加入抗细菌抗生素，分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素。富集培养 指能增加混合菌群中所需菌株的一种技术，方法是在混合菌群中提供有利于所需菌株生长或不利于其它微生物生长的条件。诱饵法 在分离样品或培养基中加入一些特殊的营养物，待菌生长一定时间后，再进行分离。如将涂石蜡的棒置于培养基中，可分离到
3、诺卡氏菌。反应特性 如分离蛋白酶，在不溶性蛋白的平板上可产生一清晰的透明圈，透明圈的大小可作为选择的依据。随机分离 制备一系列培养基，其中各种类型的养分成为限制因子。避免使用容易同化的碳、氮源，因为它们可能产生分解代谢物阻遏。（四）菌种的培养和选择温度：放线菌：2530 嗜热菌：4555 嗜冷菌：410时间：延长培养时间可以分离到新的或 不寻常的菌株大量选择选择某一类（种或属）菌种筛选时应考虑的一些重要指标1、菌的营养特性2、菌的生长温度3、菌对生产设备和生产过程的适应性4、菌种的稳定性5、从发酵液中提取产物的情况 6、产物的收得率情况(一)自然选育(二)常规诱变育种(三)合理诱变育种(四)原
4、生质体融合技术(五)基因工程技术二、高产菌株的选育 从自然界直接分离得到的菌种，一般不会立即适合实际生产的需要，只有通过选育，才能提高产物的产量，改进品质，甚至简化工艺。(一)自然选育 不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。(二)常规诱变育种 利用物理、化学等诱变剂，使微生物发生突变而进行菌种选育的过程。常规诱变育种的一般操作过程出发菌种原种特性考察斜面或摇瓶培养孢子液细胞液诱变剂处理稀释平板分离 以未处理的菌种液为对照，以未处理的菌种液为对照，计算致死率；观察单菌落形态，计算致死率；观察单菌落形态，统计形态变异率。统计形态变异率。选择、调取单菌落，转管保存初筛（
5、以出发菌种为对照）选出高产突变株，并留种保存复筛（以出发菌种为对照）根据情况进行第二、第三复筛选出高产突变株，并留种保存选出高产突变株，并留种保存高产菌株的稳定性试验菌种特性考察小发酵罐试验放大试验、中试考查高产菌种培养条件的优化试验大罐试验生产诱变育种应注意的几个问题 (1)出发菌株的选择 (2)复合诱变剂的使用 (3)诱变剂的剂量 (4)突变株的筛选 (5)高产突变株培养条件的优化常用物理、化学诱变剂：(1)紫外线 (2)快中子 (3)高频电子流 (4)Co-60 (5)亚硝酸 (6)氮芥 (7)亚硝基胍（三）合理诱变育种 根据微生物的代谢调节机理来选择一定类型的微生物突变株，以获得高产菌
6、株。代谢过程是由酶催化完成的，因此代谢途径的调节也就是酶的调节。酶合成的调节酶的调节酶活性的调节酶合成的调节：诱导：只有在有诱导物存在的时候，酶才能合成，这样的酶称为诱导酶。不需诱导物就能合成的酶是组成酶。诱导又分为协同诱导、顺序诱导等。阻遏:是阻止酶的合成，又有反馈阻遏、分解代谢物阻遏等。酶活性的调节：对已经存在酶的活性进行调节，分为激活和抑制。酶的激活有前体激活、补偿性激活等；酶的抑制有终点产物反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制等。(1)选育组成型菌株(2)选育抗反馈调节的突变株(3)选育营养缺陷型(4)选育负变菌株的回复突变株(5)选育条件抗性突变株(6)选育细胞膜透性改变的突变株(7
7、)选育抗生素抗性突变株(四)原生质体融合技术 也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质(包括核DNA和核外基因)进入另一个细胞。它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下去。原生质体再生原生质体化原生质体融合原 生 质 体 融 合简 要 说 明金色链霉菌，四环素发酵单位1400017000g/ml淡红链霉菌(正定变种1482)，柔红霉素发酵单位6080g/ml原生质体原生质体原生质体融合再生、筛选得到PF-25菌株，柔红霉素发酵单位250300g/ml阿克拉霉素产生菌(链霉菌
8、)诱 变突变株A不合成阿克拉霉素，但合成阿克拉霉素前体的类似物和2-hydroxyaklacinoe突变株B不合成阿克拉霉素，也不合成阿克拉霉素前体的类似物，但能在2-hydroxyaklacinoe上接上糖苷原生质体融合融合子产生2羟基阿克拉霉素用原生质体技术提高发酵单位的例子产物性质菌种增产效果西索米星硫链丝菌肽碳青霉烯麦迪霉素庆大霉素头霉素C巴龙霉素种内种内种内种内种间属间种内种内种间Micromonospora ingoensis运青链霉菌灰色链霉菌生米卡链霉菌生米卡链霉菌/灰色链霉菌小单孢菌/灰色链霉菌小单孢菌Nocardia lactamdurans 链霉菌/弗氏链霉菌10152倍
9、10倍405倍58521556倍原生质体融合技术的优点：(1)去除细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换和实现重组，不需要有已知的遗传操作系统(2)原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子(3)重组频率特别高(4)可以和其它育种方法相结合(5)可以用药物、温度、紫外线钝化亲株的一方，然后再进行融合，这样可以提高筛选的效率(6)原生质体融合并不局限于种内，还可以进行种间和属间的原生质体融合(五)基因工程技术 无论用什么方式获得的DNA分子，插入到任何载体(包括病毒、细菌的质粒)，使之形成遗传物质的新组合(即重组DNA分子)，再将它们转移到
10、一种原来并不含有这样新组合的宿主细胞中去，使宿主细胞获得新的遗传信息并稳定遗传下去，成为新型生物。基因工程简要说明E.coli任意细胞提取质粒提取DNA限制性内切酶退火 连接酶 转入 E.coli 繁殖、表达基因工程简要说明1、基因工程生产蛋白质及多肽类药物 蛋白质及多肽药物的基因工程是生物工程中最活跃和最有成就的领域。目前应用基因工程方法生产的这类药物已投放市场的有胰岛素、干扰素、人生长激素、白介素2、促红细胞生长素、肿瘤坏死因子、人心钠素、表皮生长因子等。人胰岛素由A、B二条链组成，A是21个氨基酸，B链是30个氨基酸，由2个2S键相连。合成胰岛素A链基因合成胰岛素B链基因 插入pBR32
11、2质粒分别转入E.coli表达启动子-半乳糖苷酶启动子-半乳糖苷酶胰岛素胰岛素A链基因链基因胰岛素胰岛素B链基因链基因 胰岛素胰岛素A链链 胰岛素胰岛素B链链 BrCN切割化学结合胰岛素 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶2、以基因工程为手段改变代谢途径，改进生产工艺，提高发酵单位D-葡萄糖D-山梨醇D-山梨糖双丙酮-L-山梨糖双丙酮-2-酮基-L-古龙酸2-酮基-L-古龙酸L-抗坏血酸莱氏法Vc生产工艺加氢还原化学氧化酮化化学氧化烯醇化、内酯化 D-葡萄糖 2.5-二酮基-D-葡萄糖酸 2-酮基-L-古龙酸 L-抗坏血酸欧文氏菌棒杆菌2.5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶基因工程欧文
12、氏菌3、基因工程在抗生素生产菌种改造方面的应用解除限速步骤，提高抗生素产量 在抗生素合成中，某些步骤对整个生物合成至关重要，对这些关键步骤酶(限速酶)的改造，可以提高抗生素的产量。如十一烷基灵红菌素和秦乐菌素生物合成的最后阶段的酶是限速酶，该过程是由一个甲基转移酶控制的，将该酶基因克隆后，经过适当改造，再转入原菌株阻断突变株中，使得该酶活性大幅度提高，最终使抗生素的合成能力提高了近10倍。阻断支路代谢，增加有效组份含量 阿维菌素B组分向A组分的转化是由aveD 基因编码的C5-O-甲基化酶催化的。OHOOOOOH3CCH3HOHCH3HHOHCH3RHCH31325222325OHOOOOOH
13、3CCH3HOMeCH3HHOHCH3RHCH31325222325AveD引入抗性基因或调节基因，提高抗生素产量 大多数抗生素产生菌都具有对自身产生的抗生素的耐受能力，而抗生素的产量一定程度上取决于对自身产生的抗生素的耐受能力的大小，利用多烤贝质粒，克隆这些抗性基因，再转入到产生菌中，从而提高抗生素产生能力。如克隆氨基糖苷-乙酰转移酶基因，再转入卡那霉素和新霉素产生菌中，结果使菌种自身对氨基糖苷类抗生素的抗性增加，使卡那霉素和新霉素的产量提高了26倍。引入血红蛋白基因，提高抗生素产量 在抗生素发酵过程中，供氧往往是一个限制因素，且大量消耗能源。在解决供氧方面也有不少成功的报道，美国科学家将与
14、氧传递有关的透明颤菌的血红蛋白基因，克隆到天蓝色链霉菌中，可使在通气不足时放线紫红素的产量提高4倍。将血红蛋白基因克隆倒头孢菌素C产生菌后，该菌在发酵过程中氧耗明显下降，且有效增加了头孢菌素C的产量。(一)退化的原因(二)防止退化的措施三、菌种退化菌种退化：菌种的一个或多个特性，随时间的推移逐步减退或消失的现象，一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物产量的下降。(一)退化的原因 1、菌系不纯 2、异核现象 3、自然分化现象 4、回复突变 5、培养条件或保藏方法问题 6、其它(二)防止退化的措施1、多做平行菌种，少转接传代2、认真进行单菌落分离3、选择有利于高产菌，不利于低产菌的培养条件4
15、、良好的保藏方法 四、菌种保藏(一)菌种保藏的原理(二)常用菌种保藏方法(三)国内外重要的菌种保藏机构(一)菌种保藏的原理 1、控制营养 2、缺氧 3、干燥 4、低温(二)常用菌种保藏方法 1、斜面冰箱保藏法 2、砂土管保藏法 3、覆盖惰性液体保藏法 4、真空冷冻干燥保藏法 5、30低温保藏法 6、液氮超低温保藏法(三)国内外重要菌种保藏机构 1、ATCC：美国模式培养物(菌)保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所(大阪)6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所 8、中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院微生物研究所(真菌、细菌)，北京 中国科学院武汉病毒研究所(病毒)，武汉 9、中国典型微生物菌种保藏管理中心 武汉大学，武汉 10、中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院，北京 11、中国医学微生物菌种保藏管理中心 中国医学科学院皮肤病研究所(真菌)，南京 卫生部药品生物制品检定所(细菌)，北京 中国医学科学院病毒研究所(病毒)，北京 12、工业微生物菌种保藏管理中心 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京
