1、流式细胞仪标本处理一般原则及方法流式细胞仪标本处理一般原则及方法流式细胞仪使用一般方法及技巧流式细胞仪使用一般方法及技巧临床流式细胞仪应用简介临床流式细胞仪应用简介殷跃锋殷跃锋流式细胞仪原理介绍流式细胞仪原理介绍双光源系统流式细胞仪在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。样本与鞘液未入管道时，边缘与中心速度一致。进入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变。流体形成层流后，会产生流体聚焦效应，所有颗粒均被推致流速最快的液流中。颗粒以衡定的速度作匀速运动。无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的流式细胞仪标本准备流式细胞仪标本准备染色的一般
2、原则及方法染色的一般原则及方法标本来源：标本来源：外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。根据各种具体实验，选用根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。不同的抗凝剂。可用的抗凝剂如下：可用的抗凝剂如下：EDTA：2mg/ml枸椽酸钠：枸椽酸钠：0.38%肝素：肝素：15IU/ml标本处理时间：新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析样本固定方法：样本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。样本处理标准试剂：样本处理标准试剂：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1.溶解1
3、0g BSA至100ml蒸馏水中2.4C，20000 g离心30分钟3.分装后-20C保存二、0.1%BSA-PBS缓冲液 1.准备500ml，PH7.3 PBS2.加入5ml 10%BSA3.使用0.45um滤网过滤三、氯化铵溶血剂 1.在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2.调节PH值至7.23.在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤方法一：溶血法方法一：溶血法1.取取100 ul抗凝全血；抗凝全血；2.快速加入快速加入 2ml NH4CL溶血剂溶血剂,混匀；混匀；3.室温孵育室温孵育10分钟；分钟；4.4C，400g离心离心10分
4、钟。去上清，加入分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；5.4C，400g离心离心10分钟。去上清，加入分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS；6.4C，400g离心离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。富集白细胞富集白细胞注：注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于），基于NH4CL的的BD公司的公司的FACSLyse溶血剂。溶血剂。优点：优点：溶血时间快？，在流式细胞仪上可清楚地溶血时间快？，在流式细胞仪上可清楚地将淋巴、单核、粒及
5、红细胞碎片相区分。将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。缺点：缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，随时间细胞形态变化大。随时间细胞形态变化大。方法二：密度离心法提取单个核细胞方法二：密度离心法提取单个核细胞 Histopaque 1077为为Ficoll与与Sodium diatrizoate(泛影酸钠泛影酸钠)混合物，其密度为混合物，其密度为1.1191.077。通过离心可将全血中的粒。通过离心可将全血中的粒细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.1191.077的血浆的血浆层，而单个核细胞则在层，而单个
6、核细胞则在1.077以下的血浆层中。以下的血浆层中。1.准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量），等量PBS稀释；2.准备1ml Histopaque 1077(Sigma)；3.室温下700g离心30分钟；4.仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；5.加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟；6.加2ml BSA-PBS清洗2次。操 作 淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。便可。从组织获取淋巴细胞从组织获取淋巴细胞1.将样本置
7、于陪替氏培养皿，加入将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS；2.将样本切成将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；大小，用镊子将其分离；3.将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。方方 法：法：其他标本：其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。制备大鼠肾脏浸润细胞制备大鼠肾脏浸润细胞解剖刀、解剖刀、CO2孵育箱、滤网孵育箱、滤网以及含以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）胶原酶的细胞培养液（无
8、血清）材料：材料：方方 法：法：1.将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块；2.加入加入10ml胶原酶溶液，胶原酶溶液，37C CO2培养箱孵育培养箱孵育30分钟；分钟；3.滤网过滤；滤网过滤；4.密度梯度法离心提纯淋巴细胞。密度梯度法离心提纯淋巴细胞。其他类型细胞其他类型细胞 在组织中提取细胞通常使用在组织中提取细胞通常使用酶消化法酶消化法。同样对于不。同样对于不同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、鼠上皮细
9、胞。鼠上皮细胞。材材 料料1.解剖刀解剖刀2.0.15%胰蛋白酶胰蛋白酶3.Hankss缓冲盐或缓冲盐或PBS，pH7.34.不含不含Ca、Mg离子的离子的HBSS5.II型胶原酶型胶原酶6.1%BSA或或5%FBS7.5ml的吸样管的吸样管8.35um尼龙滤网尼龙滤网9.DNase1.将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离；2.HBSS或PBS洗清3.加入10ml无Ca、Mg离子0.2%II型胶原酶溶液0.02%DNase 1的HBSS；4.37C摇床上孵育1560分钟，视样本类型而定；操操 作作5.用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬
10、液；6.使用35um滤网过滤，300g离心5分钟；7.用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步；8.用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬，37C孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。细胞培养细胞培养 许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。准备单细胞悬液准备单细胞悬液1.仪器和试剂：仪
11、器和试剂：0.25%r EDTA,pH 7.20.25%的胰酶的胰酶 10%血清的培养液血清的培养液2.方法：方法：a.PBS洗涤细胞；洗涤细胞；b.加入加入0.25%有胰酶，有胰酶，37C处理处理28分钟；分钟；c.倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。血清的培养液。d.PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为液洗涤细胞，最后配成终浓度为1106/ml 的细胞悬液。的细胞悬液。样 本 处 理抗体染色一般方法 外周血白细胞分析：100ul全血 血小板分析：15ul全血（根据样本血小板数量）红细胞分析：1ul全血（根据样本中
12、红细胞数稀释后使用）骨髓：100ul 其他样本，计数后决定使用体积目标细胞数量及检测终浓度：目标细胞数量及检测终浓度：1106/ml细胞计数方法 传统手工计数：耗时、准确度差 流式细胞仪计数：BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度反应体积 样本中加完抗体后，1106细胞反应体积应不小于100ul。抗体染色抗体染色 最为普通的抗体染色原则：最为普通的抗体染色原则：1106细胞对细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐抗体（抗体供应商所推荐使用单位），此浓度使用单位），此浓度90%处于过饱合状态处于过饱合
13、状态精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到精确使用：滴定抗体，抗体对于抗原恰达到饱合浓度饱合浓度SPECIFIC ANTIBODYNON-SPECIFIC ANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNT BOUND抗体滴定原理抗体滴定原理流式细胞仪抗体滴定方法流式细胞仪抗体滴定方法33 gs/n=2.51 gs/n=2.10.3 gs/n=2.40.1 gs/n=4.10.03 gs/n=4.80.01 gs/n=4.60.003 gs/n=3.50.001 gs/n=3.2auto65432100102030405060DilutionSignal to NoiseTITER孵育、溶
14、血、固定 抗体孵育：室温下避光抗体孵育：室温下避光15分钟（某些情况下如：细胞分钟（某些情况下如：细胞内因子检测需冰育）内因子检测需冰育）溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）溶血：如样本含中有红细胞需溶血（见下页）样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间样本溶血后需立即上机检测，固定后可放置较长时间白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：1，100ul外周血，加入100ul溶血剂2，混匀后，室温下孵育10分钟3，加入2ml蒸馏水，混匀后室温下孵育10分钟4，根据实验需要，免洗直接上机检测或400g离心10分钟后PBS重悬优点：试剂为温和型溶血剂，不影响细胞表面抗原及
15、溶血时间无需精确把握各各溶溶血血剂剂性性能能比比较较抗体标记荧光素及其他荧光染料 荧光激发及发射原理能量级激发激发态发射激光能量损失标记抗体常用荧光素 FITC 激发光：488nm 发射光：525nm;使用面最广，价格便宜Alexa Green具有更佳的能量转移效率及更纯的发射光谱PE 激发光488nm 发射光575nm 此荧光的激发效率最佳，故此荧光得到的信号最强 检测某些弱表达的抗原，推荐使用此荧光素 价格较FITC昂贵PE-Cy5 TC 激发光488nm,发射光667nm为复合荧光素，荧光激发较率较高，信号强FTIC、PE、PE-Cy5三者为流式细胞最为常的荧光，并经常将三者共同使用进行
16、三色分析PE-Cy7 激发光488nm，发射光767nm 为复合荧光素，2000年后被开发出来，激发效率佳 与前三者联进可进行单激光四色分析（488nm），光谱之间影响较小APC 激发光633nm，发射光660在配有双激光的流式细胞仪上，此荧光染料与FITC、PE、PE-Cy5联用做四色分析。但现在因单激光四色可实现，故使用该染料意义不大。核酸染料染料激发光发射光光源Propidium Iodide495342639488Ethidium biromide4933206374887-Aminoactinomycin D546647514488Acridine Orange503 530(DNA
17、)488640(RNA)Chromomycin A3430580457Hoechst 33342395450UVDAPI372456UVPyronin Y545565514488Thiazole Orange509533488YO-PRO-1642661488TO-PRO-3642661630LDS 751543712488细胞膜电位、离子、脂类探针 现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针，运用这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能，可实现一些异想不到的效果。详细信息，见细胞探针公司网站：www.molecularP与流式细胞仪相关的荧光术语 MESF（Molec
18、ules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性荧光分子：国际标准单位，用来衡量荧光强度 自发荧光：细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF，血小板及其他颗粒自发荧光更低 流式细胞仪精度：分析白细胞要求精度在1000MESF以内，分析其他细胞或颗粒需要更高的精度：300MESF以内第二部分流式细胞仪使用一般方法及技巧流式细胞仪使用一般方法及技巧上机检测 样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测 打开流式细胞仪：预热及进行质控程序 选择相应的方案或新建方案 加载或重新调节各参数 上样检测技巧一：定位目标细胞群
19、体 寻找细胞群：如标本为外周血，在FS/SS散点图中信号最强的为粒细胞，依次为单核、淋巴、红细胞碎片。要寻找淋巴细胞，可首先调低FS/SS电压定位粒细胞后逐步调高电压依次寻找各细胞群。使用目标群所特有的表面标志物结合SS信号，可最快、最特异性地定位目标细胞群 如标本中无明显特征细胞群，可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群技巧二：阴性对照阴性对照作用：调节PMT电压；设立阴、阳性界线使用抗体相应同型荧光免疫球蛋白作为阴性对照，注对照及抗体需出自同一厂家（检测一过性样本中的某些指标）使用对照组样本作阴性对照（与其他实验中对照组含意相同，但此时仍需使阴性对照初始化仪器）对与非抗体染色
20、，如各类核酸染料或探针：PI、ANNEXIN-V。使用空白标本作为阴性对照，或设立阳性对照。技巧三：常见故障及解决时刻注意鞘液及废液桶液量，熟悉仪器各类报警信号通过软件操作仪器，很少能引起仪器硬件固障如样本中有可见颗粒，建议过滤后再检测如仪器经常不使用，管道会结晶、长菌、堵塞、漏气，此时叫工程师便可解决如仪器出现硬件故障，通常是仪器自身问题，与操作者无关技巧四：检测指标检测前要清楚地知道：除阳性百分比指标外，还有荧光强度指标。后者往往比前者更有意义检测时，灵活应用放大模式：线性或对数（如指标相差不大，使用线性放大，如：SS、FS；一般荧光参数使用对数放大）灵活运用门的逻辑关系及颜色示踪功能，可
21、使检测结果更为明了合理选择不同的荧光素标记试剂，以最少的投入获取最多的信息荧光补偿：极其重要的操作FITC与PE调与未调补偿FL1FL2补偿调节原理补偿调节原理双色荧光补偿调节标准方法：第一步 IgGFITC/IgGPE 通过调节电压使阴性群体落在FTIC 及PE 双阴性区注在注在 进行调补偿时必须将原补偿全部归零进行调补偿时必须将原补偿全部归零双色荧光补偿调节标准方法：第二步 FITC 标记抗体/IgGPE双色荧光补偿调节标准方法：第三步 通过补偿设置按钮增、减补偿百分数因为：所以：注意！用来调节补偿的FITC、PE抗体必须有明显的阳性信号，否则就不会出现荧光渗漏现像，调节补偿也无从入手。在
22、正式数据采集前要调整好补偿，一旦数据被获取，BD、Coulter仪器无法再改变补偿 partec流式细胞仪提供软件调节补偿技术，无论何时都可重新调节 多色荧光补偿调节方法同双色法复杂方案分析 了解流式仪胞仪各参数的意义 熟悉设门操作 开扩思路，灵活设计各种检测方案流式细胞仪CD34阳性干细胞计数标准方案：ISHAGE 背景知识：外周血现已被广泛地被用作骨髓移植癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞Hemotopoietic Progenitor Cells HPC 的来源外周血源性干细胞现主要被运用自体移植其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。运用流式细胞仪可最早监测外周血中是否
23、有足够的干细胞供采集。由于此类样本中，碎片、血小板、聚集物对检测结果影响较大，故设计了ISHAGE方案去除这些影响。CD34计数中的问题溶血剂：避免溶血时间过长，处理完成后将样本置于冰水中，将降低溶血剂继续作用的效果。另溶血后染色/染色后溶血效果各有不同。有些样本可能存在某些特殊问题血小板可能会与CD34+或CD34-细胞结合影响精确计数这个问题可通过增加EDTA来解决聚集的血小板可能会与CD34 CD45 抗体微弱结合但可通过巧妙的设门方案将其去除样本保存：血小板聚集问题，细胞死亡问题，冻存液如DMSO对样本的影响抗体选择：荧光素对抗体结合的影响阴性对照：在用CD34 抗体染色的标本中目标细
24、胞群可能少于总细胞群的0.1%而只有目标细胞群大于1%时才合适用同型作为阴性对照。需使用多参数设门来确定阴性对照收集标本数：由于CD34+细胞一般只占1%整单个核细胞固可将其视作泊松分布曲线如要得到一个变异系数为10%左右值就要采集100 个阳性细胞。第一步 一个门R1是基于CD45/SSC 双参数图上的通过对其设门可去除红细胞碎片和聚集物这些干扰在造血细胞样本中尤为多见特别是在样本使用溶血-免洗法处理后第二步 将通过R1 门获取的细胞显示在CD34/SSC 双参数点图在此图中设立R2 门并调节其位置包含所有CD34 强阳性或弱阳性的并SSC 信号弱及中等的细胞第三步 建立一CD45/SSC
25、双参数点图将以上CD34 阳性细胞显示于其中在其中设门R3 门去除CD34 阳性颗粒中的聚集血小板淋巴细胞和单核细胞第四步 将R3 门中圈定的细胞显示在FS/SS 图中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞门R4 中通过R4 要去除比淋巴细胞小的颗粒第五步 如何确定R4 门的位置呢？方法如下在CD45/SSC 双参数点图中设立R5 门圈定CD45 强阳性且SSC 低信号的淋巴细胞群体将R5 门中的细胞显示在R4 门所在的FS/SS 双参数直方图中根据其中的淋巴细胞的位置调节R4门确定R4 门在FS 和SS 轴上最小值的最低范围第六步 R1 门在CD45 从标的下限则根据以下直方图来确认建立第5
26、张CD45/CD34 双参数直方图根据CD34 阳性颗粒的CD45 表达的最小值建立十字门确保所有CD34 阳性CD45极弱表达的细胞全部在CD45 设定界线的左侧然后根据此进的CD45 界线位置确定R1 门的最小值第七步绝对计数：对于普通流式细胞仪在样本中加入标准微球，校准流式细胞的计数，从而得出干细胞的浓度Partec流式细胞仪所有检测指标均为绝对计数，无需校准微球，计数过程由硬件完成。阴性对照 对于阳性细胞数很少的样本，如何建立有效的阴性对照是值得考虑的问题流式细胞仪数据保存及分析 所有商业流式细胞仪样本分析结果数据包均以FCSII格式保存 无论操作平台是DOS、Windows、MAC，
27、流式数据文件均可被自由拷贝 流式数据包含有各项参数信息及分析颗粒信号信息功能强大的免费分析软件：PC版 WinMDI提供流式软件分析所需的所有功能，运行在Windows平台 可在任何PC机上分析流式数据并输出报告 下载：临床流式细胞仪应用简介 以下将简单地、举例性地介绍流式细胞可开展的部分项目。只须掌握了流式细胞仪的原理及操作软件，您可开展任何基于荧光技术的检测项目 流式细胞仪是一种任您自由展开想像力的、非凡的检测工具DNA倍体分析：DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关
28、系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。乳腺癌DNA异倍体患者生存率 DNA倍体分析中，S期的含量也是评估疾病预后的重要指标DNA倍体的诊断标准 1.发现发现DNA 非整倍体细胞峰诊为癌非整倍体细胞峰诊为癌 2.如无明显的非整倍体细胞峰便有一个突出的四倍体如无明显
29、的非整倍体细胞峰便有一个突出的四倍体细胞峰和大于细胞峰和大于15%的超二倍体细胞的超二倍体细胞S 期细胞并伴期细胞并伴G0/1 峰的峰的CV 值大于值大于9%诊为癌诊为癌 3.无明显的非整倍体细胞峰但无明显的非整倍体细胞峰但G0/1 峰峰CV值增大并伴有值增大并伴有大于大于10-15%超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰位诊超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰位诊为可疑癌为可疑癌检测是结合肿瘤标记物，特异性地分析肿瘤细胞的检测是结合肿瘤标记物，特异性地分析肿瘤细胞的DNADNA含量有助于提高诊断的准确率。含量有助于提高诊断的准确率。细胞生存能力实验，使用Heochest 33342染料与DNA特异性结
30、合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片计数外周血中检测网织红细胞：使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的信噪比。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm滤光片，液量绝对计数系统网织红细检测 网织红细胞数量可作为贫血及治疗效果的监测。1 10 01 11 10 02 21 10 03 31 10 04 4T Th hi ia az zo ol le e O Or ra an ng ge e -1 10 01 11 10 02 21 10 03 31 10 04 4F FS SC C-H
31、He ei ig gh ht t -RBCsReticulocytesPlateletsNucleatedCellsIRFPlatelet Associated Ig PA Ig血小板自身抗体检测 血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片与网织血小板同时检测可时，两者均为阳性时提示为自身免疫性贫血 移植交叉配型：原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆
32、反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片细胞毒实验检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应：淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm滤光片细胞增殖状态检测：核增殖抗
33、PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5标记细胞表面标志物。仪器要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片检测细胞内因子（TH1/TH2细胞检测）：未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少用流式细胞仪很难检测出来因此在检测前需刺激活化活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin 淋巴细胞在刺激素的作用下活化分泌细胞因子到细胞外因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测如细胞因子分泌到细胞外则检测不
34、到因此必须阻止细胞因子的分泌抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或Monensin。Th1/Th2 细胞首先是CD4+T 细胞因此存在着用CD4 来设定细胞群的问题我们知道CD4 不但在T 细胞上表达还在所有的单核细胞上表达因此单独用CD4 设门无法将CD4+T细胞区分开来那么我们用CD3 和CD4 双参数设门是否可以呢回答是否定的因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调甚至完全丧失所以不适合于设门用CD3 和CD8 设门因CD8 不受佛波脂的影响且绝大多数D3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T 细胞群。FITC标记C
35、D8，PE标记IL-4和，PE-CY5标记IFN-r，APC或PE-CY7标记CD3。仪器要求：488nm或633nm（仅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm滤光片染色体分析：流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合；Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。仪器要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm滤光片
36、BrdUrd标记追踪细胞分化：通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们。在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G1、S、G2、M期的细胞，在肿瘤研究中有着重要作用。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片淋巴细胞亚群分析：外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片，液量绝对计数系统 白血病免疫分型：CD45设门三色白血病免疫分型。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。血小板分析：血小板活化实验、血
37、小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统血小板分析：血小板活化实验、血小板功能分析。血小板识别抗体及相应活化指标。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测：根据初诊免疫分型结果，多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞，监测白血病的复发。T系白血病微小残留病灶检测仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统B系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统仪器要求：488nm光源，525nm、575nm
38、、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。髓系白血病微小残留病灶检测，液量绝对计数系统仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片。最少三色荧光，参数越多检测越为灵敏。血小板活化实验要求减少血小板聚集聚集血小板在流式细胞仪可被检测出来但是如果血小板发生了聚集流式细胞仪便不能检测聚集血小板中每个血小板所表达的抗原数量了这是因为流式只检测每个颗粒的表达荧光而无法区分这个颗粒单个血小板还是由一定数量血小板聚积而成在准备全血标本时可依据以下标本处理方法使血小板聚集现象减到最低对于每个样本都要监测血小板的聚集情况聚集血小板往往会出现在FS 和SS 坐标中右上象限内减少
39、全血标本中血小板聚集的标本处理方法 在抽血前准备好所有在标本处理过程中所需试剂以避免延误时间 抽血时针管不要细于21 号 平稳放松地抽取血液 弃用前2ml 血液 使用聚乙稀试管或针筒 立即与抗凝剂混匀 不要进行洗涤离心过滤晃动等巨烈的处理步骤 加入缓冲液稀释血小板浓度 如果要使用凝血酶作为激活剂则在其中要加入肽GPRP固定检测血小板活化都需要限制血小板自身的或被激活的体外活化通过抗激活药物肌苷潘生丁或固定方法通常使用多聚甲醛都可限制血小板自发或被动活化固定或许会破化某抗原与单抗结合的位点如用福尔马林固定标体还会引起血小板的自发荧光所以在检测中选用恰当的阴性对照此外固定的标本中不应存在未结合的抗
40、体这会引起非特异性结合建议先将标本与抗体孵育洗去未结合抗体后固定然而这会在处理过程引起额外的血小板活化并且这很难控制对血小板进行固定对于临床不能立即上流检测的标本来说是极为有利的方法固定可以减少血小板在体外的人为活化对于绝大多数抗体来说使用染色后再固定的方法进行处理的标本立即上机检测与在24 小时内分析在荧光强度上没有明显差异并且固定前染色方法并立即上机检测与固定后24 小时内染色分析在荧光强度上也没有明显差异然而要注意因固定方法而对标本引起的变化特别是使用固定前染色的单抗时因为对于检测血小板活化依赖性单抗与固定后的血小板结合率会有下降此外有些单抗与固定后的血小板结合率会表现出时间相关性减少所
41、以每个实验室在使用种新抗体时必须选择最恰当的固定方法细胞凋亡分析：DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm滤光片肿瘤耐药分析：P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片 强直性脊柱炎诊断：检测淋巴细胞B27表达强度及百分比，诊断强直性脊柱炎。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片 PNH诊断：外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD55、CD59表达强度或百分比，确诊夜间阵发性血红蛋白尿。仪器要求：48
42、8nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片B27检测时常用的单抗Beckman Coulter 公司生产B7/B27 双标试剂用于B27 的检测其中B27 抗体的克隆号为ABC-m3 这个抗体与B7 基因有强烈的交叉反应同时与B37 B38 和和B39 有交叉反应因此在这个试剂盒中使用B7 去除B27 与B7 之间的交叉由于中国人群的B7 等位基因等位基因阳性率要大于B27 的阳性率的阳性率固在大多情况下可测得B7 B27 双阳性的标本而无无B27 单单阳性标本此时应作阳性标本此时应作B27 阴性标本处理还会出阴性标本处理还会出B27 单弱阳性情况出现可能是由于单弱阳性情况出现可能是
43、由于B27与与B37 B38 和和B39 之间的交叉但也不能排除之间的交叉但也不能排除B27 弱阳性的可能弱阳性的可能绝大多数情况下B27阳性者其B27 单阳性的荧光强表达此时需要综合临床征症或从遗传学角度分析其家族B27 阳性情况不否有可能出现B27 阳性Rhodamine 123 Efflux检测细胞MDR1耐药蛋白功能耐药调节剂有时也称化疗增敏剂chemosensitizers 可以归纳为六大类1 钙通道阻断剂2 钙调蛋白抑制剂3 醛固酮和激素类似物4 环孢霉素5 潘生丁6 其他药物这些药物在大体结构上有一些类似都是亲脂性的许多是杂环类带阳性电荷的物质这些药物虽然都有各自的作用但他们都可
44、以通过竞争性或非竞争性抑制方式直接抑制P 糖蛋白泵的功能恢复MDR 细胞内药物的聚积起化疗增敏作用一些药物可以直接作为P 糖蛋白的底物竞争性抑制P 糖蛋白这类药物在细胞内很少积聚而另一些药物则是与药物结合位点以外的位点结合如ATP 酶位点磷酸化位点或者通过抑制蛋白激酶C 减少P糖蛋白磷酸化等途径抑制P 糖蛋白功能实际上不少耐药调节剂本身也是蛋白激酶C 抑制剂外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定：使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。流式细胞仪要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片，液量绝对计数系统交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验：检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。仪器要求：488nm光源，525nm、575nm、675nm滤光片CyFlow流式细胞仪介绍PAS流式细胞介绍
