大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养与腺病毒感染细胞-何久香课件.ppt

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1、威斯腾生物技术中心 大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞v(一)大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养v(二)腺病毒感染细胞v(一)大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养v1、实验前期准备v2、脊髓星形胶质细胞的分离v3、脊髓星形胶质细胞的培养v实验前期准备实验前期准备:v 实验器械的高压灭菌v 新生鼠的购买v 培养瓶的包被v (细胞培养前1-2 h,培养瓶用0.1多聚赖氨酸包被,置5C02培养箱中,使用前用DMEM/F12培养基冲洗干净,吸尽所有多余的DMEM/F12培养基后备用于种板)v脊髓星形胶质细胞的分离脊髓星形胶质细胞的分离v1、取新生乳鼠6只,75乙醇皮肤消毒。无菌条件下剪刀断头,打开脊椎

2、后取出脊髓组织并置于盛有DMEM/F12培养基的培养皿中反复冲洗,尽可能洗掉可能附着的表面血细胞。v2、使用眼科镊细致的剥离皮层表面蛛网膜,并取出脊髓,在该过程中可适当撕开软脊膜组织一并去掉脊髓组织深面的血管,随后使用冰预冷DMEM/F12反复冲洗。v3在玻璃培养皿中用眼科剪将脊髓组织剪碎致直径0.3 mm左右小块,在剪碎过程中避免挤压脊髓组织,加入无菌3 ml 0.25胰酶,置37细胞培养箱中消化30 min至浑浊状。v4加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,静置3 min后先用吸管吸去多余液体,再用吸管轻轻地吹打3次,收集细胞悬液,经200目的不锈钢网滤过除去杂质

3、,过滤后的细胞悬液移入10 ml无菌离心管中,然后800 rpm离心7 min。v5弃去上清液,然后每管加入2-3 ml含10胎牛血清的DMEM/F12培养基,接种于培养瓶中,37、5CO2培养箱内孵育60 min,进行差速粘附贴壁处理,以去除成纤维细胞。v6轻轻翻转培养瓶,吸出细胞悬液,种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶;继续在CO2培养箱内培养,接种2-3 d后更换新的无菌培养基,隔2-3 d换新培养液1次。生长8-10 d待细胞融和后,置于37恒温摇床机中,180 rpm,14-16 h。v7丢弃上清液,收集经过摇床震荡后的贴壁细胞,加新鲜培养液继续培养,即可得纯度较高的星形胶质细胞。v脊髓

4、星形胶质细胞的培养脊髓星形胶质细胞的培养v细胞换液v对于贴壁细胞,首先应先吸除培养瓶中旧培养基,用PBS洗23次,补加入新培养基后继续培养或实验。v细胞传代v对于贴壁细胞,首先应先吸除培养瓶中旧培养基,用PBS洗23次,50ml培养瓶加入胰酶消化液约1ml,晃动使消化液铺均匀,置37度培养箱约2-5分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,收集细胞至离心管,1000转/min离心5min,弃上清,加培养液,轻轻吹打成细胞悬液,按照1:2或1:3的比例传代至无菌培养瓶内,加入培养基后继续培养或实验。v(二)腺病毒感染细胞v确定腺病毒的

5、最佳感染滴度v腺病毒感染细胞v确定腺病毒的最佳病毒滴度(确定腺病毒的最佳病毒滴度(96孔板)孔板)v准备细胞:800010000个细胞/孔接种于96孔板v病毒稀释:在离心管中用维持液将病毒液作连续10倍的稀 释,从10-1到10-7v病毒感染:将稀释好的病毒接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一纵排共8 孔,每孔接种100ul;设正常细胞对照(两纵排),只加维持液100ul。v细胞培养:将培养板放置于CO2培养箱(375%CO2),培养5-7天v测定结果:取出培养板,显微镜下观察细胞病变,并用Reed-Muench法 计算病毒的最佳滴度v腺病毒感染细胞腺病毒感染细胞v准备细胞 v准备病毒v感染细胞谢谢 谢谢!本文观看结束!谢 谢欣 赏!

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