1、第第9 9章章 核酸的酶促降解和核苷酸代谢核酸的酶促降解和核苷酸代谢 第一节第一节 核酸的酶促降解核酸的酶促降解第二节第二节 核苷酸的分解核苷酸的分解第三节第三节 核苷酸的合成核苷酸的合成l 核酸酶实质是磷酸二脂酶。核酸酶实质是磷酸二脂酶。l 根据酶对底物的专一性分为根据酶对底物的专一性分为：核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、非核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、非特异性核酸酶。特异性核酸酶。l 根据酶的作用方式分根据酶的作用方式分：内切酶、外切酶。内切酶、外切酶。第一节第一节 核酸的酶促降解核酸的酶促降解 核酸酶核酸酶 核酸核酸 核苷酸核苷酸 3、5-磷酸二酯键一、核糖核酸酶一、核糖核酸酶只水解只水解RN
2、ARNA磷酸二酯键的酶（磷酸二酯键的酶（RNaseRNase）牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶I I（RNaseIRNaseI），），作用位点是嘧啶核苷作用位点是嘧啶核苷-3-3-磷酸与其它核苷磷酸与其它核苷酸间的连接键。酸间的连接键。（内切核酸酶）内切核酸酶）核糖核酸酶核糖核酸酶T1T1（RNaseT1RNaseT1），），作用位点是作用位点是3 3-鸟苷酸与其它核苷酸的鸟苷酸与其它核苷酸的5 5-OHOH间的键。（间的键。（内切核酸酶）内切核酸酶）5 p p p pOHPyPuPyPu1 p p pGACU p p pGA3 RNAase IRNAase IRNAase T1RNAase T1
3、l 只能水解只能水解DNADNA磷酸二酯键的酶。磷酸二酯键的酶。l 牛胰脱氧核糖核酸酶（牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseDNase）：可切割双链和单链可切割双链和单链DNADNA，降解产物为降解产物为3 3-磷酸磷酸为末端的寡核苷酸。为末端的寡核苷酸。l 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：细菌产生的、能识别并特异切割外源细菌产生的、能识别并特异切割外源DNADNA特定特定序列序列中的磷酸二脂键中的磷酸二脂键(对碱基序列专一对碱基序列专一）的核酸）的核酸内切酶。内切酶。二、脱氧核糖核酸酶二、脱氧核糖核酸酶限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型主要特性主要特性 I 型型 II 型型 III
4、型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP Mg2+SAMATP Mg2+SAMMg2+识别序列识别序列TGAN8TGCT回文序列回文序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点切割位点距识别序列距识别序列1kb处处 识别序列内或附近识别序列内或附近距识别序列下游距识别序列下游随机性切割随机性切割特异性切割特异性切割24-26bp处处50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K11410 41
5、0 4E.O.P 成斑率成斑率efficiency of plating限制限制修饰的酶学假说修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点酶切位点不被修饰不被修饰噬菌体噬菌体DNA被切割被切割酶切位点酶切位点被修饰被修饰基因组基因组DNA不被切割不被切割1968年，年，Meselson 和和Yuan发现了发现了I型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶1970年，年，Smith和和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个第一个II型限制性核酸内切酶型限制性核酸内切酶Hind II限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶的类型首先由首先由M.Meselson和和R.Yuan在在19
6、68年从大年从大肠杆菌肠杆菌 B株和株和 K株分离的。株分离的。（1）识别位点序列）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1.I1.I型限制性内切酶型限制性内切酶 如如 EcoB和和 EcoK未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（3 3）作用机理）作用机理在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机切开一条单链。随机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2 2）切割位点）切割位点首先由首先由H.O.Smith和和K.W.Wi
7、lcox在在1970年从流感嗜年从流感嗜血菌中分离出来血菌中分离出来分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind 。（1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰的双链未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列上的特殊靶序列（多数是回文序列）。（多数是回文序列）。与与DNA的来源无关。的来源无关。2.2.II 类限制性内切酶类限制性内切酶 EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端（2）切割位点）切割位点切开双链切开双链DNA。
8、形成粘性末端（。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（或平齐末端（blunt end）。如：）。如：识别位点处。识别位点处。（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：分两种类型：5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCAG 3端凸出（如Pst I切点）GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC 3.III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切
9、割DNA，但反应需要，但反应需要ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。用途不大。用途不大。例：例：Eco R IEco R I是从大肠杆菌（是从大肠杆菌（E.coliE.coli）R R菌珠中分离出的一种限制性内切酶菌珠中分离出的一种限制性内切酶产生产生3-OH和和5-P的末端的末端l 既可水解既可水解RNARNA，又可水解又可水解DNADNA磷酸二酯键的核酸磷酸二酯键的核酸酶。酶。l 小球菌核酸酶（小球菌核酸酶（内切酶），可作用于内切酶），可作用于RNARNA或变或变性的性的DNADNA，产生产生3 3-核苷酸或寡核苷酸。核苷酸或寡核苷酸。l 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二
10、酯酶蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶（外切酶）。（外切酶）。三、非特异性核酸酶三、非特异性核酸酶蛇毒磷酸二酯酶能从蛇毒磷酸二酯酶能从RNARNA或或DNADNA链的游离的链的游离的3-3-OHOH逐个水解，生逐个水解，生成成5-5-核苷酸。核苷酸。牛脾磷酸二酯酶从游离的牛脾磷酸二酯酶从游离的5-5-OHOH开始逐个水解，生成开始逐个水解，生成33核苷核苷酸。酸。第二节 核苷酸的降解核酸酶（磷酸二酯酶）核酸酶（磷酸二酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸嘌呤或嘧啶嘌呤或嘧啶戊糖戊糖-1-磷酸磷酸一、核苷酸的降解一、核苷酸的降解
11、1、核苷酸酶（磷酸单脂酶）水解核苷酸，产生核苷和磷酸。OBOHOHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸 OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸2、核苷磷酸化酶n广泛存在，反应可逆核苷 +磷酸核苷磷酸化酶碱基 +戊糖-1-磷酸 不同生物降解的产物不同 二、嘌呤的降解（人类和灵长类动物）（人类和灵长类动物）（灵长类以外的哺乳动物）（灵长类以外的哺乳动物）尿囊酸酶尿囊酸酶H2O脲酶脲酶2H2O4NH3+2CO2乙醛酸乙醛酸尿素尿素OHNH2尿囊酸尿囊酸（植物）（植物）（鱼类、两栖类）（鱼类、两栖类）（海洋无脊椎动物）（海洋无脊椎动物）脱氨脱氨 氧化氧化 水解
12、水解三、嘧啶的降解脱氨脱氨 还原还原 水解水解一、嘌呤核苷酸的生物合成从头合成途径补救途径二、嘧啶核苷酸的生物合成从头合成途径补救合成途径第三节 核苷酸的生物合成三、脱氧核苷酸的合成 （1）嘌呤环上各原子的来源N3N9N7N1C2C6C4C5C8来自谷氨酰胺的酰胺氮来自谷氨酰胺的酰胺氮来自甲酸来自甲酸来自甲酸来自甲酸来自天冬氨酸来自天冬氨酸来自甘氨酸来自甘氨酸来自来自CO2一、嘌呤核苷酸的生物合成 （AMP、GMP)v合成嘌呤核苷酸，合成嘌呤核苷酸，先合成先合成IMPIMP，再转化再转化为为AMPAMP、GMPGMP 。1、从头合成nIMP的合成是从5-磷酸核糖开始的，先于ATP反应生成5-磷
13、酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），然后嘌呤环的各原子在PRPP的C-1位置上逐渐加上去。（2）IMP的合成的合成5-P核糖核糖ATP AMP5-P核糖核糖-1-焦磷酸焦磷酸 IMP945783612川川nIMP的合成是从5-磷酸核糖开始的，先于ATP反应生成5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），然后嘌呤环的各原子在PRPP的C-1位置上逐渐加上去。5-磷酸核糖+CO2+甲川THFA+甲酰THFA+2Gln+Gly+Asp+5ATP IMP+2THFA+2Glu+延胡索酸+4ADP+1AMP+4Pi+PPi总反应式：（3 3）IMPIMP转变为转变为GMPGMP和和AMPAMP嘌呤核苷 +磷酸核苷
14、磷酸化酶嘌呤碱 +戊糖-1-磷酸2、补救途径 (利用已有的碱基和核苷合成核苷酸)(1)磷酸核糖转移酶途径（重要途径）次黄嘌呤（鸟嘌呤）+5-PRPP次黄嘌呤(鸟嘌呤)磷酸核糖转移酶IMP（GMP)+PPi腺嘌呤 +5-PRPP腺嘌呤磷酸核糖转移酶AMP +PPi 腺嘌呤在核苷磷酸化酶作用下转化为腺嘌呤核苷，后者在腺苷激酶的作腺嘌呤在核苷磷酸化酶作用下转化为腺嘌呤核苷，后者在腺苷激酶的作用下与用下与ATP反应，生成腺嘌呤核苷酸。反应，生成腺嘌呤核苷酸。2、核苷激酶途径（生物体内只发现有腺苷激酶）碱基+核糖-1-磷酸核苷磷酸化酶核苷 +Pi腺苷 +ATP腺苷激酶腺苷酸 +ADP 与嘌呤核苷酸合成不
15、同，在合成嘧啶核苷酸时，首先合成嘧啶环，再与磷酸核糖结合，生成尿嘧啶核苷酸，最后由尿嘧啶核苷酸转化为胞嘧啶核苷酸。二、嘧啶核苷酸的合成1、从头合成从头合成（1）嘧啶环上各原子的来源）嘧啶环上各原子的来源 来自天冬氨酸来自天冬氨酸来自来自CO2来自来自NH3NNCCCC654321氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸（2）尿嘧啶核苷酸的合成）尿嘧啶核苷酸的合成天冬氨酸转氨甲酰酶二氢乳清酸酶二氢乳清酸脱氢酶乳清苷酸焦磷酸化酶Mg2+乳清苷酸脱羧酶 尿嘧啶核苷三磷酸可直接与尿嘧啶核苷三磷酸可直接与NH3（细菌）或细菌）或Gln（动物）动物）反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。UMP +ATP尿嘧
16、啶核苷酸激酶Mg2+UDP +ADPUDP +ATP核苷二磷酸激酶Mg2+UTP +ADPCTP合成酶UTP+Gln（NH4+）+ATP+H2OCTP+Glu+ADP+Pi（3 3）胞嘧啶核苷酸的合成胞嘧啶核苷酸的合成 嘧啶碱与1-磷酸核糖生成嘧啶核苷，然后由尿苷激酶催化尿苷和胞苷形成UMP和CMP。嘧啶碱 +1-磷酸核糖核苷磷酸化酶嘧啶核苷 +Pi尿苷（胞苷）+ATP尿苷激酶Mg2+UMP（CMP）+ADP （2）磷酸核糖转移酶途径（胞嘧啶不行）尿嘧啶磷酸核糖转移酶尿嘧啶 +5-PRPPUMP +PPi2 2、补救途径补救途径（1）嘧啶核苷激酶途径（重要途径）嘌啶核苷酸与嘧啶核苷酸合成的比较
17、相同点1.合成原料基本相同合成原料基本相同嘌啶核苷酸嘧啶核苷酸2.都有从头和补救途径都有从头和补救途径 3.先合成有关的核苷酸先合成有关的核苷酸,再合成核苷酸。再合成核苷酸。不同点1.在在5-P-R基础上合成嘌呤基础上合成嘌呤环环2.最先合成的核苷酸是最先合成的核苷酸是 IMP 3.在在IMP基础上完成基础上完成AMP和和GMP的合成的合成1.先合成嘧啶环再与先合成嘧啶环再与5-P-R结合结合2.先合成先合成UMP3.以以UMP为基础为基础,完成完成CTP,TMP的合成的合成 v脱氧核糖核苷酸是由相应的核糖核苷酸衍生而来的。三、脱氧核苷酸的合成核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶二、核苷酸的生物合
18、成3 3、脱氧核糖核苷酸的生物合成、脱氧核糖核苷酸的生物合成核糖核苷酸还原需要二个氢，其最终的给体是核糖核苷酸还原需要二个氢，其最终的给体是NADPH硫氧还蛋白谷氧还蛋白（1）核糖核苷酸的还原反应）核糖核苷酸的还原反应NADP+NADPH+H+硫氧还蛋白硫氧还蛋白还原酶还原酶FAD核糖核苷酸还原酶核糖核苷酸还原酶（B1和和B2）ATP、Mg2+硫氧还蛋白硫氧还蛋白（还原型）（还原型）SHSH硫氧还蛋白硫氧还蛋白（氧化型）（氧化型）SSOP-P-CH2NOHOH核糖核苷二磷酸核糖核苷二磷酸OP-P-CH2NOHH+H2O脱氧核糖核苷二磷酸脱氧核糖核苷二磷酸ADP、GDP、CDP、UDP腺嘌呤、鸟
19、嘌呤和胞嘧啶核糖核苷酸经还原，将核糖第二位碳原子的氧脱去，即成为相应的脱氧核糖核苷酸。还原反应一般在核苷二磷酸（NDP）水平上进行 由尿嘧啶脱氧核苷酸（dUMP）经甲基化生成。Ser提供甲基，NADPH提供还原当量。（2）胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成）胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成H胸腺嘧啶核苷酸合成酶dUMP+N5,N10-亚甲基THFAdTMP+二氢叶酸二氢叶酸还原酶7，8-二氢叶酸+NADPH+H+5，6，7，8-THFA+NDAP+Ser羟甲基转移酶Ser +THFAGly+N5,N10-亚甲基THFA+H2O 四氢叶酸是一碳的载体，参与嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸的合成。氨基蝶呤、氨甲蝶呤是叶酸的类似物，能与二氢叶酸还原酶不可逆结合，阻止FH4的生成，从而抑制FH4参与的一碳单位的转移。三、三、核苷酸合成总结核苷酸合成总结
