1、1 1 1 1 遗传变异的物质基础基因突变和诱变育种基因重组和杂交育种（自学）基因工程菌种的衰退复壮和保藏内容提要内容提要1 第七章第七章 微生物遗传与菌种选育微生物遗传与菌种选育理想的工业发酵菌种应符合以下要求理想的工业发酵菌种应符合以下要求遗传性状稳定；遗传性状稳定；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；生长速度快，不易被噬菌体等异种微生物污染；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物的产量尽可能接近理论转化率；目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制目标产物最好能分泌到细胞外，以降低产物抑制并利于分离；并利于分离；尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标尽可能减少产物类似物的产量
2、，以提高目标产物的产量并利于分离；产物的产量并利于分离；培养基成分简单、来源广、价格低廉；培养基成分简单、来源广、价格低廉；对温度、对温度、pHpH、离子强度、剪切力等环境因素离子强度、剪切力等环境因素不敏感；不敏感；对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。理想的工业发酵菌种应符合以下要求理想的工业发酵菌种应符合以下要求微生物是遗传学研究的最好材料和对象微生物是遗传学研究的最好材料和对象1 1、微生物结构简单、微生物结构简单2 2、营养体一般都是单倍体、营养体一般都是单倍体3 3、微生物繁殖速度快、微生物繁殖速度快6 6、存在多种方式的繁殖类型、存在多种方式的繁
3、殖类型 5 5、环境条件对微生物作用直接均匀、环境条件对微生物作用直接均匀 4 4、易积累不同的中间及最终代谢产物、易积累不同的中间及最终代谢产物7 7、微生物的变异易被识别、微生物的变异易被识别8 8、参与基因工程的载体、供体、受体三种角色、参与基因工程的载体、供体、受体三种角色研究微生物遗传学的意义 遗传型遗传型 又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因又称基因型，指某一生物体所含有的全部遗传因子即基因的总和的总和。表表 型型 指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。是遗传型在合适环境下的
4、具体体现。遗传型遗传型+环境条件环境条件 表型表型 变变 异异 生物体在某种内因或外因的作用下，引起的遗传物质结构生物体在某种内因或外因的作用下，引起的遗传物质结构或数量的变化。或数量的变化。变异的特点变异的特点：在群体出现的几率极低（：在群体出现的几率极低（10-5-10-10），），变化后的新性状可遗传。变化后的新性状可遗传。饰饰 变变 不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上不涉及遗传物质结构变化，而只发生在转录、转译水平上 的表型变化。的表型变化。表表 型型 饰饰 变：变：表型的差异只与环境有关，表型的差异只与环境有关，特特 点：点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个暂时性、不
5、可遗传性、表现为全部个体的行为体的行为Production of a red pigment(prodigiosin)by Serratia marcescens.From left to right:slant culture grown at 25C,slant culture grown at 37C,broth culture grown at 25C,broth culture grown at 37C.例如：粘质沙雷氏菌：例如：粘质沙雷氏菌：在在2525下培养，产生深红色的灵杆菌素；在下培养，产生深红色的灵杆菌素；在3737下培养，不产生色素；如果重新将温度降到下培养，不产生色素；
6、如果重新将温度降到2525，又恢复产色素的能力。，又恢复产色素的能力。斜面培养斜面培养液体培养液体培养第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础n种质连续理论：种质连续理论：1883188318891889年间年间WeissmannWeissmann提出。提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。F CrickF Crick在研究在研究DNADNA双螺旋结构双螺旋结构n基因学说：基因学说：19331933年摩尔根（年摩尔根（Thomas Hunt MorganThomas Hunt Morgan）发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直
7、线排列，发现了染色体，并证明基因在染色体上呈直线排列，提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到提出了基因学说，使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。染色体上。nDNADNA是遗传变异的物质基础的证明：是遗传变异的物质基础的证明：19441944年以后，先年以后，先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验n肺炎球菌的转化试验肺炎球菌的转化试验n噬菌体感染试验噬菌体感染试验n病毒的拆开与重建试验病毒的拆开与重建试验 人们普遍接受核人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。酸才是真正的遗传物质。三个经典实验证明核三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质酸是微生物
8、遗传物质转化实验转化实验噬菌体感染实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式一、一、3个经典实验个经典实验光滑型（光滑型（S S）粗糙型（粗糙型（R R）有有 荚荚 膜膜菌落光滑菌落光滑分泌毒素分泌毒素致致 病病无无 荚荚 膜膜菌落粗糙菌落粗糙无无 毒毒不不 致致 病病实验材料：实验材料：肺炎双球菌肺炎双球菌（一）转化实验（一）转化实验说明说明：加热杀死的加热杀死的 S 型细菌中有一种具有遗传型细菌中有一种具有遗传转化能力的物质，它通过某种方式进入转化能力的物质，它通过某种方式进入 R 型细胞，型细胞，并使
9、并使 R 型细菌获得表达型细菌获得表达 S 型荚膜形状的遗传特性型荚膜形状的遗传特性1928年年Griffith进行的细菌转化实验进行的细菌转化实验n加加S菌菌DNAn加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶n加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶n加加S菌的菌的RNAn加加S菌的菌的蛋白质蛋白质n加加S菌的菌的荚膜多糖荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌 1944年年O.T.Avery、C.M.MacLeod和和M。McCarty从热从热死死S型型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了分，并在离体条件下进行
10、了转化试验转化试验：只有只有S型细菌的型细菌的DNA才能将才能将S.pneumoniae的的R型转化为型转化为S型型且且DNA纯度越高，转化效率也越高。纯度越高，转化效率也越高。说明：说明：S型菌株转移给型菌株转移给R型菌株的型菌株的DNA是遗传因子。是遗传因子。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验（p188）蛋白质蛋白质 只含只含S不含不含PDNA只含只含P不含不含S原理原理步骤步骤1：用含同位素：用含同位素35,P32的培养基分别培养大肠杆菌的培养基分别培养大肠杆菌2：让：让T2感染上述大肠杆菌使其打上感染上述大肠杆菌使其打上S35、P32标记标记（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实
11、验Hershey（1）含）含32P-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以3 35 5S S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验（2）含）含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉
12、淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性n为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含用含RNA的烟草花叶病毒（的烟草花叶病毒（TMV）进行进行了著名的植物病毒重建实验。了著名的植物病毒重建实验。n将将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的核心相分离。分离后的RNA在在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症
13、状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验（p189）植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 甲乙甲乙r r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲乙甲r r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 TMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆拆 开开 重重 建建 感感 染染 分离纯化分离纯化 植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 遗传物质类型核染色体核染色体核外染色体真核生
14、物细胞器原核生物质粒二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式核外核外DNA的种类的种类真核生物的真核生物的“质粒质粒”原核生物的原核生物的质粒质粒线粒体线粒体细胞质基因细胞质基因叶绿体叶绿体中心体中心体动动 体体共生生物：卡巴颗粒共生生物：卡巴颗粒酵母菌的酵母菌的2 m质粒质粒F因子因子R因子因子Col质粒质粒Ti质粒质粒巨大质粒巨大质粒降解性质粒降解性质粒（一）核酸存在的（一）核酸存在的 7 个水平及质粒个水平及质粒v细胞水平：细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核存在于细胞核或核质体，单核或多核v细胞核水平细胞核水平:原核与真核生物的细胞核结构不同，核外原核与真核生物的细胞核结构不同
15、，核外 DNAv染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数v核酸水平：核酸水平：在原核中同染色体水平、存在部分二倍体在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或或RNA，复合或裸露，双链或单链复合或裸露，双链或单链v基因水平：基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信 息量，转息量，转录录翻译翻译v密码子水平：密码子水平：信息单位信息单位,起始和终止起始和终止,v核苷酸水平：核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基突变或交换单位，四种碱基染色体染色体基因基因基因基因DNA基因是一段基因是一段DNADNADNA就是脱氧核糖核酸（长链）
16、就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（胞嘧啶（C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序基因测序就是读出就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.基因控制基因控制Pr因而控制性状因而控制性状G A TC T AG A UDNAmRNA天冬天冬氨酸氨酸 基因是什么？基因是什么？基因决定生物体的生、长、病、老死等一切生命现象 基因是生命的密码。基因记录和传递遗传信息。大肠杆菌基因组4100个基因，4.7106bp遗传信息的连续性功能相关的结构基因组成操纵子结构基因单拷贝及rRNA多拷贝基因的重复序列少而短酵母菌
17、基因组染色体长度Kb基因数12345678染色体长度Kb基因数439745666107892478410929482304231738142921365732912313873345504874215714991310271310331110241622211520174原核生物基因调控系统原核生物基因调控系统（p193）操纵子操纵子RP O结构基因结构基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因调节调节基因基因（二（二)原核生物的质粒原核生物的质粒 （p194p194）功能：功能：带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等，并
18、可进行细胞间转移。解功能等，并可进行细胞间转移。结构与大小：结构与大小：质粒通常以共价闭合质粒通常以共价闭合环状的超螺旋双链环状的超螺旋双链DNADNA分子状态存在于分子状态存在于细胞中。细胞中。约为约为1 11000kb1000kb，上面携带有，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。数个到数十个甚至上百个基因。定义：定义：存在于细菌、真菌等微生物细存在于细菌、真菌等微生物细胞中，独立于染色体外，能进行自主胞中，独立于染色体外，能进行自主复制的遗传因子。复制的遗传因子。质粒质粒 核外环状小型核外环状小型DNA独立复制稳定遗传独立复制稳定遗传F因子因子 与有性接合有关与有性接合有关种类种类 R因
19、子因子 与抗药性有关与抗药性有关COL 编码免疫蛋白编码免疫蛋白Ti质粒质粒 诱癌质粒诱癌质粒降解性质粒：编码降解有害物质的酶降解性质粒：编码降解有害物质的酶用途用途 基因工程中作为目的基因载体基因工程中作为目的基因载体质粒质粒原核生物遗传物质原核生物遗传物质存在的另一种方式存在的另一种方式基 因 突 变突变与育种第二节 基因突变和诱变育种突变的特点 基因突变诱变机制 突变率突变类型 条件致死突变型（株）（一）突变类型 突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型（株）抗性缺陷型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）按方法分：按突变株的表型是否能在选择 性培养基上加以鉴别来
20、区分。微生物突变体的主要类型微生物突变体的主要类型形态突变型 生化突变型营养突变体(营养缺陷型)发酵突变体抗性突变体条件致死突变体抗原突变型产量突变型按突变按突变实质分实质分u营养缺陷型营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。野力，必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。野生型和缺陷型分别用生型和缺陷型分别用+、-表示，如分别用表示，如分别用hishis+和和hishis-表示组氨表示组氨酸野生型和缺陷型。酸野生型和缺陷型。u抗性突变型抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物因突变而产生了对某种
21、化学药物或致死物理因子的抗性。抗性和敏感型分别用理因子的抗性。抗性和敏感型分别用r r和和s s表示，如用表示，如用strstrr r和和strstrs s分别表示链霉素抗性和敏感性。分别表示链霉素抗性和敏感性。u条件致死突变型条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型。（温度敏感（温度敏感突变株突变株t ts s）u形态突变型形态突变型细胞形态变化或菌落形态变化。如菌落颜细胞形态变化或菌落形态变化。如菌落颜色变化，菌体失去荚膜、鞭毛等。色变化，菌体失去荚膜、鞭毛等。（三)基因突变
22、的特点（p200）不对应性 自发性 稀有性 独立性诱变性稳定性 可逆性 基因（自发）突变的特点：基因（自发）突变的特点：自发性：自发性：是不经诱变剂处理而自然发生的突变。是不经诱变剂处理而自然发生的突变。突变率：突变率：每一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的每一个细胞在每一世代中发生某一特定突变的几率。几率。突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数稀有性稀有性：突变率突变率低且稳定。低且稳定。不对应性不对应性：突变的发生与环境因子之间无直接的对应：突变的发生与环境因子之间无直接的对应关系。关系。若干细菌某一性状的自发突变率若干细菌某一性状的自发突变率n菌菌 名名
23、突变性状突变性状突变率突变率nE.coliE.coli抗抗T1T1噬菌体噬菌体3 3 10108 8nE.coliE.coli抗抗T3T3噬菌体噬菌体1 1 10107 7 nE.coliE.coli不发酵乳糖不发酵乳糖1 1 10101010nE.coliE.coli 抗紫外线抗紫外线1 1 10105 5nStaphylococcus aureusStaphylococcus aureus 抗青霉素抗青霉素1 1 10107 7nS.aureusS.aureus 抗链霉素抗链霉素1 1 10109 9 nSalmonella typhiSalmonella typhi抗抗2525 g/Lg
24、/L链霉素链霉素1 1 10106 6 nBacillus megateriumBacillus megaterium 抗异烟肼抗异烟肼5 5 10105 5可逆性可逆性：从原始的野生型基因到变异株的突变称为从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变正向突变（forward mutationforward mutation），），从突变株回到野生型的过程则称为从突变株回到野生型的过程则称为回复突变或回变回复突变或回变（back mutationback mutation或或reverse mutationreverse mutation）。）。独立性独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。：
25、各种突变独立发生，不会互相影响。可诱发性可诱发性：诱变剂可提高突变率。：诱变剂可提高突变率。稳定性稳定性：变异性状稳定可遗传。：变异性状稳定可遗传。（四）基因突变自发性和不对应性的证明（四）基因突变自发性和不对应性的证明变 量 试 验 涂 布 试 验 影印培养试验 变量实验（变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）Salvador LuriaMax DelbruckThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小
26、管)(在同一个大管中作整体培养)2 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数变量试验变量试验 涂布试验 涂布敏感菌5104个共12个平板5104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后 喷入T1保温6个平板共353个菌落 6个平板共28个菌落涂布试验中突变率的计算涂布试验中突变率的计算初始接种量：初始接种量：5 5 10 104 4 个个/皿皿培养培养5 5小时，繁殖了小时，繁殖了12.312.3代，每个微菌落约含代，每个微菌落约含51005100个细菌个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：这时，每个平皿上的细胞数为：5100 5100 5 5 10 104 4 2.6
27、2.6 10108 8个个/皿皿在在6 6个平板上，比接种时增加的细胞数为：个平板上，比接种时增加的细胞数为：6 6（2.6 2.6 10 108 8 5 5 104 104）=15.6=15.6 10108 8在未涂布的平板上共发现在未涂布的平板上共发现2828个突变，故个突变，故突变率突变率=28/15.6 =28/15.6 10108 8=1.8 =1.8 1010 8 8影印培养无药培养基含药培养基影印培养试验 原始敏感菌种影印实验（影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）Joshua Lederb
28、ergJ.Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958（五）基因突变及机制（五）基因突变及机制 p2021.诱发突变：诱发突变：人为地用物理、化学、生物的方法处理人为地用物理、化学、生物的方法处理微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型微生物，使其遗传物质发生变异，从而达到改变其表型的目的。的目的。l诱变机制诱变机制u物理诱变剂：物理诱变剂：紫外线（紫外线（UVUV）、）、X X射线、射线、射线、离子射线、离子束、热等。束、热等。u生物诱变因子：生物诱变因子：转座子、温和性噬菌体等。转座子
29、、温和性噬菌体等。u化学诱变剂：化学诱变剂：碱基类似物：碱基类似物：5-5-溴尿嘧啶、溴尿嘧啶、2-2-氨基嘌呤氨基嘌呤插入染料：插入染料：易引起移码突变，如溴化乙锭、丫啶橙易引起移码突变，如溴化乙锭、丫啶橙与碱基起反应的诱变剂：与碱基起反应的诱变剂：硫酸二乙脂（硫酸二乙脂（DESDES，碱基烷基，碱基烷基化）、化）、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）、）、亚硝酸等。亚硝酸等。l诱变剂：诱变剂：人工诱变时用来处理微生物并能提高生物体人工诱变时用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因素，又称诱变突变频率的物理或化学因素，称为诱变因素，又称诱变剂。剂。诱变机制 移码突变 染
30、色体畸变 碱基的置换（1）碱基的置换）碱基的置换 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换 COHT：烯醇式CT：酮式OA.TT.AG.CA.T酮式T.G烯醇式（2）移码突变 分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA
31、 CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增添一个碱基缺少一个碱基缺少一个碱基（3)染色体畸变 某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。染色体畸变 紫外线诱变作用机理紫外线诱变作用机理 1、使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联2、引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂 3、使胸腺嘧啶成二聚体二聚体，使结构发生改变 二、突变与育种（二、突变与育种（p208）（一）自发突变与育种1.从生产中选育2.定向培育优良品种（二）诱变育种 从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节诱
32、变育种的原则 效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)10025050085085080002万5万510万 从从 青青 霉霉 素素 产产 量量 看看 诱诱 变变 育育 种种1.诱变育种的基本环节（p209）大多死亡大多死亡少数存活少数存活存活率存活率多数未变多数未变少数突变少数突变突变率突变率多数负变多数负变少数正变少数正变正变率正变率多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大高产率高产率投产率投产率多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产出发菌株出发菌株计算出计算出诱变诱变2.诱变育种
33、工作中应考虑的几个原则选优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂处理单孢子（或单细胞）悬液选用最适剂量设计或采用高效筛选方案或方法利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标（1）选择简便有效的诱变剂）选择简便有效的诱变剂出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株S.t.his回变S.t.his 吸入滤纸片保温可疑“三致”试样 鼠肝匀浆（含羟化酶）阳性阴性 利用回变检测致癌剂利用回变检测致癌剂 艾姆斯试验法艾姆斯试验法（p210）平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；平板上无大量菌落出现，说明样品不含诱变剂；v 有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓
34、度过高；有抑制圈出现，并在外围长满大量菌落，说明浓度过高；v 在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。在滤紙片周围长满菌落说明浓度合适。该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致该法广泛用于监测食品饮料药物等试样中的致 癌物时间癌物时间3天，准确率天，准确率85%。（2）挑选优良的出发菌株（p211）生产中用过的自发变异菌株采用具有有利性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用前体或最终产物代谢高的菌株采用增变菌株（3）处理单孢子（或单细胞）悬液芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜（4 4）选用最适剂量）选用最适剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间
35、来表示合适剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量（5）充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落（7）设计或采用高效筛选方案或方法）设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单 孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株40株40株40株40株40株诱变剂处理3.突变株的筛选方法(p212）高产突变菌株的筛选方法 抗性突变体的筛选方
36、法 营养缺陷型的的筛选方法 与突变株的筛选相关的几个概念突变突变春日霉素产生春日霉素产生菌的孢子悬液菌的孢子悬液高产突变株的筛选高产突变株的筛选 琼脂块培养法筛选琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板(2)抗性突变体的筛选方法青霉素浓缩法梯度培养皿法青霉素浓缩法培养基(含青霉素)接入敏感菌液 （含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培养(3)营养缺陷型的筛选(p214)基本培养基基本培养基（MM）-：凡是能满足野生型菌株营养要求的凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。最低成分的合成培养基。完全培养基完全培养基（CM）+：满足一切营养缺陷型菌株生
37、长的天满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。然或半合成培养基。补充培养基补充培养基（SM）x：在在MM中有针对性地加入一或几种中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。与筛选与筛选营养缺陷型突变株相关的突变株相关的3 3类培养基类培养基三类遗传型三类遗传型野生型野生型 AA+B B+营养缺陷型型营养缺陷型型AA+B B-原养型原养型 AA+B B+与与营养缺陷型突变相关的突变相关的3 3类遗传型个体类遗传型个体 （p215p215）与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：
38、营养缺陷型：营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在 培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。株。如：如：lys-，bio-野生型：野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。的原始菌株，为该微生物的野生型。如：如：lys+;bio+;原养型原养型：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。与野生型的表型相同。营养缺陷型的筛
39、选办法(p215)1.诱变剂处理2.淘汰野生型3.检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐渐检出法影印接种法4.鉴定缺陷型菌丝过滤法突变株的筛选方法突变株的筛选方法诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法夹层培养法（p216）夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株 逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全
40、培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型逐个检出法逐个检出法缺陷型缺陷型的检出的检出影印接种法影印接种法完全培养基完全培养基影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型菌丝过滤法筛选营养突变株基本培养基 接入微生物孢子 （含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株菌丝过滤法菌丝过滤法u适用于适用于：丝状（放线丝状（放线菌、霉菌）菌、霉菌）u原理：原理：基本培养基上基本培养基上只有发育成菌丝；只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。野生型菌丝不能通过。生长谱法生长谱法 方法简便；方法简便；回变和污染不影响结果回变和污染不影响结果
41、测定物质可为粉末或纸片测定物质可为粉末或纸片补充：缺陷型的鉴定补充：缺陷型的鉴定测定一般应分两阶段：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的一步确定是哪种具体化合物的缺陷缺陷型；型；组合营养物法组合营养物法步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种营养因子编组；将多种营养因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；养；c.结果分析结果分析；一组：一组：1 2 3 4
42、 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 14 五组：五组：5 9 12 14 15营养因子分组编排时注营养因子分组编排时注意；意；1）每组内无重复的营）每组内无重复的营 养因子养因子 2）每组中应包含只出）每组中应包含只出 现一次的因子现一次的因子 3）每组中其他因子应）每组中其他因子应 分别出现二次分别出现二次如：如：一组：一组：1 2 3 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 14 五组：五组：5 9 12 14 15组合补充培养基法组合补充培养基法将待测的菌点种
43、到各种补充培养基上，逐个分析各菌的将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷缺陷类型，类型，或快速分离出所需或快速分离出所需缺陷缺陷类型的菌株。类型的菌株。ABFEDCHG缺陷型缺陷型的应用的应用一、微生物菌种的衰退一、微生物菌种的衰退二、微生物菌种的复壮二、微生物菌种的复壮三、微生物菌种的保藏三、微生物菌种的保藏第五节第五节 微生物菌种的衰退、微生物菌种的衰退、复壮和保藏复壮和保藏P.231P.231衰退的含义：衰退的含义：由于自发突变的结果，而使某物种由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。一一 、微生物菌
44、种的衰退、微生物菌种的衰退 衰退的表现形式衰退的表现形式 1 1）原有的形态不典型）原有的形态不典型 2 2）生长速度变慢）生长速度变慢 3 3）代谢产物生产能力下降）代谢产物生产能力下降 4 4）致病力下降）致病力下降 5 5）抗性下降）抗性下降（一）衰退的防止方法（一）衰退的防止方法1 1）控制传代的次数）控制传代的次数 2 2）创造良好培养条件）创造良好培养条件 3 3）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法 4 4）采用不易衰退的细胞进行传代）采用不易衰退的细胞进行传代 P.232P.232复壮的含义复壮的含义（二）（二）微生物菌种的复壮微生物菌种的复壮1 1）狭义：）狭义：是
45、一种消极的措施，它指的是菌种已发生衰是一种消极的措施，它指的是菌种已发生衰退，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群退，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。有典型性状的一种措施。2 2）广义：）广义：是一项积极的措施，即在菌种性能尚未衰退是一项积极的措施，即在菌种性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中选择到自发的正突变体（以期菌种的生作，以期从中选择到自发的正突变体（以期菌种的生产性能逐步有所提
46、高）。产性能逐步有所提高）。复壮的方法复壮的方法1.1.纯种分离；纯种分离；A A、平板划线分离：、平板划线分离：主要适合细菌，酵母菌，主要适合细菌，酵母菌，可达到可达到菌落纯的水平。菌落纯的水平。B B、单孢子分离：、单孢子分离：主要适合产孢子的微生物，例霉菌和主要适合产孢子的微生物，例霉菌和放线菌。用显微操作器进行分离，可达到细胞纯的水放线菌。用显微操作器进行分离，可达到细胞纯的水平。平。2.2.通过寄主主体复壮通过寄主主体复壮3.3.淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 P.232P.232二、微生物菌种的保藏二、微生物菌种的保藏目的：目的：不死亡，不污染，不变异不死亡，不污染，不变异三不原
47、则三不原则随时为生产、科研提供优良菌种。随时为生产、科研提供优良菌种。原理：原理：选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），在干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等环境条件在干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等环境条件下，降低微生物代谢活动强度，抑制微生物生长繁殖，并下，降低微生物代谢活动强度，抑制微生物生长繁殖，并使其难以发生突变。使其难以发生突变。P.233P.233v菌种保藏机构的任务：菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研并加以
48、妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。究、交换和使用的目的。v菌种保藏机构菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(ATCC)(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（NCTCNCTC）法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（IPLIPL）国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构：（1 1）传代培养保藏）传代培养保藏n常用方法：常用方法：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。等。低温保藏法：低温保藏法：菌种管置菌种管置44冰
49、箱保藏。冰箱保藏。石蜡油低温保藏法：石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞或加石蜡油。橡皮塞取代棉塞或加石蜡油。菌种保藏的方法菌种保藏的方法 传代培养保藏的菌种多可以直接使用，是进行微生物保传代培养保藏的菌种多可以直接使用，是进行微生物保藏的基本方法。藏的基本方法。n需注意的问题：需注意的问题：进行冷冻时，适当采取速冻的方法；而解冻时也应快速升温。进行冷冻时，适当采取速冻的方法；而解冻时也应快速升温。在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。例如存活率。例如甘油甘油或或二甲亚枫二甲亚枫和大分子物质如和大分子物质如糊精、
50、血清蛋白、脱脂糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）等）等。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。适合专业菌种保适合专业菌种保藏机构。藏机构。低温冰箱（低温冰箱（-70-70）和普通冰箱（）和普通冰箱（-30-30-20-20）也可用于冷冻保）也可用于冷冻保藏。藏。（2 2）冷冻保藏）冷冻保藏n冷冻真空干燥法冷冻真空干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。
