1、骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究研究生：导 师：一、研究背景一、研究背景 心肌病、难治性心力衰竭等心血管疾病仍严重威胁着人类的生命。各种心肌疾病心肌缺血、坏死有功能的心肌细胞、心肌组织 纤维组织增生、取代形成瘢痕组织进行性的心收缩功能不良、心腔扩张和心力衰竭。内科治疗：不能替代坏死心肌；心脏移植：供体少、费用高难以推广细胞移植：带来了新的曙光移植细胞异体细胞自体细胞骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞（MSC）分化：（1）心肌细胞（2）内皮细胞（3）平滑肌细胞 优点：(1)自体移植，不存在免疫 排斥问题。(2)MSCs定向分化的能力 较强(3)来源广，容易获取。(4)不存在伦理道德上的争
2、 议。现有的研究已证实，MSCs移植减少梗死面积改善心功能增加新生血管形成 二、研究目的 分离纯化骨髓间充质干细胞，探讨骨髓间充质干细胞移植对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能的影响。三、材料与方法动物：具有同基因背景的近交系F344大鼠药品及试剂：注射用盐酸阿霉素、淋巴细胞分离液、胎牛血清、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶、5-溴-2脱氧尿苷(BrdU)、小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、SP法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、小鼠抗大鼠单抗CD11b/c-FITC、CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相应同型对照单抗小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG2a PE和IgG2a F
3、ITC等设备及器械：BCM-1000型生物洁净工作台、37恒温CO2培养箱、倒置相差显微镜、70超低温冰箱、LXJ离心机、RM6240型生物信号采集分析系统、YP100型压力换能器、流式细胞仪等实验路线1：细胞部分MSCs分离纯化接种传代鉴定BrdU标记标记率检测细胞移植实验路线2：动物实验F344大鼠ADR注射细胞移植组心功测定组化分析细胞移植DMEM注射移植对照组NS注射F344大鼠正常对照组（一）实验动物分组及心力衰竭模型建立 1.随机选取10只大鼠作为正常对照组（NS腹 腔注射）2.其余36只大鼠，采用腹腔注射阿霉素（2 mg/kg，每周一次，共六次）建立心力衰竭 模型3.存活大鼠再随
4、机分为2组：移植对照组、细 胞移植组 （二）MSCs的分离及培养：1.将F344大鼠处，无菌条件下获取股骨和胫骨，用 培养液冲洗骨髓腔，获取全部骨髓细胞 2.采用淋巴细胞分离液进行分离纯化3.细胞以1104/cm2的密度接种于培养瓶，置培养 箱内培养 4.48h后首次换液,以后约34天换液一次5.待细胞生长至铺满瓶壁的2/3以上时，进行消化、传代（三）、MSCs的鉴定：1.倒置显微镜下观察MSCs的形态。2.MSCs的流式细胞仪鉴定：检测MSCs细胞表面抗原CD11b/c、CD34、CD44和 CD90的表达 第3代MSCs 消化 离心洗涤 滤过 一抗孵育 离心洗涤 上机检测（四）、MSCs的
5、标记：1.BrdU储存液的配制：将10 mgBrdU、0.8 mL二甲基亚砜和1.2 mL蒸馏水充分混匀，4避光保存。2.移植前，待细胞达到50融合时，在细胞 培养瓶内加入上述BrdU液，终浓度调至 50mg/L，于37、含5的CO2的饱和湿度 培养箱内继续培养48h。（五）、MSCs的BrdU标记率检测：第3代MSCs细胞爬片BrdU孵育48hPBS甲醛固定3%H2O2灭活内源性酶 酸变性胰酶修复非免疫血清封闭液PBS（阴性对照）一抗1：200生物素化二抗SABCDAB显色蒸馏水蒸馏水蒸馏水、PBSPBSPBSPBS苏木素复染（阴性对照）PBS蒸馏水（六）、MSCs移植：u1.细胞移植组：大
6、鼠腹腔阿霉素末次注射后1 周，将标记好的MSCs50l（细胞数3 106），从股静脉缓慢注入。u 2.移植对照组：股静脉缓慢注入DMEM培养 基50l。u3.正常组不做任何处理。（七）、大鼠心功能的测定：仪器准备、参数调节大鼠麻醉、固定去毛、切开皮肤 手术分离右颈总动脉插入自制心导管缓慢推进至左心室稳定后测量LVSP、LVDP、HR及dP/dt max（八）、MSCs移植后的心脏归巢检测：心脏甲醛固定酒精脱水、石蜡包埋切片脱蜡、水化3%H2O2灭活内源性酶 酸变性胰酶修复非免疫血清封闭液PBS（阴性对照）一抗1：200生物素化二抗SABCDAB显色蒸馏水蒸馏水、PBSPBSPBSPBS固绿复染
7、PBS蒸馏水透明封片（九）、统计分析所得的数据用均数标准差（meanSD）表示 SPSS10.0统计软件处理数据多个样本均数比较采用one way-ANOVA检验P0.05表示有显著性差异。四、结四、结 果果MSCs贴壁生长示意图其余结果略，呵呵！五、讨 论阿霉素钙超载自由基作用 能量代谢障碍抑制基因表达心肌损伤、舒缩功能障碍心力衰竭阿霉素心肌损害机制阿霉素诱导的心衰模型成功构建 判定指标：行为表现 肝淤血 心功能（LVSP、LVEP、dP/dt max）本研究发现从开始腹腔注射阿霉素第2周起，造模组大鼠即开始出现程度不等的中毒症状，表现为精神委靡，腹泻，皮毛松软失去光泽，活动、进食减少，体重
8、减轻等 大鼠断头处死之后发现，造模组大鼠均有不同称度的肝淤血、胸腔积液及粘连 MSCs的分离和纯化方法 贴壁筛选法 密度梯度离心法 免疫分选法 MSCs的鉴定：MSCs的表型不均一，分别具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点;MSCs阳性表达的抗原:SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124等；MSCs阴性表达的抗原:CD1a、CD11b/c、CD31、CD34、CD14、CD45、CD56、ESA等 本研究选用了CD11b/c、CD34、CD44、CD90表面抗原对MSCs进行表型鉴定CD11b/c为巨嗜细胞表型，
9、CD34为造血细胞表型结果证实MSCs不表达CD11b/c和CD34而表达CD44和CD90。MSCs的移植途径 局部直接注入：直视下心肌内直接注射、经导管冠状动脉内注射及经导管心肌内直接注射 全身注入：MSCs的归巢（homing）功能：Orlic：细胞梗死心肌周围天后原坏死心肌的68；Kocher：细胞尾静脉注入 周后 坏死心肌上出现移 植细胞分化的内皮细胞 MSCs移植改善心功能的机制 移植的干细胞分化形成了新的心肌细胞和血管移植的细胞维持了受损心肌的相对完整性 移植的细胞分泌某些血管生成因子、生长因子、细胞因子等物质干细胞激发某种化学反应，改善局部细胞的功能 展 望一系列基础及临床研究
10、均获得了振奋人心的结果随着基础、临床研究的继续开展，尚存的诸多难题将得以一一解决MSCs移植有望成为心肌病、难治性心力衰竭的一种有效治疗方法 六、结六、结 论论采用腹腔注射阿霉素，可成功复制阿霉素诱导的心力衰竭大鼠模型。体外培养的第三代骨髓间充质干细胞均一表达CD44和CD90，不表达CD11b/c和CD34。骨髓间充质干细胞移植后4周，在受体大鼠的心脏上可发现移植的细胞存活。骨髓间充质干细胞移植可明显改善阿霉素诱导的心力衰竭大鼠的心功能。七、致七、致 谢谢本课题是在林明教授和谢良地教授无微不至的关心和指导下完成的。两位导师严谨的科研作风、精益求精的治学态度和诲人不倦的精神将使我受益终生。实验过程中还得到高血压研究所吴可贵教授、王华军主管技师、许昌声技师和其他同学，以及福建医科大学高雅萍老师、生理教研室彭小鹏老师和分子中心赵榕老师的指导帮助和大力支持。在此一并致予衷心的感谢。
