1、目目 录录第第 二二 十十 一一 章章基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Genetic Diagnosis and Gene Therapy目目 录录基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。人体并在体内增殖而引起各
2、种疾病。目目 录录第一节第一节 基因诊断基因诊断Gene Diagnosis目目 录录一、基因诊断的概念、内容和特点一、基因诊断的概念、内容和特点定义定义:利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测法，直接检测基因结构基因结构及其及其表达水平表达水平是否正常，是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。从而对疾病作出诊断的方法。前提条件：前提条件：已明确疾病表型与基因型的关系。已明确疾病表型与基因型的关系。目目 录录基因诊断的基本内容基因诊断的基本内容n检测个体基因序列特征检测个体基因序列特征n基因突变分析基因突变分析n测定基因拷贝数测定基因拷贝数n基
3、因表达产物分析基因表达产物分析n测定是否存在外源基因测定是否存在外源基因目目 录录 特点特点:1.1.以基因作为检查材料和探查目标，属于以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊病因诊 断断”，针对性强。，针对性强。2.2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。有很高的特异性。3.3.由于分子杂交和聚合酶链反应（由于分子杂交和聚合酶链反应（PCRPCR）技术都具有）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。放大效应，故诊断灵敏度很高。4 4.适用性强，诊断范围广。适用性强，诊断范围广。5.5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。检测
4、外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。目目 录录基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异 由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵外源基因的入侵 如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。人体并在体内增殖而引起各种疾病。目目 录录n9、我们的市场行为主要的导向因素，第一个是市场需求的导向，第二个是技术进步的导向，第三
5、大导向是竞争对手的行为导向。23.1.1323.1.13Friday,January 13,2023n10、市场销售中最重要的字就是“问”。1:14:151:14:151:141/13/2023 1:14:15 AMn11、现今，每个人都在谈论着创意，坦白讲，我害怕我们会假创意之名犯下一切过失。23.1.131:14:151:14Jan-2313-Jan-23n12、在购买时，你可以用任何语言；但在销售时，你必须使用购买者的语言。1:14:151:14:151:14Friday,January 13,202313、He who seize the right moment,is the rig
6、ht man.谁把握机遇，谁就心想事成。23.1.1323.1.131:14:151:14:15January 13,2023n14、市场营销观念：目标市场，顾客需求，协调市场营销，通过满足消费者需求来创造利润。2023年1月13日星期五上午1时14分15秒1:14:1523.1.13n15、我就像一个厨师，喜欢品尝食物。如果不好吃，我就不要它。2023年1月上午1时14分23.1.131:14January 13,2023n16、我总是站在顾客的角度看待即将推出的产品或服务，因为我就是顾客。2023年1月13日星期五1时14分15秒1:14:1513 January 2023n17、利人为利
7、已的根基，市场营销上老是为自己着想，而不顾及到他人，他人也不会顾及你。上午1时14分15秒上午1时14分1:14:1523.1.13目目 录录二、基因诊断常用技术方法二、基因诊断常用技术方法n限制性内切酶谱分析法限制性内切酶谱分析法nDNA限制性长度多态性限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析分析 n等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide,ASO)（一）核酸分子杂交技术（一）核酸分子杂交技术目目 录录Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3
8、 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析限制性酶切分析目目 录录0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析目目 录录 在人类基因组中，平均约在人类基因组中，平均约200200对碱基可发生一对变异，对碱基可发生一对变异，中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为中性变异导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNADNA多多态性态性。不少不少DNADNA多态性发生在限制性内切酶识别位点多态性发生在限制性内
9、切酶识别位点上，酶解该上，酶解该DNADNA片段就会产生长度不的片段，称为片段就会产生长度不的片段，称为限限制性片段长度多态性制性片段长度多态性。在某一特定家族中，如果某。在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种用这一多态性片段作为一种“遗传标志遗传标志”，来判断，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。DNADNA限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）目目 录录RLFP分析法分析法目目 录录目目 录录（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链
10、反应 (PCR)PCR/单链构象多态性分析单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。定致病基因的存在。目目 录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析分析+目目 录录PCR/等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide，ASO)
11、目目 录录（三）基因测序（三）基因测序即测定即测定DNADNA序列的技术。分离患者的有关基因，序列的技术。分离患者的有关基因，测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最测定出碱基排列顺序，找出其变异所在，是最确切的基因检测方法。确切的基因检测方法。目前用于测序的技术主要有目前用于测序的技术主要有SangerSanger等发明的双等发明的双脱氧链末端终止法和脱氧链末端终止法和 Maxam Maxam和和 Gilbert Gilbert发明的化发明的化学降解法。学降解法。目目 录录（四）基因芯片（四）基因芯片 基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)（又称（又称DNADNA芯片、
12、生物芯片）芯片、生物芯片）通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。出靶核酸的序列。应用领域应用领域:基因表达谱分析、基因
13、突变及多态性分基因表达谱分析、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等选、基因测序等。目目 录录三、基因诊断的应用三、基因诊断的应用n遗传性疾病遗传性疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病，传染性流行病感染性疾病，传染性流行病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定目目 录录第二节第二节 基因治疗基因治疗Gene TherapyGene Therapy目目 录录定义定义早期早期是指是指整合入细胞基因组，整合入细胞基因组，的一的一种治疗方法。种治疗
14、方法。目前目前广义上来讲是指将某种遗传物质转广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。达到治疗疾病目的的方法。通过基因水平的通过基因水平的操作而治疗疾病的操作而治疗疾病的方法。方法。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念目目 录录1 1、基因修正、基因修正（gene correctiongene correction）2 2、基因替代（置换）、基因替代（置换）（gene replacementgene replacement）3 3、基因增强（补偿）、基因增强（补偿）（gene augmentationgen
15、e augmentation）4 4、基因抑制、基因抑制（gene constraintgene constraint）和和/或或 基因失活基因失活（gene inactivationgene inactivation）5 5、免疫基因治疗、免疫基因治疗6 6、活化前体药物基因（自杀基因）治疗、活化前体药物基因（自杀基因）治疗7 7、耐药基因治疗、耐药基因治疗二、基因治疗的策略二、基因治疗的策略目目 录录三、基因治疗的种类三、基因治疗的种类1 1、生殖细胞（、生殖细胞（germ cellgerm cell）基因治疗）基因治疗2 2、体细胞（、体细胞（somatic cellsomatic ce
16、ll）基因治疗）基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。给后代。目目 录录 四、基因治疗方式四、基因治疗方式一、体内疗法一、体内疗法（in vivoin vivo、一步法）、一步法）将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组将携带有治疗基因的载体直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的组织并进行表达。织器官，使其进入相应的组织并进行表达。二、体外疗法二、体外疗法（ex vivoex vivo、二步法）、二步法）先把待接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有先把待
17、接收基因的靶细胞从体内取出，将携带有治疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖，治疗作用的载体导入培养细胞内，筛选、增殖，再回输体内有关组织中。再回输体内有关组织中。目目 录录目的基因目的基因+载体载体重组重组DNADNA受体细胞受体细胞外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选回输体内回输体内五、基因治疗的基本程序五、基因治疗的基本程序目目 录录1 1、为致病基因、为致病基因2 2、遗传分子机制清楚、遗传分子机制清楚3 3、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机、该基因已被克隆，一级结构和表达调控机 制清楚制清楚4 4、可在体外操作，而且安全有效、可在体外操作，而且安全有效5 5、转移基因能完整地、稳
18、定地整合，并能适、转移基因能完整地、稳定地整合，并能适时适量表达时适量表达（一）目的基因的选择原则（一）目的基因的选择原则目目 录录 1 1、基因组、基因组DNADNA文库文库 2 2、cDNAcDNA（complementary DNAcomplementary DNA）3 3、人工合成基因片段、人工合成基因片段 4 4、PCRPCR扩增扩增 目的基因的来源目的基因的来源目目 录录（二）受体细胞的选择原则（二）受体细胞的选择原则1 1、最好选择组织特异性细胞、最好选择组织特异性细胞2 2、容易取出、容易取出3 3、具有较长的寿命、具有较长的寿命4 4、离体细胞能高效导入目的基因、离体细胞能高
19、效导入目的基因5 5、经体外操作后能存活并安全回输、经体外操作后能存活并安全回输常用的的受体细胞：常用的的受体细胞：淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细淋巴细胞、造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮胞、骨骼肌细胞、血管内皮细胞、呼吸道上皮细胞、肿瘤细胞。细胞、肿瘤细胞。目目 录录（三）载体的选择和外源基因的导入（三）载体的选择和外源基因的导入 病毒载体病毒载体 RNA RNA病毒载体病毒载体（逆转录病毒）（逆转录病毒）DNA DNA病毒：病毒：常用的有腺病毒、疱疹病毒、常用的有腺病毒、疱疹病毒、SV40 SV40病毒、巨细胞病毒、病毒、巨细胞病毒、腺相
20、关病毒、单纯疱疹病毒等腺相关病毒、单纯疱疹病毒等 非病毒载体非病毒载体 质粒、脂质体、受体介导的蛋白质粒、脂质体、受体介导的蛋白目目 录录 目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组染细胞后，其基因组RNA RNA 经逆转录产生双链经逆转录产生双链DNADNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirusprovirus），），前病毒转录产生的正链既是病毒前病毒转录产生的正链既是病毒RNARNA，再与前病毒，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具
21、有插入宿主染色体必需的全套完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。酶系统，适用于介导基因转移。逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirusretrovirus）目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录1 1、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒、主要来自莫洛尼氏小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virusMoloney murine leukemia virus，MoMLVMoMLV）其中其中三个结构基因（三个结构基因（gaggag、polpol、envenv）被删除）被删除2 2、标记基因（、标记基因（marker genema
22、rker gene）插入空缺，供阳性）插入空缺，供阳性选择用。如：新霉素抗性基因（选择用。如：新霉素抗性基因（neomycin neomycin resistant generesistant gene），该基因编码新霉素磷酸转移酶），该基因编码新霉素磷酸转移酶（NPTNPT），能对抗新霉素（），能对抗新霉素（G418G418）。）。3 3、有目的基因的插入位点、有目的基因的插入位点逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建目目 录录逆转录病毒载体的优点逆转录病毒载体的优点1.1.可插入足够长的外源可插入足够长的外源DNADNA（7KB7KB）2.2.基因转移效率高，几达基因转移效率高，几达10
23、0%100%3.3.重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代重组体可整合入宿主染色体，并稳定表达和传代4.4.宿主范围广、比较安全宿主范围广、比较安全缺点缺点1.1.只能整合入分裂活跃的细胞只能整合入分裂活跃的细胞2.2.靶细胞表面需要有特殊的受体靶细胞表面需要有特殊的受体3.3.必须使用带有必须使用带有“辅助病毒辅助病毒”的包装细胞系的包装细胞系4.4.病毒滴度低病毒滴度低目目 录录包装细胞：包装细胞：一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在一种细胞，重组逆转录病毒载体只能在其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释其中包装成没有感染能力的病毒颗粒，但能从中释放出去，这种细胞即包装细胞。放出去
24、，这种细胞即包装细胞。1.1.多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系多数由各种辅助病毒转染小鼠成纤维细胞系 NTH3T3NTH3T3构成。构成。2.2.辅助病毒由辅助病毒由MoMLVMoMLV切除了病毒切除了病毒55端端LTRLTR至至GagGag起起始密码之间包装信号始密码之间包装信号 等序列，虽能产生病毒蛋白等序列，虽能产生病毒蛋白但不能进行包装。但不能进行包装。3.3.导入的逆转录病毒载体转录出的导入的逆转录病毒载体转录出的RNARNA可以利用辅可以利用辅助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。助病毒产生的病毒蛋白包装成假病毒颗粒。包装细胞系包装细胞系目目 录录目目 录录 （四）外源基因表
25、达的筛选（四）外源基因表达的筛选 在较多的表达载体中都有在较多的表达载体中都有neoneor r标记基因存在，标记基因存在，若向培养基中加入药物若向培养基中加入药物G418G418，未被转化的细胞，未被转化的细胞不存在不存在neoneor r标记基因，细胞不能存活，最后只标记基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下来。有转化细胞存活下来。（五）（五）回输体内回输体内目目 录录1.1.选择合适的疾病：单基因遗传病选择合适的疾病：单基因遗传病2.2.具备该病分子缺陷的知识具备该病分子缺陷的知识3.3.有目的基因的克隆有目的基因的克隆4.4.克隆基因的有效表达克隆基因的有效表达5.5.克隆基因的有
26、效调节克隆基因的有效调节6.6.可利用的动物模型可利用的动物模型遗传病基因治疗的必要条件遗传病基因治疗的必要条件四、基因治疗的应用四、基因治疗的应用（一）遗传病的基因治疗（一）遗传病的基因治疗目目 录录基因治疗的部分对象基因治疗的部分对象1.1.严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷症（腺苷脱氨酶ADAADA缺乏）缺乏）2.2.囊性纤维变性囊性纤维变性3.Gaucher3.Gaucher病病型（葡糖脑苷脂酶缺陷）型（葡糖脑苷脂酶缺陷）4.4.苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷）苯丙酮酸尿症（苯丙氨酸羟化酶缺陷）5.5.血友病血友病B B（凝血（凝血因子缺陷）因子缺陷）6.6.家族性高胆固
27、醇血症家族性高胆固醇血症7.7.地中海贫血地中海贫血目目 录录1.1.宿主的修饰：宿主的修饰：保护分裂旺盛的正常组织，如保护分裂旺盛的正常组织，如造血干细胞：导入造血干细胞：导入二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因，获，获得对得对氨甲蝶呤氨甲蝶呤的抗性的抗性2.2.增强肿瘤浸润淋巴细胞（增强肿瘤浸润淋巴细胞（TILTIL）活性：）活性：如将肿瘤坏死因子（如将肿瘤坏死因子（TNFTNF）基因导入）基因导入TILTIL。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。这是目前肿瘤基因治疗最常用的方法。3.3.肿瘤细胞的修饰肿瘤细胞的修饰（二）肿瘤的基因治疗（二）肿瘤的基因治疗目目 录录如：如：自杀基因自杀基因
28、+病毒载体病毒载体 转染转染 重组载体重组载体 药物前体药物前体(无毒无毒)GeneGene酶酶 药物复合物药物复合物(有毒有毒)细胞死亡目目 录录例如：例如：单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞哺乳动物细胞 HSV Gene-TK （在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）（胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制抑制DNA合成合成 脱氧胸苷酸脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）凋亡（旁观者效应）目目 录录（三）艾滋病的基因治疗（三）艾滋病的基因治疗（四）心血管疾病、神经系
29、统疾病等（四）心血管疾病、神经系统疾病等 其它领域中的应用其它领域中的应用目目 录录1 1、基因治疗要获得成功，必须具备切实有效的、基因治疗要获得成功，必须具备切实有效的目的目的基因。基因。2 2、外源基因在人体内的、外源基因在人体内的表达调控表达调控存在一定的问题，存在一定的问题，尽管目前已有多种基因载体可供选择，但如何扬长尽管目前已有多种基因载体可供选择，但如何扬长避短，构建安全、高效、靶向、可控的载体是亟待避短，构建安全、高效、靶向、可控的载体是亟待解决的问题。解决的问题。3 3、目前基因治疗的方案多数是采用、目前基因治疗的方案多数是采用ex vivoex vivo 方法，方法，但受体细胞经体外长期培养和增殖后，细胞生物学但受体细胞经体外长期培养和增殖后，细胞生物学特性是否改变也是值得研究的问题。特性是否改变也是值得研究的问题。4 4、要充分估计导入外源基因对机体的、要充分估计导入外源基因对机体的不利影响不利影响。目目 录录
