1、第二章 基因工程操作的基本技术第二节第二节 核酸的提取与纯化核酸的提取与纯化 核酸的发现核酸的发现 核酸是核酸是1869年米年米 歇尔歇尔(F.Miescher)在脓液在脓液 的白细胞中发现的，他的白细胞中发现的，他 当时称之为核素。阿尔当时称之为核素。阿尔 特曼特曼(R.Altmann)于于1889年年 认识其酸性后，定名为认识其酸性后，定名为核核 酸。核酸分为核糖核酸酸。核酸分为核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸 (DNA)两大类。两大类。核酸概述核酸概述核酸的种类和分布核酸按戊糖分为两大类：核酸按戊糖分为两大类：v脱氧脱氧核糖核酸（核糖核酸（DNADNA）Deoxyribo
2、nucleic AcidDeoxyribonucleic Acidv核糖核酸（核糖核酸（RNARNA）Ribonucleic AcidRibonucleic Acid *rRNA rRNA （ribosomal RNA ribosomal RNA）80%80%*tRNA tRNA （transfer RNA transfer RNA）15%15%*mRNA mRNA（mesengermesenger RNA RNA）5%5%种类核酸分布 真核细胞真核细胞 原核细胞原核细胞 DNADNAv细胞核（细胞核（95%95%）：线型双链，一般与组蛋白结合线型双链，一般与组蛋白结合成染色体成染色体v线粒体
3、、叶绿体（线粒体、叶绿体（5%5%）：环）：环状双链状双链 线型双链线型双链v主要集中于主要集中于核区核区v质粒质粒DNADNA：染色：染色体外体外DNADNARNARNA v细胞质（细胞质（75%75%）v线粒体、叶绿体（线粒体、叶绿体（15%15%）v细胞核（细胞核（10%10%）主在主在细胞质细胞质核酸的理化性质核酸的理化性质vRNA的纯品都呈白色粉末或结晶，的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则则为白色类似石棉样的纤维状物。为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。于水，不溶于乙醇、氯仿等有机
4、溶剂。DNA提取一般思路v裂解细胞（破细胞壁和细胞膜）裂解细胞（破细胞壁和细胞膜）内容内容物释放物释放v分离出核酸分离出核酸去除蛋白质和多糖及杂质去除蛋白质和多糖及杂质v沉淀并吸附沉淀并吸附DNA,去除去除RNAv溶解溶解DNA,并保存并保存DNA提取一般原则提取一般原则v保持DNA结构相对完整。v纯度高纯度高尽量排除其他大分子的污染（蛋尽量排除其他大分子的污染（蛋白质、多糖、及白质、多糖、及RNA等），保证样品中不含等），保证样品中不含有有机溶剂及高浓度的金属离子。有有机溶剂及高浓度的金属离子。v得率好得率好选用合适的方法获得足够的样品选用合适的方法获得足够的样品由于提取由于提取DNA的目的
5、、种类、所用的生物、的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯的提纯有很多方法。其中最常用的是有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。碱抽提法。第一节 质粒DNA的提取与纯化 大肠杆菌基因组DNA 一、质粒DNA的提取plasmid DNAThe genomic DNA of E.coli:a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than the cell.Genomic DNA质粒质粒（plasmid）v是染色体外小型（
6、是染色体外小型（1-200kb1-200kb）的共价、闭合、环状）的共价、闭合、环状的双链的双链DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），能自主复制并能稳定），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。遗传的遗传因子。v常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等修饰酶等 v质粒的复制：严紧型复制（质粒的复制：严紧型复制（1 1 n n个）个）松弛型复制（松弛型复制（2020个以上）个以上）碱变性法提取质粒的原理v碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色
7、质在碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异：拓扑学上的差异：v在在pH 12.0-12.6pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNADNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNADNA仍为自然状态；仍为自然状态；v将将pHpH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNADNA之间之间交联形成不溶性网状结构，大部分交联形成不溶性网状结构，大部分DNADNA和蛋白质在去污剂和蛋白质在去污剂SDSSDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNADNA仍为
8、可溶状态。通过离心可仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体除去大部分细胞碎片、染色体DNADNA、RNARNA及蛋白质，质粒及蛋白质，质粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNADNA。v由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。环超螺旋。质粒提取的思路质粒提取的思路v质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNAv要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质RNA
9、 RNA 三个基本步骤：三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒菌体的收集裂解及质粒DNA的分离的分离质粒质粒DNA的纯化的纯化闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性快；分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结复合物结合在一起，在离心的时候合在一起，在离心的时候沉淀沉淀下去。下去
10、。变性变性碱抽提法提取质粒碱抽提法提取质粒DNA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：使用使用“溶液溶液”溶解细菌细胞壁。溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌第一步：溶菌50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶，RNase A溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性Solution II 的配制：的配制：第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复复合物和染色体合物和染色体DNA、RNA沉淀。沉淀。So
11、lution III的配制：的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS3M 醋酸钠（用冰醋酸调醋酸钠（用冰醋酸调pH至至4.8）上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或倍体积的异丙醇或2倍体积的无水倍体积的无水乙醇乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液上清液过柱过柱或酚或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA第七步：第七步：70%乙醇洗涤乙醇洗涤DNA第八步：干燥后，第八步：干燥后，DNA悬浮于悬浮于TE或或去离子水中去离子水中1.LB培养基培养基 detail2.溶液溶液 I detail3.溶液溶液
12、detail4.溶液溶液III detail5.TE(pH8.0)detail 质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法 所用试剂的生化作用所用试剂的生化作用 Solution（溶液）（溶液）50 mmol/L 葡萄糖、葡萄糖、25 mmol/L Tris.Cl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA(pH 8.0)v 高压灭菌后，高压灭菌后，4保存备用。保存备用。使用时加入：使用时加入：4-5mg/ml溶菌酶及溶菌酶及 RNase A Solution（溶液）（溶液）(现用现配制现用现配制)0.2 mol/L NaOH、1%SDS Solution（溶液）（溶液）（100 ml）5mol/
13、L KAc 60 ml、冰醋酸、冰醋酸 11.5 ml、水、水 28.5 ml 配制成的溶液配制成的溶液含含3 mol/L钾盐、钾盐、5 mol/L醋酸（醋酸（pH 4.8）。）。质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法(溶液配方溶液配方)LB培养基培养基 back v配制配制1升培养基，应在去离子水中加入：升培养基，应在去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract)5gNaCl10gv摇动容器直至溶质完全溶解，摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(约约0
14、.2ml)调节调节pH值至值至7.0,加入去离子水至总体积加入去离子水至总体积为为1L，高压下蒸汽灭菌，高压下蒸汽灭菌121，20分钟。分钟。溶液溶液 I backv50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖v25 mmol/L TrisCl(pH8.0)v10 mmol/L EDTA(pH8.0)在高压下蒸汽灭菌在高压下蒸汽灭菌20分钟，保存于分钟，保存于4。溶菌酶溶菌酶:能水解菌体细胞壁的主要化学成分能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖肽聚糖中的中的-1，4糖苷键糖苷键。在碱性条件（在碱性条件（pH8）下有活性。）下有活性。葡萄糖葡萄糖:增加溶液的增加溶液的粘度粘度，维持，维持渗透压渗透压，防止，防
15、止DNA受机械力（震荡）的作用受机械力（震荡）的作用而降解。而降解。EDTA:Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。RNase A：降解降解RNA渣滓。以免提取后的渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。使用时加入：使用时加入：4-5mg/ml溶菌酶溶菌酶 RNase A溶液溶液 II backv0.2 mol/L NaOH(从从5mol/L贮存液中现用稀释贮存液中现用稀释)v1%SDSv作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。NaOH：强碱
16、，提供：强碱，提供pH12的碱性条件，使的碱性条件，使DNA双链双链变性变性。SDS:溶解细胞膜、细胞内脂类和蛋白，并结合成溶解细胞膜、细胞内脂类和蛋白，并结合成“蛋白蛋白SDS”复合物，复合物，使蛋白质（包括使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。酶）变性沉淀。溶液溶液 III backv5mol/L 醋酸钠（醋酸钾）醋酸钠（醋酸钾）v冰醋酸冰醋酸v作用：酸性条件下质粒作用：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白-SDS线性线性DNA沉淀，沉淀，K可中和可中和DNANaAc-HAc缓冲液：冰醋酸把醋酸钠溶液的缓冲液：冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到调到4.8。用来用来中和中和NaOH变性液，
17、使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。等）沉淀。TE(pH8.0)backv10 mmol/L TrisCl(pH8.0)1 mmol/L EDTA(pH8.0)v作用：稳定作用：稳定TE缓冲液：缓冲液：DNA保存保存液，由液，由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；业），有利于以后操作；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。蛋白变性剂蛋白变性剂，进一步抽
18、提，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。（现多用各种商品化的（现多用各种商品化的层析柱层析柱纯化纯化DNA)。酚酚-氯仿氯仿以上试剂有商业试剂盒；以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。也可以自己配制。异戊醇异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。现在普遍用现在普遍用
19、:酚：氯仿：异戊醇（酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）核酸相Protein变性相有机相 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。酸的磷酸二酯键。(2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。套。使用酚时应注意使用酚时应注意核酸的沉
20、淀核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸最常用的方法。沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：优点：改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。有机沉淀剂有机沉淀剂（1 1）乙醇）乙醇优点：优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。后实验。缺点：缺点：需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇）异丙醇优点：优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。样品沉淀。一般
21、不需低温长时间放置。一般不需低温长时间放置。缺点：缺点：易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用以，最后用70乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。质粒质粒DNA提取的其它方法提取的其它方法 质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法 原理：原理：染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质
22、粒共价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。液相中，从而可通过离心将两者分开。氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法第二节第二节 基因组或其他基因组或其他DNA的提取（补充）的提取（补充）一般过程及原理：一般过程及原理：1.细菌基因组细菌基因组DNA的制备的制备（1）细胞裂解）细胞裂解10%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。37 oC
23、温育。温育。不用不用NaOH!（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚除去多糖，酚-氯仿氯仿-异戊醇除去蛋白。异戊醇除去蛋白。（3）沉淀）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。倍体积的异丙醇。一般过程及原理：一般过程及原理：动物组织剪成小块，置动物组织剪成小块，置液氮液氮中冻结后中冻结后研磨研磨成细粉末。成细粉末。组织培养的细胞用组织培养的细胞用胰酶胰酶消化松散后直接使用。消化松散后直接使用。（1）组织粉碎）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提0.5%SDS和和0.1mg/ml蛋白酶蛋白酶K。50 oC温育。温育。（2）细胞裂解）细胞裂解（3）纯化）纯化
24、DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（是离子型去垢剂（detergent），可），可以使细胞膜崩解。以使细胞膜崩解。（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase。用用2倍体积的无水乙醇。倍体积的无水乙醇。（4）沉淀）沉淀DNA（可以加入（可以加入1/101/10体积的体积的3M3M醋酸氨醋酸氨辅助沉淀）辅助沉淀）植物各个部位都可用作总植物各个部位都可用作总DNADNA抽提的材料，常用的材料一抽提的材料，常用的材料一般为般为植物幼叶植物幼叶。先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入SDSSDS、C
25、TABCTAB等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白膜和核膜破裂。再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性。最后加入无水乙醇或异丙醇沉淀变性。最后加入无水乙醇或异丙醇沉淀DNADNA；沉淀的；沉淀的DNADNA即为植物总即为植物总DNADNA，溶于，溶于TETE溶液或超纯水中保存备用。溶液或超纯水中保存备用。v3.从植物组织中制备 DNA基因组基因组DNA-CTABDNA-CTAB法原理（植物法原理（植物DNADNA提取经典方提取经典方法）法）CTABCTAB（hexadecyltrimet
26、hylammoniumhexadecyltrimethylammonium bromide bromide，十六烷基三，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl0.7mol/L NaCl）是可溶的，）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：注：CTABCTAB溶液在低于溶液在低于15 15 时
27、会形成沉淀析出，因此时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于不要低于1515。CTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活
28、性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除酚容易去除CTABCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNADNA中酚的污染中酚的污染；同时它
29、也能和多糖结合，有效去除多糖。；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。组份组份 Tris-HClTris-HCl （pH8.0pH8.0）EDTA EDTA（pH8.0pH8.0）NaClNaCl CTABCTAB PVP40PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM100 mM 20 mM20 mM1.4M1.4M 3%(W/V)3%(W/V)5%(W/V)5%(W/V)2%2%（V/VV/V）使用前加入使用前加入CTABCTAB法流程图法流程图 植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀D
30、NADNA溶液溶液 一般过程及原理：一般过程及原理：（1）组织粉碎）组织粉碎用用液氮液氮冷冻后冷冻后研磨研磨成细粉末。成细粉末。（2）细胞裂解）细胞裂解用用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴十六烷基三甲基溴化铵化铵/2巯基乙醇）。巯基乙醇）。或或1%SDS和蛋白酶和蛋白酶K。65 oC温育。温育。用用0.6倍体积的倍体积的异丙醇异丙醇（-20 oC）。）。（3）纯化）纯化DNA用苯酚和酚用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀）沉淀DNA（5）除去）除去RNA污染污染用用RNase A。（可以加入（可以加入1/10体积的体积的3M醋酸氨辅助沉淀）醋酸氨辅助沉
31、淀）。三、三、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 制备制备RNA的关键的关键防止内外源防止内外源RNase的作用的作用 1)RNase的特点的特点：抗酸抗碱：抗酸抗碱,具很广具很广pH作用范围作用范围;抗高抗高温严寒温严寒(065均具活性）；抗变性剂均具活性）；抗变性剂 2)解决办法解决办法：外源外源RNase高温，焦磷酸二乙酯高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理几乎处理几乎所有溶液和器皿，操作者带手套所有溶液和器皿，操作者带手套 内源内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑抑制剂，蛋白酶制剂，蛋白酶K等等 三、三、RNA提取的基本原理与方法提取
32、的基本原理与方法 总总RNA的提取的提取 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：方法：1）热苯酚抽提法）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法尿素法 其中以胍盐法最好，对于从那些其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组含量很高的组织（胰脏）中提取织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使特别有效，可使RNase迅速变性，迅速变性，制备的制备的RNA有较高翻译活性。在有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。蛋白质变性是同步进行的。
33、二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 RNA提取的通用方法提取的通用方法 异异硫氰酸胍硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 原理：原理：n细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；n释放出来的释放出来的DNA和和RNA由于在特定由于在特定pH下溶解度的不下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；以分离；n有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。二、二、RNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法
34、 RNA提取的通用方法提取的通用方法 异异硫氰酸胍硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 步骤步骤:n材料准备：尽量新鲜。材料准备：尽量新鲜。n裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放放RNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。n纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提氯仿可抽提去除杂物。去除杂物。n洗涤：洗涤：70乙醇。乙醇。n沉淀：异丙醇、无水乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。n乙酸钠（乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的）：维持
35、变性的细胞裂解液的pH值，值，沉淀沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。三、三、DNA/RNADNA/RNA浓度、纯度和相对分子浓度、纯度和相对分子 质量的测定质量的测定 1.紫外分光光度法紫外分光光度法 原理基于原理基于DNA(DNA(或或RNA)RNA)分子在分子在260nmm260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中强度与系统中DNADNA或或RNARNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校转换也会导致吸收水平的改变，但是
36、这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。衡量所提取衡量所提取DNADNA的纯度可用的纯度可用ODOD260260与与ODOD280280的比值的比值,OD,OD260260/OD/OD280280对对DNADNA而而言其值大约为言其值大约为1.81.8。当当ODOD260260/OD/OD280280大于大于1.81.8则可能有则可能有RNARNA污染。污染。当当ODOD260260/OD/OD280280小于小于1.81.8时则有蛋白质污染时则有蛋白质污染。在波长在波长260nm紫外光下，紫外光下，1 OD值的吸
37、光度相当于双链值的吸光度相当于双链DNA浓度为浓度为50g/ml；单链；单链DNA为为37 g/ml；RNA为为40 ug/ml。三、三、DNA/RNADNA/RNA浓度、纯度和相对分子浓度、纯度和相对分子 质量的测定质量的测定1.紫外分光光度法紫外分光光度法 测测DNA：纯的纯的DNA样品样品OD260/OD280应为应为1.8，OD260mOD230应大于应大于2.0。1)OD260/OD280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA污染。污染。2)小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD230小于小于2.0时，表明溶液中有残存
38、的盐和时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：可能出现既含蛋白质又含注：可能出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比值为溶液比值为1.8的情况。的情况。三、三、DNA/RNADNA/RNA浓度、纯度和相对分子浓度、纯度和相对分子 质量的测定质量的测定1.紫外分光光度法紫外分光光度法 测测RNA 纯的纯的RNA样品其样品其OD260OD280应介于应介于1.7-2.0之间，之间，OD260/OD230比值应大于比值应大于2.0。1）若）若RNA样品样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；质或酚的
39、污染；2）比值大于）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于比值小于2.0时表明有小分子及盐存时表明有小分子及盐存在。在。三、三、DNA/RNADNA/RNA浓度、纯度和相对分子浓度、纯度和相对分子 质量的测定质量的测定核酸的保存核酸的保存 对对DNA DNA 保存：保存：DNA样品溶于样品溶于pH8.0的的TE，4 或或-20 保保存；存；长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1滴氯仿。滴氯仿。对对RNARNA 保存：保存：RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸或双蒸灭菌水中，灭菌水中，-70 保存保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中醇中;在在RNA溶液中，加溶液中，加1滴滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核氧钒核糖核苷复合物苷复合物)冻贮于冻贮于-70,可保存数年。可保存数年。v
