1、环境工程微生物学实验实验二：培养基的制备和灭菌适用范围：环境工程专业适用范围：环境工程专业实验教师：李宁实验教师：李宁 顾彦顾彦一、目的一、目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2、掌握培养基和无菌水的制备方法。3、掌握高压蒸气灭菌技术。二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理二、基本原理全自动立式灭菌锅全自动立式灭菌锅三三、仪器和材料、仪器和材料2、器材：、器材：培养皿（直径90mm）10套，试管(15 mm150 mm)5支，(18 mm180 mm)5支，移液管(10 mL)1支，(1 mL)2支，锥形瓶(250 mL)2个；烧杯(30
2、0 mL)1个，玻璃珠30粒、纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）、精密pH值试纸6.48.4、高压蒸气灭菌锅、烘箱、酒精灯。1、药品药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂或市售营养琼脂培养基、蒸馏水、10%HCI、10%NaOH四四、实验内容、实验内容（1）洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。1 1、玻璃器皿的洗涤和包装、玻璃器皿的洗涤和包装四四、实验内容、实验内容1 1、玻璃器皿的洗涤和包装、玻璃器皿的洗涤和包装（2 2）包装）包装 移液管 棉塞的制作（试管和
3、锥形瓶）培养皿四四、实验内容、实验内容2 2、培养基的制备、培养基的制备-以牛以牛肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基为例为例(供测定细菌总数供测定细菌总数和细菌分离培养和细菌分离培养)称量溶解调pH过滤分装封口灭菌u牛肉膏 1.0g；u蛋白胨 2.0g；u氯化钠 1.0g；u琼脂 4.0g；u蒸馏水 200mL；upH 7.2-7.4 用精密pH试纸测培养基的pH值，按pH值的要求用质量浓度100g/L的NaOH或体积百分数10%的HCl调整至所需的pH值。四四、实验内容、实验内容分装：按图所示，将培养基分装于试管或锥形瓶中（注意防止培养基玷污管口或瓶口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染），装入试管的培
4、养基量视试管的大小及需要而定，一般制斜面培养基时，每支试管装的量为试管高度的1/41/3。2 2、培养基的制备、培养基的制备-以牛以牛肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基为例为例(供测定细菌总数和细菌分供测定细菌总数和细菌分离培养离培养)u牛肉膏 1.0g；u蛋白胨 2.0g；u氯化钠 1.0g；u琼脂 4.0g；u蒸馏水 200mL；upH 7.2-7.4 称量溶解调pH过滤分装封口灭菌四四、实验内容、实验内容2 2、培养基的制备、培养基的制备-以牛以牛肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基为例为例(供测定细菌总数和细菌分供测定细菌总数和细菌分离培养离培养)u牛肉膏 1.0g；u蛋白胨 2.0g；u氯
5、化钠 1.0g；u琼脂 4.0g；u蒸馏水 200mL；upH 7.2-7.4 称量溶解调pH过滤分装封口灭菌瓶口用棉塞住，并用报纸、小绳捆好瓶口，挂上标签，注明何种培养基，制作人，时间等。最后放入高压无菌器中，待灭菌。四四、实验内容、实验内容3 3、无菌稀释水的制备无菌稀释水的制备（1）取一个250mL的锥形瓶装90（或99）mL蒸馏水，放30颗玻璃珠（用于打碎活性污泥、菌块或土壤颗粒）于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。（2）另取5支18mm180mm的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。四四、实验内容、实验内容4 4、灭菌、灭菌干热灭菌法：培养皿、移液管及其他玻璃器皿可用干热灭
6、菌。先将已包装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160后维持2h，把恒温箱的调节旋扭调回零处，待温度降到50左右，才可将物品取出。请注意：灭菌时温度不得超过170，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌。四四、实验内容、实验内容4 4、灭菌、灭菌高压蒸气灭菌法：该法使用高压灭菌锅，微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。加水加水装锅装锅启动启动关闭排气关闭排气阀阀升压、升升压、升温温中断热源中断热源取出灭菌取出灭菌物物待培养基冷却后置于37恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。五、思考题1.培养基根据什么原理配制？牛肉膏蛋白胨培养基中不同成分各起什么作用？2.斜面培养基如何制作？分装时应注意什么问题？3.为什么湿热灭菌比干热灭菌优越？
