1、微生物生物技术及应用微生物生物技术及应用张张 松松 Email： 华南师范大学生命科学学院华南师范大学生命科学学院20102010年年6 6月月 教材及参考书：教材及参考书：(1)(1)黄秀梨、辛明秀黄秀梨、辛明秀.微生物学，高等教育出版社，微生物学，高等教育出版社，2009 2009(2)(2)张张 松松.微生物学多媒体教学软件（网络版）微生物学多媒体教学软件（网络版）.北京：高等教育北京：高等教育出版社出版社.2006.2006.(3)(3)黄文芳，张黄文芳，张 松松.微生物学实验指导微生物学实验指导.广州：暨南大学出版广州：暨南大学出版社社.2003.2003.(4)(4)黄秀梨、辛明秀
2、黄秀梨、辛明秀.微生物学实验指导微生物学实验指导.高等教育出版社，高等教育出版社，2008.(5)(5)张张 松松.食用菌学食用菌学.广州：广州：华南理工大学出版社广州：广州：华南理工大学出版社,2000,2000。(6)(6)周德庆，微生物学教程，高等教育出版社，周德庆，微生物学教程，高等教育出版社，20022002(7)沈萍，微生物学，高等教育出版社，沈萍，微生物学，高等教育出版社，20062006(8)Lansing M.Prescott,Microbiology 5th ed(8)Lansing M.Prescott,Microbiology 5th ed 影印版，高等影印版，高等教育
3、出版社，教育出版社，20002000(9)Madigan M T(9)Madigan M T et alet al.BrockBiology.BrockBiology of of Microorganism,10/e,Prentice Hall,2003Microorganism,10/e,Prentice Hall,2003微生物与我们的生活微生物与我们的生活微生物类型微生物类型1 1、原核微生物：细菌、放线菌、衣原体、原核微生物：细菌、放线菌、衣原体2 2、真核微生物：酵母菌、霉菌、真核微生物：酵母菌、霉菌3 3、非细胞型微生物：病毒、亚病毒因子、非细胞型微生物：病毒、亚病毒因子病毒 古代
4、酿酒古代酿酒酵母菌兼性厌氧微生物（有氧、无氧）酵母菌兼性厌氧微生物（有氧、无氧）乙醇发酵：乙醇发酵：酵母菌酵母菌C6H12O6-2CH3CH2OH+2CO2+2ATPC6H12O6-2CH3CH2OH+2CO2+2ATP果酒果酒果醋：醋酸菌：好氧（果醋：醋酸菌：好氧（O2O2）毛霉形态：菌丝无隔膜孢囊孢子接合孢子应用：酿造腐乳应用：酿造腐乳1 1、前发酵：毛霉的生长，、前发酵：毛霉的生长，15-2015-20，菌膜形成；，菌膜形成；毛霉（蛋白酶等）毛霉（蛋白酶等）蛋白质蛋白质-氨基酸氨基酸2 2、后发酵：风味形成。、后发酵：风味形成。乳酸发酵乳酸发酵泡菜、酸奶泡菜、酸奶t 家居环境家居环境（菜
5、板、抹布等）（菜板、抹布等）；t 人体体表及体内人体体表及体内（口腔、皮肤、肠道等）（口腔、皮肤、肠道等）：微生物无处不在，我们无时不生活在微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋微生物的海洋”中。中。t土壤；土壤；t纸币纸币（成都制造出抗菌人民币，（成都制造出抗菌人民币，2003）；t 空气空气（每个喷嚏的飞沫含每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为个细菌，重感冒患者为8500万万）；微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！时时刻刻与微生物时时刻刻与微生物“共舞共舞”是是 祸祸？是是 福福？t 物质循环；物质循环；微生物是人类的朋
6、友！微生物是人类的朋友！t 体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；t 有用物质的生产；有用物质的生产；t 基因工程为代表的现代生物技术；基因工程为代表的现代生物技术；少数微生物也是人类的敌人少数微生物也是人类的敌人！天花；天花；鼠疫；鼠疫；艾滋病；艾滋病；疯牛病；疯牛病；埃博拉病毒；埃博拉病毒；SARS；禽流感；禽流感；“在近代科学中，对人类福利最大的一门科学，在近代科学中，对人类福利最大的一门科学，要算是微生物学了。要算是微生物学了。”微生物生物技术微生物生物技术 微生物学基本操作技术微生物学基本操作技术 基本操作技术基本操作技术1 1：培养基的制备
7、：培养基的制备 培养基培养基为人工培养微生物而制备、提供微生为人工培养微生物而制备、提供微生物以合适营养条件的基质。物以合适营养条件的基质。培养基成分培养基成分 微生物的生长需要有微生物的生长需要有碳源、氮源碳源、氮源、无机盐、无机盐、生长因子等营养物质。生长因子等营养物质。碳源为微生物营养提供所需的碳架和能源来碳源为微生物营养提供所需的碳架和能源来源，主要有源，主要有葡萄糖葡萄糖、淀粉、淀粉、CO2CO2等。等。氮源为微生物提供所需氮素的营养来源，主氮源为微生物提供所需氮素的营养来源，主要有要有蛋白胨蛋白胨、硝酸盐、铵盐、分子态氮等。、硝酸盐、铵盐、分子态氮等。无机盐为微生物提供除碳、氮源以
8、外的各种无机盐为微生物提供除碳、氮源以外的各种元素，主要有元素，主要有KH2PO4 KH2PO4、MgSO4MgSO4、NaClNaCl、CaCl2CaCl2等。等。生长因子为微生物生长提供不可缺少的微量生长因子为微生物生长提供不可缺少的微量有机物质，主要有维生素等。有机物质，主要有维生素等。配制培养基的原则配制培养基的原则1.1.根据不同微生物类型配制不同的培养基。根据不同微生物类型配制不同的培养基。培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的培养基是不同的。培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的培养基是不同的。细菌细菌 采用牛肉膏蛋白胨培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏牛肉膏 3 g;3 g;蛋白胨蛋白胨
9、 5 g;5 g;水水 1 000 mL1 000 mL;pH 7.2;pH 7.27.4 7.4 放线菌放线菌 采用高氏采用高氏1 1号培养基号培养基 可溶性淀粉可溶性淀粉 20 g;KNO3 1 g;K2HPO4 1 g;20 g;KNO3 1 g;K2HPO4 1 g;MgSO47H2O 0.5 g;NaClMgSO47H2O 0.5 g;NaCl 1 g;FeSO4H2O 0.01 g;1 g;FeSO4H2O 0.01 g;水水 1 000 mL1 000 mL;pH 7.2;pH 7.27.4 7.4 酵母和霉菌酵母和霉菌 采用察氏培养基采用察氏培养基蔗糖蔗糖 30 g;NaNO3
10、 3 g;KCl30 g;NaNO3 3 g;KCl 0.5 g;K2HPO4 1 g;0.5 g;K2HPO4 1 g;FeSO4H2O 0.01 g;FeSO4H2O 0.01 g;MgSO47H2O 0.5 g;MgSO47H2O 0.5 g;水水 1 000 mL1 000 mL;pH 6.0;pH 6.0培养不同营养类型的微生物也各有不同的培养基。培养不同营养类型的微生物也各有不同的培养基。2.2.注意各种营养物质的浓度与配比注意各种营养物质的浓度与配比。3.3.控制培养基的条件控制培养基的条件（pHpH、O2O2和和CO2CO2、螯合剂等）培养、螯合剂等）培养基。基。pH pH 控
11、制在一定的范围之内，通常在培养基里加控制在一定的范围之内，通常在培养基里加一些缓冲剂，如一些缓冲剂，如K2HPO4K2HPO4、KH2PO4KH2PO4等。等。4.4.选择培养材料选择培养材料注意经济节约注意经济节约,价廉物美。价廉物美。培养基的类型和应用培养基的类型和应用 按培养基的成分按培养基的成分 合成培养基合成培养基:顺序加入准确称量的高纯化学试剂与顺序加入准确称量的高纯化学试剂与蒸馏水配制而成，组成成分精确，重复性强。蒸馏水配制而成，组成成分精确，重复性强。天然培养基天然培养基:采用动植物组织或微生物细胞或它们采用动植物组织或微生物细胞或它们的提取物或粗消化产物配制成的，其所用物质的
12、成分的提取物或粗消化产物配制成的，其所用物质的成分不稳定，因而营养成分难控制，重复性差。不稳定，因而营养成分难控制，重复性差。半合成培养基半合成培养基:用纯化学试剂和天然物质配成。用纯化学试剂和天然物质配成。按培养基的物理状态按培养基的物理状态 固体培养基固体培养基:加了凝固剂后制成的呈固体状态的加了凝固剂后制成的呈固体状态的培养基。常见的凝固剂是琼脂培养基。常见的凝固剂是琼脂(约约2%)2%)或明胶或明胶(5%(5%12%)12%)。液体培养基液体培养基:呈液态的培养基。呈液态的培养基。半固体培养基半固体培养基:液体培养基中加液体培养基中加0.5%0.5%或更低浓度或更低浓度的琼脂就制成柔软
13、的浆糊状半固体培养基。的琼脂就制成柔软的浆糊状半固体培养基。按培养基的用途分为按培养基的用途分为 加富培养基加富培养基:在普通培养基里加进血、血清、动物在普通培养基里加进血、血清、动物(或植物或植物)组织液或其他营养物质组织液或其他营养物质(或生长因子或生长因子)的一类营养丰富的培养基的一类营养丰富的培养基,用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。选择培养基选择培养基:根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的培养基，可以将某种或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的培养基，
14、可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。鉴别培养基鉴别培养基:在培养基中添加某种营养物质或化学物质在培养基中添加某种营养物质或化学物质(指示指示剂或抑制剂剂或抑制剂)而将目的或对象微生物的菌落与同一平板上的其他而将目的或对象微生物的菌落与同一平板上的其他微生物菌落区别开来的培养基。如伊红美蓝培养基微生物菌落区别开来的培养基。如伊红美蓝培养基(EMB(EMB培养基培养基)可鉴别肠道杆菌中的某些细菌。大肠杆菌在此培养基上形成有绿可鉴别肠道杆菌中的某些细菌。大肠杆菌在此培养基上形成有绿色金属闪光的深紫色菌落。其培养基成分为色金属闪光的深紫色菌落。其
15、培养基成分为:蛋白胨蛋白胨 10 g10 g，伊，伊红红Y 0.4 gY 0.4 g，乳糖，乳糖 5 g5 g，美蓝，美蓝 0.065 g0.065 g，蔗糖，蔗糖 5 g5 g，K2HPO4 2 gK2HPO4 2 g，水水 1 000 mL1 000 mL，pH 7.2 pH 7.2 常用培养基配方常用培养基配方1 1、牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏：牛肉膏3g3g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，NaClNaCl 5g,5g,琼脂琼脂20g,20g,水水1 000mL1 000mL，pH7.0pH7.07.27.2。常用于培养细菌。常用于培养细菌。2 2、高氏、高氏1 1号培养
16、基：可溶性淀粉号培养基：可溶性淀粉20g20g，KNO3 1gKNO3 1g，NaC1 0.5gNaC1 0.5g，K2HPO43H2O 0.5gK2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01gFeSO47H2O 0.01g，琼脂，琼脂20g20g，水，水1 000mL1 000mL，pH7.2pH7.27.47.4。常用于培养放线菌。常用于培养放线菌。3 3、察氏培养基：蔗糖、察氏培养基：蔗糖30g30g，NaNO3 2NaNO3 2，K2HPO4 1gK2HPO4 1g，KC1 0.5KC1 0.5MgSO47H2O
17、0.5gMgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01gFeSO47H2O 0.01g，琼脂，琼脂 20g20g，水，水1 000mL 1 000mL pH6.7pH6.7。常用于培养霉菌。常用于培养霉菌。4 4、马铃薯培养基（马铃薯培养基（PDAPDA）：马铃薯：马铃薯200200，蔗糖（或葡萄糖），蔗糖（或葡萄糖）2020，琼，琼脂脂2020，水，水1 000mL1 000mL，pH 6.5pH 6.5（或自然）。常用于培养酵母菌、霉菌、（或自然）。常用于培养酵母菌、霉菌、食药用菌。食药用菌。牛肉膏蛋白胨培养基制作流程：牛肉膏蛋白胨培养基制作流程：计算用量称量溶解调计算用量称量
18、溶解调pHpH过滤分装三角瓶包扎灭过滤分装三角瓶包扎灭菌（菌（121 121 0 0C,30minC,30min）倒平板。）倒平板。马铃薯葡萄糖培养基（马铃薯葡萄糖培养基（PDAPDA）制作流程：）制作流程：马铃薯去皮、切粒马铃薯去皮、切粒煮煮8-108-10分钟后取分钟后取汁使用汁使用加药品溶化加药品溶化琼脂溶化琼脂溶化混合定混合定容容调节调节pHpH值值分装分装灭菌灭菌倒平板。倒平板。高压蒸汽锅法是实验室及生产中最常用的灭菌方高压蒸汽锅法是实验室及生产中最常用的灭菌方法。使用高压锅时，要注意完全排除锅内的冷空气，法。使用高压锅时，要注意完全排除锅内的冷空气，使之充满饱和蒸汽，否则会因蒸汽中
19、混有空气而比相使之充满饱和蒸汽，否则会因蒸汽中混有空气而比相应纯蒸汽的温度降低，影响灭菌效果。应纯蒸汽的温度降低，影响灭菌效果。高压蒸汽锅的高压蒸汽锅的使用使用基本操作技术基本操作技术2 2：无菌操作：无菌操作 无菌操作无菌操作 为了防止其他微生物进入机体或物体造成为了防止其他微生物进入机体或物体造成污染，在制备培养基、使用接种箱及无菌室、污染，在制备培养基、使用接种箱及无菌室、接种、分离和培养微生物时，都要进行无菌操接种、分离和培养微生物时，都要进行无菌操作。作。无菌操作技术主要有：培养基用高压蒸汽无菌操作技术主要有：培养基用高压蒸汽灭菌（灭菌（0.1MPa0.1MPa，121121，15-
20、30min15-30min）；无菌室、）；无菌室、接种箱、超净工作台等用紫外线灭菌（照射接种箱、超净工作台等用紫外线灭菌（照射30min30min）；接种环、接种针用火焰灼烧灭菌；）；接种环、接种针用火焰灼烧灭菌；接种需在酒精灯火焰旁的无菌区进行，接种过接种需在酒精灯火焰旁的无菌区进行，接种过程中的无菌操作。程中的无菌操作。高温灭菌方法高温灭菌方法1 1、干热灭菌、干热灭菌 （1)1)焚烧灭菌法（焚烧灭菌法（incinerationincineration）：用火焰焚烧。）：用火焰焚烧。（2)2)烘箱热空气法：常用烘箱烘箱热空气法：常用烘箱160160处理处理2 2小时以上。小时以上。2 2、
21、湿热灭菌、湿热灭菌（1)1)水煮沸法：水煮沸水煮沸法：水煮沸100100，1515分钟以上。分钟以上。（2)2)高压蒸汽锅法（高压蒸汽锅法（autoclavingautoclaving）：高压锅）：高压锅（0.1013MPa0.1013MPa或或1.051.05/cm/cm2 2 或或1515磅磅/英寸英寸2 2 ）121121处理处理15153030分钟分钟 。（3)3)间歇灭菌法间歇灭菌法(tyndallization(tyndallization):100):100处理处理15-3015-30分钟，再置于分钟，再置于28283737下，如此反复三次。下，如此反复三次。（4)4)巴斯德消毒
22、法（巴斯德消毒法（pasteurization)pasteurization)：71.671.6处理处理1515分钟或分钟或62.962.9处理处理3030分钟。分钟。接种类型：斜面菌种；液体接种；穿刺接种接种类型：斜面菌种；液体接种；穿刺接种基本操作技术基本操作技术3 3：微生物分离培养技术微生物分离培养技术 微生物分离纯化微生物分离纯化在自然界，各种微生物常常混生在一起。为了在自然界，各种微生物常常混生在一起。为了利用某种微生物，必须将这种微生物从混杂群利用某种微生物，必须将这种微生物从混杂群体中分离出来，在适合的营养和生长条件下培体中分离出来，在适合的营养和生长条件下培养，产生大量的个体
23、。养，产生大量的个体。微生物的观察微生物的观察微生物个体微小，其个体形态一般需用显微镜才能看到。微生物个体微小，其个体形态一般需用显微镜才能看到。单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖，会单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长繁殖，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，称为形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落（菌落（colonycolony）。）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，则称为菌苔（当固体培养基表面众多菌落连成一片时，则称为菌苔（lawnlawn）。）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔在大小、形不同微生物在特定培养
24、基上生长形成的菌落或菌苔在大小、形状、光泽度、颜色、质地、硬度、边缘情况、透明度等方面具状、光泽度、颜色、质地、硬度、边缘情况、透明度等方面具有不同的特征，是微生物分类鉴定的重要依据。如细菌菌落具有不同的特征，是微生物分类鉴定的重要依据。如细菌菌落具有湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀和颜色有湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀和颜色一致等特征，霉菌、放线菌等微生物的菌落也具有各自相应的一致等特征，霉菌、放线菌等微生物的菌落也具有各自相应的特征。特征。在生产中，我们往往只需要某一种微生物，可采用涂布平板、在生产中，我们往往只需要某一种微生物，可采用涂布平板、平板划线等方法
25、获得这种微生物的菌落。平板划线等方法获得这种微生物的菌落。用固体培养基分离方法：用固体培养基分离方法：1.1.涂布平板法涂布平板法2.2.平板划线法平板划线法3.3.稀释倒平板法稀释倒平板法分离纯化操作步骤：分离纯化操作步骤：1.1.用涂布平板法从土壤中分离细菌：制土壤菌悬液用涂布平板法从土壤中分离细菌：制土壤菌悬液涂布分离涂布分离倒置培养倒置培养2.2.用平板划线法从腐烂水果中分离酵母和霉菌用平板划线法从腐烂水果中分离酵母和霉菌l 细菌菌落的分离要使用平板，而不采用斜面。细菌菌落的分离要使用平板，而不采用斜面。l 涂布平板分离法和平板划线分离法为什么能分离涂布平板分离法和平板划线分离法为什么
26、能分离出细菌的单菌落？出细菌的单菌落？l 如果进行分区平行划线，细菌单个菌落最可能出如果进行分区平行划线，细菌单个菌落最可能出现在哪一个区？如果进行连续画线，细菌单个菌现在哪一个区？如果进行连续画线，细菌单个菌落最可能出现在什么区域？落最可能出现在什么区域？l 在平板划线分离操作中，每次划平行线前都必须在平板划线分离操作中，每次划平行线前都必须烧掉接种环的剩余物。烧掉接种环的剩余物。l 平板倒置培养。平板倒置培养。微生物分离培养技术活动拓展微生物分离培养技术活动拓展学习了细菌菌落的分离和培养后，请设计实验学习了细菌菌落的分离和培养后，请设计实验方案，从自然环境分离并培养与人类生活关系方案，从自
27、然环境分离并培养与人类生活关系密切的其它微生物（如酵母菌、霉菌等）菌落。密切的其它微生物（如酵母菌、霉菌等）菌落。（可根据生活环境寻找特定的微生物。酵母菌（可根据生活环境寻找特定的微生物。酵母菌喜欢生活在含糖高的环境，霉菌多生长在偏酸喜欢生活在含糖高的环境，霉菌多生长在偏酸的环境，如水果、蔬菜的表面及其栽培土壤的环境，如水果、蔬菜的表面及其栽培土壤中。中。）基本操作技术基本操作技术4 4：培养基对微生物的选择：培养基对微生物的选择作用作用 培养基对微生物的选择作用培养基对微生物的选择作用 如果我们所需的微生物在样品中的数量很少，如果我们所需的微生物在样品中的数量很少，直接采用涂布平板法、平板划
28、线法就很难分离出来。直接采用涂布平板法、平板划线法就很难分离出来。为此，我们可以根据不同的微生物对营养物质（碳为此，我们可以根据不同的微生物对营养物质（碳源、氮源、生长因子等）、理化因素的不同要求，源、氮源、生长因子等）、理化因素的不同要求，设计出不同的培养基以抑制不需要的微生物的生长，设计出不同的培养基以抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。例如，要从土壤中分离获促进所需微生物的生长。例如，要从土壤中分离获得自生固氮菌时，常采用无氮源的培养基进行培养，得自生固氮菌时，常采用无氮源的培养基进行培养，可以抑制其他非固氮微生物的生长，从而将自生固可以抑制其他非固氮微生物的生长，从而将自生
29、固氮菌分离出来。氮菌分离出来。利用培养基选择培养所需的微生物利用培养基选择培养所需的微生物 在自然界混杂的微生物群体中，如果所需的某种微在自然界混杂的微生物群体中，如果所需的某种微生物只占少数，但其生长要求是已知的，那就可制生物只占少数，但其生长要求是已知的，那就可制作一种特别适合于这种微生物生长的培养基，从而作一种特别适合于这种微生物生长的培养基，从而把它选择培养出来。把它选择培养出来。选择培养方法主要有：选择培养方法主要有：（1 1）采用）采用加富培养基加富培养基进行选择。加富培养基就是在进行选择。加富培养基就是在培养基中加入所需微生物特别需要的某一营养物质，培养基中加入所需微生物特别需要
30、的某一营养物质，使它们的数量增加，以达到选择目的而设计的培养使它们的数量增加，以达到选择目的而设计的培养基。自然界中数量较少的微生物采用这种方法，可基。自然界中数量较少的微生物采用这种方法，可使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的使该微生物大大增殖，在数量上超过原有占优势的微生物，以达到加富培养的目的。用于加富的营养微生物，以达到加富培养的目的。用于加富的营养物质通常是所需微生物专门需要的碳源或氮源。例物质通常是所需微生物专门需要的碳源或氮源。例如，筛选纤维素分解菌可用纤维素，加富酵母菌可如，筛选纤维素分解菌可用纤维素，加富酵母菌可用较浓的糖液。用较浓的糖液。（2 2）用）用化学物质化学
31、物质进行选择。不同的微生物对某种化进行选择。不同的微生物对某种化学物质或者理化因素的反应不同，依此设计培养基并学物质或者理化因素的反应不同，依此设计培养基并经培养后，所需微生物可大大增殖，使之在数量上占经培养后，所需微生物可大大增殖，使之在数量上占优势，而其他微生物的生长受到抑制，从而达到选择优势，而其他微生物的生长受到抑制，从而达到选择培养的目的。培养的目的。化学物质常有染料（化学物质常有染料（结晶紫等）、结晶紫等）、抗生素等，抗生素等，理化因素常有温度、氧气、理化因素常有温度、氧气、pHpH值等。例如，分离某种值等。例如，分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的培养基上分离。抗生素抗性菌株
32、，可在加有抗生素的培养基上分离。土壤是分离微生物最好的菌源材料土壤是分离微生物最好的菌源材料 土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微土壤是微生物生活最适宜的环境，它具有微生物所需要的一切营养物质和微生物进行生长繁生物所需要的一切营养物质和微生物进行生长繁殖的各种条件，因此，土壤具有殖的各种条件，因此，土壤具有“微生物天然培微生物天然培养基养基”之称，这里的微生物数量最大，类型最多，之称，这里的微生物数量最大，类型最多，包括有细菌、放线菌、真菌等类群，是最丰富的包括有细菌、放线菌、真菌等类群，是最丰富的“菌种资源库菌种资源库”。基本操作技术基本操作技术5 5：微生物数量测定：微生物数量测定 测定
33、微生物的数量测定微生物的数量 一方面，在利用微生物发酵生产食品、饮料一方面，在利用微生物发酵生产食品、饮料等产品的过程中，要通过测定微生物的数量来观察产等产品的过程中，要通过测定微生物的数量来观察产品是否达到质量要求，如酸奶的生产中，为了检测产品是否达到质量要求，如酸奶的生产中，为了检测产品中乳酸细菌数量是否达到产品标准，需进行细菌数品中乳酸细菌数量是否达到产品标准，需进行细菌数量的测定；量的测定；另一方面，在食品、饮用水、生物医药制品另一方面，在食品、饮用水、生物医药制品的生产中，为防止病原微生物危害，需要检测微生物的生产中，为防止病原微生物危害，需要检测微生物数量以评估其卫生程度，如饮用水
34、常通过检测微生物数量以评估其卫生程度，如饮用水常通过检测微生物的数量来监测其水质。的数量来监测其水质。微生物的数量微生物的数量测定方法：测定方法：血球计数板计数血球计数板计数平板菌落计数平板菌落计数图图1 1 血球计数板构造血球计数板构造 图图 2 2 血球计数板构造血球计数板构造 A.A.正面图；正面图；B.B.纵切面图纵切面图 放大后的方格网，中间大方格为计数室放大后的方格网，中间大方格为计数室1.1.血球计数板；血球计数板；2.2.盖玻片；盖玻片；3.3.计数室计数室血球计数板计数血球计数板计数 血球计数板血球计数板 血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定血球计数板是一块特制的载玻
35、片，上面有一个特定的计数室，其的计数室，其面积为面积为mm2mm2，高为，高为0.1mm0.1mm，在，在mm2mm2的面的面积里又被刻划成积里又被刻划成2525个（或个（或1616个）中格，每个中格再划分个）中格，每个中格再划分成成1616个（或个（或2525个）小格，计数室都是由个）小格，计数室都是由400400个小格组成。个小格组成。其血球计数板法的计数方法为：将稀释的样品滴在其血球计数板法的计数方法为：将稀释的样品滴在血球计数板上，在显微镜下计算计数室中的个中格血球计数板上，在显微镜下计算计数室中的个中格(一般选一般选4 4个角和中央的一个中格个角和中央的一个中格)的总菌数（的总菌数（
36、A A），按下），按下面公式求出每毫升样品所含的菌数。每毫升样品所含菌面公式求出每毫升样品所含的菌数。每毫升样品所含菌数数A/5A/52525（或（或1616）10 00010 000稀释倍数。稀释倍数。但此法不能区分死菌与活菌，所得结果是包括死菌但此法不能区分死菌与活菌，所得结果是包括死菌在内的总菌数。在内的总菌数。平板菌落计数平板菌落计数 平板菌落计数法为一种活菌计数法。方法的原平板菌落计数法为一种活菌计数法。方法的原理是将样品适当稀释接种在平板上，培养后可形成理是将样品适当稀释接种在平板上，培养后可形成菌落，一个菌落一般来源于一个细胞，统计菌落数菌落，一个菌落一般来源于一个细胞，统计菌落
37、数即可知样品的活菌数。即可知样品的活菌数。平板菌落计数法能测出样品中的活菌数，现仍平板菌落计数法能测出样品中的活菌数，现仍是生产上常用的一种测定菌数的有效方法，广泛应是生产上常用的一种测定菌数的有效方法，广泛应用于微生物数量的检测。但该法较为耗时，需要培用于微生物数量的检测。但该法较为耗时，需要培养一段时间才能取得结果。养一段时间才能取得结果。u比较血球计数板法和平板菌落计数法的优比较血球计数板法和平板菌落计数法的优缺点。缺点。u说明用血球计数板法计数时造成误差与哪说明用血球计数板法计数时造成误差与哪些因素有关？些因素有关？微生物数量测定活动拓展微生物数量测定活动拓展 学习了计数土壤中细菌数量
38、的方法，请尝学习了计数土壤中细菌数量的方法，请尝试设计实验方案，测定其他环境中微生物的数量，试设计实验方案，测定其他环境中微生物的数量，如自来水、池塘水、空气、酸奶、干酵母粉等。如自来水、池塘水、空气、酸奶、干酵母粉等。微生物生物技术的应用微生物生物技术的应用微生物技术在工业上的应用微生物技术在工业上的应用微生物技术在医药上的应用微生物技术在医药上的应用微生物与人类健康微生物与人类健康 生物制品（菌苗、疫苗等），微生物代谢产物生物制品（菌苗、疫苗等），微生物代谢产物（抗生素、维生素、酶等），由遗传工程菌生产的（抗生素、维生素、酶等），由遗传工程菌生产的各种药物如胰岛素、干扰素、白细胞介素，微生
39、物各种药物如胰岛素、干扰素、白细胞介素，微生物生物转化形成的甾体激素类药物。生物转化形成的甾体激素类药物。微生物技术在农业上的应用微生物技术在农业上的应用l食药用真菌食药用真菌 l微生物肥料（细菌肥料、微生物肥料（细菌肥料、54065406抗生菌肥料、复合微生抗生菌肥料、复合微生物肥料、菌根菌肥等）物肥料、菌根菌肥等）l微生物农药（细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、微生物农药（细菌杀虫剂、真菌杀虫剂、病毒杀虫剂、农用抗生素等）农用抗生素等）l微生物饲料（单细胞蛋白和菌体蛋白饲料、秸秆饲料、微生物饲料（单细胞蛋白和菌体蛋白饲料、秸秆饲料、藻类饲料、微生物饲料添加剂）藻类饲料、微生物饲料添加剂）
40、食药用真菌食药用真菌杏鲍菇杏鲍菇 白灵菇白灵菇 秀珍菇秀珍菇 鲍鱼菇鲍鱼菇 杏鲍菇杏鲍菇金针菇金针菇平菇平菇茶树菇茶树菇尖顶羊肚菌尖顶羊肚菌松松 茸茸猴头菇猴头菇毛木耳毛木耳灵 芝虫草虫草蛹虫草蛹虫草云云 芝芝香菇香菇双孢蘑菇双孢蘑菇草菇草菇大秃马勃大秃马勃印度块菌印度块菌微生物肥料微生物肥料根瘤根瘤棉铃虫幼虫的环节处被核型多角体病毒感染棉铃虫幼虫的环节处被核型多角体病毒感染.微生物农药微生物农药微生物在环境保护中的作用微生物在环境保护中的作用微生物对农药的降解微生物对农药的降解微生物对有毒元素的转化微生物对有毒元素的转化微生物降解生活污水、工业污水和生活垃圾等微生物降解生活污水、工业污水和生
41、活垃圾等 。微生物对合成聚合物的降解微生物对合成聚合物的降解微生物生态环境保护剂微生物生态环境保护剂利用微生物生产易降解的医用塑料、快餐盒；利用微生物生产易降解的医用塑料、快餐盒；微生物与污水处理微生物与污水处理 污水处理的方法有物理法、化学法和生物法。各种方法都有其特点，可污水处理的方法有物理法、化学法和生物法。各种方法都有其特点，可以相互配合、相互补充。目前应用最广是生物学方法，其优点是效率高、以相互配合、相互补充。目前应用最广是生物学方法，其优点是效率高、费用低、简单方便。费用低、简单方便。好氧生物处理好氧生物处理 微生物在有氧条件下，吸附环境中的有机物，并将有机物氧化分解成无机微生物在
42、有氧条件下，吸附环境中的有机物，并将有机物氧化分解成无机物，使污水得到净化，同时合成细胞物质。物，使污水得到净化，同时合成细胞物质。微生物在污水净化过程，以活性污微生物在污水净化过程，以活性污泥和生物膜的主要成分等形式存在。泥和生物膜的主要成分等形式存在。活性污泥法活性污泥法（activated sludge processactivated sludge process）又称曝气法。是利用含有好氧微生物的活性污泥又称曝气法。是利用含有好氧微生物的活性污泥 ，在通气条件下，使污水净，在通气条件下，使污水净化的生物方法。该法已成为处理有机废水的最主要的方法。化的生物方法。该法已成为处理有机废水的
43、最主要的方法。在污水处理过程中，活性污泥具有很强的吸附、氧化和分解有机物的能力。在污水处理过程中，活性污泥具有很强的吸附、氧化和分解有机物的能力。在静止状态时，又具有良好的沉降性能。它是一种特殊的、复杂的生态系统，在静止状态时，又具有良好的沉降性能。它是一种特殊的、复杂的生态系统，在多种酶的作用下进行着复杂的生化反应。活性污泥中的微生物主要是细菌，在多种酶的作用下进行着复杂的生化反应。活性污泥中的微生物主要是细菌，占微生物总数的占微生物总数的90%90%95%95%。占地面积小，基建投资省，出水水质高的特点 厌氧生物处理厌氧生物处理 厌氧生物处理是在缺氧条件下，利用厌氧性微生物（包括厌氧生物处
44、理是在缺氧条件下，利用厌氧性微生物（包括兼性厌氧微生物）分解污水中有机物污染物的方法。又称厌氧兼性厌氧微生物）分解污水中有机物污染物的方法。又称厌氧消化或厌氧发酵法。因为发酵产物产生甲烷，又称消化或厌氧发酵法。因为发酵产物产生甲烷，又称甲烷发酵甲烷发酵。此法既能消除环境污染，又能开发生物能源，所以备受人们重此法既能消除环境污染，又能开发生物能源，所以备受人们重视。视。微生物对重金属的转化微生物对重金属的转化 自然界存在多种重金属，例如，汞、砷、自然界存在多种重金属，例如，汞、砷、铅、镉、铬等，这些重金属并非生物生活所必铅、镉、铬等，这些重金属并非生物生活所必需，但达到一定浓度时，会对生物产生抑
45、制和需，但达到一定浓度时，会对生物产生抑制和致死作用。致死作用。微生物与石油污染微生物与石油污染微生物降解微生物降解微生物与环境监测微生物与环境监测 环境监测环境监测 包括环境分析、物理测定和生物监测。包括环境分析、物理测定和生物监测。所谓生物所谓生物监测就是利用生物对环境污染所发生的各种信息作为判断环境污监测就是利用生物对环境污染所发生的各种信息作为判断环境污染状况的一种手段。染状况的一种手段。生物长期生活在自然界中，不仅可反映出多生物长期生活在自然界中，不仅可反映出多种因子污染的综合效应，而且也能反映环境污染的历史状况。故种因子污染的综合效应，而且也能反映环境污染的历史状况。故生物监测可以
46、弥补物理、化学分析测试的不足，特别是微生物，生物监测可以弥补物理、化学分析测试的不足，特别是微生物，与环境关系极为密切，因此微生物学方法在环境监测中占有特殊与环境关系极为密切，因此微生物学方法在环境监测中占有特殊的地位。的地位。粪便污染指示菌粪便污染指示菌 粪便污染指示菌的存在，是水体受过粪便污染的指标。根粪便污染指示菌的存在，是水体受过粪便污染的指标。根据对正常人粪便中微生物的分析测定结果，采用大肠菌群及粪据对正常人粪便中微生物的分析测定结果，采用大肠菌群及粪链球菌作为指标较为合适，其中以前者较为广用。链球菌作为指标较为合适，其中以前者较为广用。大肠菌群大肠菌群（coliformcolifo
47、rm group group，简称简称coliformcoliform）是指一大群）是指一大群与大肠杆菌相似的好氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，与大肠杆菌相似的好氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们能在它们能在4848小时内发酵乳糖产酸产气，包括埃希氏菌属、柠檬小时内发酵乳糖产酸产气，包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属（酸杆菌属（CitrobacterCitrobacter）、肠杆菌属（）、肠杆菌属（EnterbacterEnterbacter）、克雷）、克雷伯氏菌属（伯氏菌属（KlebsiellaKlebsiella）等。检测水体中总大肠菌群的方法主）等。检测水体中总大肠菌群的方法主要是要
48、是MPN(mostMPN(most probable number probable number）试验法，即发酵法和滤膜试）试验法，即发酵法和滤膜试验法。验法。大肠菌群数量的表示方法有两种，大肠菌群数量的表示方法有两种，其一是其一是大肠菌群数大肠菌群数，亦称，亦称大肠菌群指数大肠菌群指数，即，即1L水中含有的大肠菌群数量。其二是水中含有的大肠菌群数量。其二是大大肠菌群值肠菌群值，指水样中可检出一个大肠菌群数的最小水样体积，指水样中可检出一个大肠菌群数的最小水样体积（mL）。微生物学发展趋势微生物学发展趋势研究向纵深和分子水平发展研究向纵深和分子水平发展自自19901990年代以来，由于年代以
49、来，由于“人类基因组计划人类基因组计划”推动，促进微推动，促进微生物学发展：生物学发展：微生物基因组学微生物基因组学微生物信息学微生物信息学微生物分子进化学微生物分子进化学微生物功能基因组学微生物功能基因组学微生物结构生物学微生物结构生物学微生物蛋白组学微生物蛋白组学后基因组生物学时代的到来后基因组生物学时代的到来微生物学分支学科特点微生物学分支学科特点交叉性强：微生物进化工程学、细菌冶金学交叉性强：微生物进化工程学、细菌冶金学自觉度高：微生物的基因工程、生化工程、细胞工程、自觉度高：微生物的基因工程、生化工程、细胞工程、蛋白质工程、代谢途径工程和抗体工程等。蛋白质工程、代谢途径工程和抗体工程
50、等。覆盖面广：工业、农业、医药、环保和国防等。覆盖面广：工业、农业、医药、环保和国防等。在微生物学发展中有重要贡献的人在微生物学发展中有重要贡献的人物物吕文虎克（吕文虎克（Antony van Leeuwenhoek）（荷兰，）（荷兰，1632-1723）列文虎克利用业余时间制造过列文虎克利用业余时间制造过400多架多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为单式显微镜和放大镜，放大率一般为50200倍，倍，巴斯德（巴斯德（Louis Pasteur)（法国，（法国，1822-1895）科赫（科赫（Robert Koch)（德国，（德国，1843-1910）贡献：贡献：1 1、建立微生物学研究、建立微
