1、 PCR PCR检测中假病毒检测中假病毒内标和外标的制备 黄秋英 厦门大学分子诊断实验室 外标和内标简介外标和内标简介 用来监控试剂盒本身是否失效以及操作是否正常，用以排除因试剂盒失效或误操作导致的“假阴性”。外标通常是含有待测基因片段的一定浓度的核酸序列，经一系列的稀释后与待测标本一起进行扩增，制作PCR扩增产物和靶核酸含量的标准曲线,根据待测标本的扩增产物量即可推算出靶核酸的绝对含量。在应用于实时荧光PCR时，由于Ct值的重现性好以及Ct值与起始模板之间存在线性关系，实时荧光PCR可利用标准曲线对未知样品进行定量测定。?阳性质控品(外标)?阴性质控品 用来排除试剂或环境污染导致的“假阳性”
2、。基因诊断试剂盒中的质控品是评价检测结果是否可靠的必需依据。质控品包括：阳性质控品(外标）、阴性质控品以及最近开始采用的抑制质控品（内标）。?竞争性内标 一段与被检测目的基因具有相同的引物序列而不同的探针检测区的片段，二者一起竞争引物，因而能够真实的检测到待测基因中是否存在抑制。由于采用相同的引物，内标在扩增过程中必然与待测基因相互竞争，含量低的一方势必受到抑制，通常当双方浓度相差100倍以上时，浓度低的一方就无法扩增。?非竞争性内标 指内标与待测基因具有不同的扩增引物，因而非竞争性内标与待测目的基因之间不存在引物竞争关系。但在引物设计时必须考虑到多种PCR中的引物之间的相互影响，并且要选择一
3、个合适的内标的使用浓度，以防止相互之间的抑制，影响检测试剂盒的灵敏度。?抑制质控品抑制质控品(内标内标)直接加到待测标本中，同时提取和检测，以确保检测该标本时是否出现抑制或假阴性。内标分为竞争性内标和非竞争性内标。假病毒外标和内标的优点假病毒外标和内标的优点?真实性 纯的核酸，像PCR产物、克隆的质粒、人工合成的核酸片 段，和要提取的标本核酸存在着很大的差别，不能够真正体 现质控品的意义。以病毒为例，病毒是一个核酸与蛋白的复 合体，病毒核酸的提取都有一个裂解的过程，而纯的核酸是 不存在这一过程的，所以就无法真正体现病毒核酸的提取过 程。病毒最理想的就是质控品它本身，但由于它的致病性，我们不可能
4、用病毒作为质控品，所以我们就模拟天然病毒的 形态，通过基因工程的手段构建出的含有目的核酸片段与包 装蛋白形成的复合体（即假病毒）来真实的体现病毒核酸的 提取过程。?稳定性 假病毒是核酸片段与包装蛋白形成的复合体，所以假病毒 内标、外标能耐受核酸酶，在血清等物质中可以长期、稳定 的存在，且易于保存。DNA假病毒 外标、内标的制备 一、实验设计一、实验设计、实验设计：利用M13mp18噬菌体克隆技术，提出DNA假病毒质控品这一新的质控品制备技术，并以乙型肝炎病毒（HBV）的检测为模型，说明这一技术制备的质控品。二、实验内容二、实验内容 1）制备HBV DNA假病毒外标 2）制备RBCS（1,5二磷
5、酸核酮糖羟化酶基因)DNA假病毒内标 3）DNA假病毒的质量评估 M13噬菌体简介噬菌体简介?M13噬菌体是丝状噬菌体，其基因大小为6407bp，是单链闭环DNA分子。?M13mp18是改造过的M13噬菌体克隆载体，其上面带有一个通用的多克隆位点（MCS），可以方便的将外源DNA片段克隆进去。并且因其插入了LacZ基因，可以用蓝白噬菌斑筛选方法，得到含有目的片段的阳性克隆。利用M13噬菌体表达与纯化方法，就可以得到大量的含有外源DNA片段的噬菌体。HBV DNA假病毒外标和RBCS DNA假病毒内标的制备 DNA假病毒的扫描电镜观察（1X50000）HBV DNA假病毒 RBCS DNA假病毒
6、 大量培养并纯化的噬菌体假病毒，经负染后，用50,000X的扫描电镜观察，其形态为典型的M13噬菌体结构，成丝状，外围是包装蛋白，中间是单链DNA,长约180nm,宽约20nm。HBV DNA假病毒阳性克隆的实时荧光PCR验证 0510152025303540-1000100200300400500600700 CtFluorescenceRBCS DNA假病毒阳性克隆实时荧光PCR验证 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C Lane 1:blank Lane 2:L3 Lane 3:L3+DNase I Lane 4:L4 Lane 5:L4+DNase I Lane 6:p
7、UC19/Msp I marker Lane 7:L5 Lane 8:L5+DNase I Lane 9:L6 Lane 10:L6+DNase I A HBV DNA假病毒；B 质粒；C 单链DNA DNA假病毒、质粒及单链DNA耐受DNA酶实验比较 A B（第1天）（37,第30天）DNADNA假病毒在血清中的稳定性假病毒在血清中的稳定性 取大量制备的HBV DNA假病毒，用阴性血清按1/10梯度稀释成L1-L7共7个梯度。稀释好的HBV DNA假病毒放入37温箱中孵育不同时间后，用实时PCR检测其浓度的变化。取样时间分别为5天、10天、15天、30天。内标对外标定量工作曲线的影响内标对外
8、标定量工作曲线的影响 将HBV DNA假病毒外标作梯度稀释，考察RBCS内标对HBV外标工作曲线的影响 红色箭头：未加RBCS假病毒内标 黑色箭头：加RBCS假病毒内标 外标对内标的影响外标对内标的影响 理想的内标是不论外标浓度的高低，内标本身都能够扩增。将HBV假病毒外标作梯度稀释，加入大约1000 copies/mL的RBCS假病毒内标后，用实时荧光PCR考察不同浓度的HBV假病毒外标对RBCS假病毒内标的影响。小结小结 用M13mp18载体构建的DNA假病毒，具有以下几个优点：1、构建方法简单 2、稳定性好：能够耐受核酸酶的降解，且能在血清长期保存 3、真实性：能够真正体现病毒的提取过程
9、 4、生物安全性 RNA假病毒 外标、内标的制备 一、实验设计一、实验设计 利用RNA假病毒技术，制备可用于 SARS病毒RT-PCR检测的外标及可用于RNA病毒检测分析的内标。二、实验内容二、实验内容 制备SARS RNA假病毒外标 制备RBCS RNA假病毒内标 RNA假病毒的质量评估 MS2 MS2噬菌体简介噬菌体简介 MS2噬菌体2 2噬菌体简介?MS2噬菌体是正义单链RNA病毒,基因组全长为3569bp，编码4个蛋白质。?每个MS2噬菌体是含有180个拷贝的衣壳蛋白,一拷贝的成熟蛋白，包裹一分子RNA的正二十面体。d 27nm RNA假病毒的形成过程假病毒的形成过程 SARS RNA
10、假病毒外标和RBCS RNA假病毒内标的制备 RNA假病毒的透射电镜观察(1X100000)A SARS RNA假病毒 B RBCS RNA假病毒 SARS RNA假病毒阳性克隆的实时荧光逆转录PCR验证 0102030400100200300400500600FluorescenceCtRBCS RNA假病毒阳性克隆的实时荧光逆转录PCR验证 RNARNA假病毒耐受DNADNA酶、RNARNA酶实验 用混合血清溶解，第0天实时荧光逆转录PCR的效果 用混合血清溶解，37oC第7天实时荧光逆转录PCR的效果 SARS RNA假病毒在血清中的稳定性假病毒在血清中的稳定性 内标对外标定量工作曲线的
11、影响内标对外标定量工作曲线的影响 黑色：未加RBCS假病毒内标 灰色：加RBCS假病毒内标 外标对内标的影响外标对内标的影响 RNA假病毒技术采用基因工程表达的蛋白RNA复合体，具有蛋白外壳包裹RNA的结构特点，对RNA提供了有效地保护，使包裹的RNA能耐受核酸酶的降解,从而彻底解决了RNA不稳定问题。这一技术不仅可以用于构建SARS病毒检测试剂盒的质控品，还可以用于构建其它RNA病毒检测试剂盒的质控品。制备的作为抑制质控品的RBCS RNA假病毒，可以直接加入待测标本中，对病毒的裂解、提取过程进行质控，这更是体外转录RNA所无法做到的。与标本同时完成提取和RT-PCR检测过程,可以有效监控假阴性出现。小结小结
