1、第六单元 感染性疾病的免疫学检测感染性疾病的免疫学检测实验一实验一 乙型肝炎病毒表面抗体检测乙型肝炎病毒表面抗体检测 实验目的实验目的酶联免疫吸附试验（ELISA）是感染性疾病的常用检验方法通过乙型肝炎病毒表面抗体检测实验，掌握ELISA的基本实验原理及操作步骤 熟悉影响实验结果的各种因素，学习正确分析判断实验结果及了解检测的临床意义。实验原理实验原理 采用纯化的乙型肝炎表面抗原（采用纯化的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被反应板，）包被反应板，加入待测标本，同时加入标记了辣根过氧化物酶的加入待测标本，同时加入标记了辣根过氧化物酶的HBsAg（HBsAg-HRP），当标本中存在抗），当标本中存
2、在抗HBs时，该抗时，该抗-HBs与与包被的包被的HBsAg结合并与酶结合物结合形成结合并与酶结合物结合形成HBsAg-抗抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，加入复合物，加入TMB底物显色，显色的强弱与底物显色，显色的强弱与待测标本中的抗待测标本中的抗HBs含量成正比。含量成正比。试剂及器材试剂及器材v 包被有HBsAg的微孔板v HBsAg-HRPv 阳性、阴性及弱阳性对照血清v 显色剂，终止液v 酶标仪v 洗板机取出包被好抗原的酶标板取出包被好抗原的酶标板1.1.加样加样标记各孔，加入标记各孔，加入50L/50L/孔孔1234阴阴性性空空白白阳阳性性待待测测2.2.加酶结合物加酶结合物3
3、.3.显色显色加入终止溶液加入终止溶液1 1滴滴/孔，混匀孔，混匀酶标仪上读取吸光度值4.4.测吸光度测吸光度实验流程实验流程各孔加入酶标抗原各孔加入酶标抗原1 1滴滴/孔孔用洗涤液洗涤用洗涤液洗涤5 5次次3737，30min30min甩干孔内液体甩干孔内液体加入显色液加入显色液A A、B B各一滴各一滴/孔孔3737，15min15min5弱弱阳阳性性操作步骤操作步骤1.1.将包被孔编号，分别加入标本、阴性对照、阳性对照、弱将包被孔编号，分别加入标本、阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及空白对照各阳性对照及空白对照各5050l l 。2.2.每孔加入酶结合物每孔加入酶结合物1 1滴（空白对照孔
4、除外），充分混匀，滴（空白对照孔除外），充分混匀，置置3737孵育孵育 3030分钟。分钟。3.3.甩去孔中液体，加洗涤液注满各孔，静置甩去孔中液体，加洗涤液注满各孔，静置5 5秒，甩干，重秒，甩干，重复复5 5次后拍干。次后拍干。4.4.每孔加显色剂每孔加显色剂A A液、液、B B液各液各1 1滴，充分混匀，置滴，充分混匀，置3737孵育孵育1515分钟。分钟。5.5.每孔加入终止液每孔加入终止液1 1滴，混匀。滴，混匀。6.6.在酶标仪上于在酶标仪上于450nm450nm波长处读取吸光度值（波长处读取吸光度值（A A），以空白孔），以空白孔校零点，分别测定阴性、阳性、弱阳性对照及样本孔的校
5、零点，分别测定阴性、阳性、弱阳性对照及样本孔的A A450450值。值。结果判断结果判断 样本孔吸光度值（样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度阴性对照孔吸光度值（值（N）2.1判断为阳性。判断为阳性。实验讨论实验讨论vELISA是临床常用的感染性疾病免疫学检测方法，是临床常用的感染性疾病免疫学检测方法，包括间接法、竞争法、捕获法、双抗体夹心法及包括间接法、竞争法、捕获法、双抗体夹心法及双抗原夹心法等方法，讨论各种方法的临床应用。双抗原夹心法等方法，讨论各种方法的临床应用。v分析分析ELISA检测过程中的各种影响因素，探讨本检测过程中的各种影响因素，探讨本次实验结果的准确性。次实验结果的准确性
6、。v讨论乙型肝炎病毒表面抗体检测结果的临床意义。讨论乙型肝炎病毒表面抗体检测结果的临床意义。注意事项注意事项v 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，避免溅出，避免产生气泡。避免溅出，避免产生气泡。v 洗涤必须彻底，防止产生假阳性。洗涤必须彻底，防止产生假阳性。v 严格控制温育温度和时间严格控制温育温度和时间。实验二实验二 HBsAg不同检测方法的最低检测限不同检测方法的最低检测限（验证性实验）（验证性实验）实验目的实验目的1.用已知浓度HBsAg阳性血清作系列稀释，分别采用胶体金免疫层析法、ELISA法两种方法将不同稀释度的HBsAg进行多次重复定性
7、检测 2.将所得实验数据进行分析处理，以验证不同方法的最低检测限 3.初步掌握验证实验的原理、步骤及注意事项。熟悉定性检测的性能验证方法实验方案实验方案胶体金法酶免疫技术乙肝表面抗原的定性检测最低检测限验证确定临界值浓度 制备评价用样本 评价方法检测限判断结果实验原理（一）实验原理（一）胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术 一端粘贴了含有金标记的一端粘贴了含有金标记的HBsAg抗体的硝酸纤维素抗体的硝酸纤维素膜试纸条，当其下端浸入血清标本后由于毛细管作用向另膜试纸条，当其下端浸入血清标本后由于毛细管作用向另一端移动，移动中复溶金标记的一端移动，移动中复溶金标记的HBsAg抗体，若标本中含抗体，
8、若标本中含有有HBsAg即可形成金标记抗即可形成金标记抗HBsAg-HBsAg复合物，该复复合物，该复合物移动至测试区时，与固定在载体膜上的合物移动至测试区时，与固定在载体膜上的HBsAb结合结合而被固相化并显示红色线条（阳性条带），多余的金标记而被固相化并显示红色线条（阳性条带），多余的金标记抗体则越过该区域并与质控区中抗同一种属来源的抗体则越过该区域并与质控区中抗同一种属来源的IgG结结合显示红色（质控条带）。合显示红色（质控条带）。AgAbAb显色剂显色剂Ev 将已知的纯化抗体（将已知的纯化抗体（HBsAbHBsAb）吸附于固相载体上加入待）吸附于固相载体上加入待检标本（含相应抗原检标本
9、（含相应抗原HBsAgHBsAg）与之结合。洗涤后，加入）与之结合。洗涤后，加入酶标抗体（酶标抗体（HRP-HBsAbHRP-HBsAb）形成夹心，加酶底物溶液显色）形成夹心，加酶底物溶液显色进行测定。进行测定。实验原理（二）实验原理（二）酶免疫技术（酶免疫技术（ELISA）双抗体夹心法实验原理（三）实验原理（三）定值参比血清做系列稀释后重复检测确定临界值C50确定最低检测限（+20%样本）最低检测限的验证根据C50制备评价血清-20%样本+20%样本实验试剂及器材实验试剂及器材1.实验试剂实验试剂 HBsAg国家标准物质（浓度为国家标准物质（浓度为5ng/ml），），HBsAg质控血清，质控
10、血清，HBsAg阴性对照、阳性对照、阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清，弱阳性对照血清，胶体金试剂盒，胶体金试剂盒，ELISA试剂试剂盒，盒，MEIA试剂盒。试剂盒。2.实验器材实验器材 酶标仪、洗板机、恒温水浴箱、吸水纸、酶标仪、洗板机、恒温水浴箱、吸水纸、移液器、微量加样器吸头等。移液器、微量加样器吸头等。操作步骤操作步骤（一）确定临界值浓度（一）确定临界值浓度HBsAg国家标准物质(5ng/ml)不同稀释浓度重复检测系列稀释阴性结果占50%该浓度即为该浓度即为临界值临界值C50C50阳性结果占50%记录结果、统计C5C5C50C50C95C95临界值临界值表表1.不同浓度不同浓度HBsA
11、g标准物质稀释参照表标准物质稀释参照表试管序号试管序号HbsAg(5ng/ml)HbsAg(5ng/ml)（ulul）阴性血清阴性血清（ulul）终体积（终体积（ulul）终浓度（终浓度（ng/mlng/ml）1 11001000 01001005 52 2808020201001004 43 3606040401001003 34 4505050501001002.52.55 5404060601001002 26 6202080801001001 17 7101090901001000.50.58 85 595951001000.250.259 92 298981001000.10.110
12、101 199991001000.050.0511110.20.299.899.81001000.010.01（二）胶体金操作方法（二）胶体金操作方法 顺序将胶体金试纸条浸入血清（不要超过最高检测线）5秒钟后取出，平置，20分钟后判断结果。（三）（三）ELISA操作步骤操作步骤1.加样加样 不同稀释度的阳性血清（均做双孔测定）及阴性对不同稀释度的阳性血清（均做双孔测定）及阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清，分别加入对应的反应孔，照、阳性对照、弱阳性对照血清，分别加入对应的反应孔，留留1孔做空白对照，置孔做空白对照，置37 水浴水浴60min。2.加酶加酶 每孔加入酶标记抗体每孔加入酶标记抗体5
13、0ul,空白对照孔不加，置空白对照孔不加，置37水浴水浴30min。3.洗涤洗涤 甩去各孔内液体，拍干，用洗涤液洗孔甩去各孔内液体，拍干，用洗涤液洗孔6次，每次均次，每次均拍干。拍干。4.加酶底物加酶底物/色原溶液色原溶液 加显色剂加显色剂A液、液、B液每孔各液每孔各50ul，37水浴水浴30min显色。显色。5.加终止液加终止液 每孔每孔50ul。6.读数读数 在酶标仪上于在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度值（波长处读取吸光度值（A），以），以空白孔校零点，分别测定阴性对照、阳性对照、弱阳性对空白孔校零点，分别测定阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及样本孔的照及样本孔的A值。值。操作实例：操
14、作实例：ELISA(ELISA(双抗体夹心法）双抗体夹心法）试剂室温平衡稀释阳性标准物质血清顺序加样温育加酶结合物 温育 洗板 洗板显色读取吸光度,判断结果结果判断结果判断检测次数检测次数阳性结果次数阳性结果次数阳性结果所占阳性结果所占百分比百分比C50准确性判定准确性判定14013次次32.5%不准确或不可信不准确或不可信（统计学的（统计学的错误率为错误率为5%）27次次67.5%2401426次次35%65%准确或可信准确或可信 C50可信取决于实际检测结果以及检测的样本数量可信取决于实际检测结果以及检测的样本数量 C50C50是否准确的判断：是否准确的判断：根据浓度为根据浓度为C C50
15、50的样本在的样本在4040次检测中得到阳性结果的次数判断次检测中得到阳性结果的次数判断C C5050是否准确（表是否准确（表2 2）。表）。表2 2表2 判断C50是否准确表表3.重复检测次数与样本的实际浓度重复检测次数与样本的实际浓度阳性结果 重复性检测总次数次数百分比真正百分比样本的实际浓度201050%30%70%C30C70402050%35%65%C35C651005050%40%60%C40C60表表4.-20%4.-20%+20%+20%浓度范围是否包含了浓度范围是否包含了C5-C95C5-C95区间区间+20%阳性结果90%(36/40)-20%+20%浓度范围包含了C5C9
16、5区间；用该方法检测，C5020%的样本检测结果一致-20%阴性结果90%(36/40)如果C50估计不准，那么-20%到+20%浓度范围也会变化，这将导致浓度范围的一侧落在C5C95区间之外。最低检测限的判断最低检测限的判断v若若-20浓度的样本阴性结果次数和浓度的样本阴性结果次数和+20浓度浓度的样本阳性结果次数符合表的样本阳性结果次数符合表4，,则说明临界值则说明临界值可信，而且可信，而且+20浓度即为最低检出限。浓度即为最低检出限。实验注意事项实验注意事项加样的准确性：加样及稀释样品时应准确加样的准确性：加样及稀释样品时应准确标准浓度的样品应按浓度顺序加样，及时更换微量加样器标准浓度的
17、样品应按浓度顺序加样，及时更换微量加样器吸头防止交叉污染吸头防止交叉污染实验中同时设置阴性、阳性、实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性对照弱阳性对照和空白对照和空白对照洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗过猛过急导致假阴性洗过猛过急导致假阴性严格控制反应时间和显色时间严格控制反应时间和显色时间胶体金试条法结果应观察胶体金试条法结果应观察3030分钟分钟实验结果分析实验结果分析两种方法的实验结果进行汇总、统计其阳性及阴性次数，并计算其阳性次数及阴性次数的百分比，以分析确定临界值C50。在临界值C50的基础上，重复测定并记录+20%浓度
18、样本的检测结果，并计算阳性次数及阳性次数百分比，通过对照表4分析与之是否相符，最终确定+20%是否为可信的最低检测限。实验小结实验小结v 总结本实验中两种方法的最低检测限与试剂盒的给定值总结本实验中两种方法的最低检测限与试剂盒的给定值是否相符。是否相符。v 总结实验过程中的操作是否规范，实验过程中应该注意总结实验过程中的操作是否规范，实验过程中应该注意哪些问题。哪些问题。实验讨论实验讨论 基本概念：基本概念：v C50:是一个临界值，是将阳性标本做系列稀释后，能够获得50%阳性和50%阴性结果的测试物的浓度，要保证C50的重复性较好应保证该临界浓度+20%处于95%的区间内。v C5：指一份样
19、本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性的结果时该分析物得浓度。（低于C50浓度的20%）.v C95：指一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性的结果时该分析物得浓度。（高于C50浓度的20%）。实验讨论实验讨论v重复性验证实验：重复检测C5、C50、C95样本各40次；确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比；评价其临界浓度是否准确；评价+20%-20%的浓度范围是否包含于这种方法的95%区间。实验三实验三 抗链球菌溶血素抗链球菌溶血素O O检测检测 实验目的实验目的1.掌握检测ASO的原理和方法、操作注意事项及结果的判断分析 2.了解不同方法学的优点与缺点3.了解ASO检测不同方
20、法的临床应用价值ASO检测方法全自动免疫比浊法乳胶凝集实验 溶血抑制法定量检测半定量检测定性检测采用乳胶凝聚法和全自动免疫比浊法进行实验，通过采用乳胶凝聚法和全自动免疫比浊法进行实验，通过比较掌握两种方法的原理及各自的特点比较掌握两种方法的原理及各自的特点抗链球菌溶血素“O”的检测实验原理实验原理一、乳胶凝集实验一、乳胶凝集实验实验试剂及器材实验试剂及器材v实验试剂：链球菌溶血素“O”，10%乳胶颗粒悬液，阴性、阳性对照血清，pH8.2的甘氨酸缓冲盐水v实验器材：试管、反应板、旋转摇床、微量移液器、微量加样器、毛细滴管等操作步骤操作步骤v 致敏乳胶颗粒的制备：用蒸馏水将10%乳胶悬液稀释至1%
21、2%，再将链球菌溶血素“O”溶于pH8.2的甘氨酸缓冲盐水中，逐滴加入稀释的乳剂悬液中(1%乳胶悬液1ml可吸附0.11mg物质），同时摇动使之充分混匀，放置室温3060min，4000r/min离心3045min，弃上清，沉淀用同一甘氨酸缓冲盐水恢复悬浮状态。操作步骤操作步骤v 稀释血清：将待检血清、阴性血清、阳性血清分别用生理盐水作1:20稀释，备用。v 加样：在凝集实验反应板上取三格，用毛细滴管分别加入稀释待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul。然后每格加入链球菌溶血素“O”致敏乳胶颗粒试剂1滴。v 反应：反应板充分混匀后连续摇动23min后与对照比较，观察结果。结果判断结果判断v“+”
22、全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明。v“+”大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍浑浊。v“+”约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较浑浊v“+”有少许凝集，液体呈浑浊。v“-”液滴呈原有的均匀乳状。v 出现“+”以上凝集判为阳性。间接乳胶凝集实验的结果判断间接乳胶凝集实验的结果判断实验注意事项实验注意事项试剂应充分摇匀。观察结果应及时，时间过长易造成假阳性。血清稀释应准确，结果判断应仔细观察。实验中同时设置阴性、阳性及空白对照测定ASO浓度较高样品时，应对样品进行稀释后再分析，以保证结果的可靠性。全自动速率散射比浊方法全自动速率散射比浊方法 实验原理实验原理v 可溶性抗原、抗体在液相中结合
23、，形成抗原抗体复合物而出现浊度。当抗体保持中等过量时，形成的复合物随抗原量增加，浊度也相应增加。沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当光线通过反应体系时，由于抗原抗体复合物微粒子对光发生折射、反射及透射、使水平方向的光发生偏转而产生散射光。光线偏转的角度与发射光的波长和反应液中抗原抗体复合物的颗粒大小及多少密切相关。v 测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间段的散射信号值，当抗体量大于抗原量时，形成的免疫复合物为小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最强，形成的速率散射信号值也最大，仪器将测得的速率峰值转换为相应的ASO浓度。试剂及器材试剂及器材1.全自动速率散射比浊仪2.待检血清、仪器配套试剂3.试
24、管、水浴箱、移液器、微量加样器吸头等操作步骤操作步骤1.开机；相关参数设置；校准。2.处理标本，3500rpm离心l0min，分离血清。3.输入杯号；选择所测项目ASO；存盘；4.编程完毕后，将标本放入标本杯中，且放入标本盘中相应位置，将所做项目的试剂放入试剂盘中相位置，确认无误后，开始运行仪器。结果判断结果判断全自动化散射比浊法：全自动化散射比浊法：参考值范围参见不同试剂盒。参考值范围参见不同试剂盒。实验讨论实验讨论v乳胶凝集半定量实验及全自动免疫比浊法定量检乳胶凝集半定量实验及全自动免疫比浊法定量检测的特点？测的特点？v试应用所学知识分析影响乳胶凝集试验结果准确试应用所学知识分析影响乳胶凝
25、集试验结果准确性的因素及处理方法性的因素及处理方法?实验四实验四 梅毒螺旋体抗体检测梅毒螺旋体抗体检测实验目的实验目的1.掌握临床常用检测梅毒感染的方法及操作程序3.了解多种方法联合检测梅毒感染的临床意义2.熟悉两种方法的特点梅毒螺旋体感染的常用检测方法梅毒螺旋体感染的常用检测方法TRUST（检测非特异抗体）TPPA(检测特异性抗体）ELISA(检测特异性抗体）现症梅毒的主要指标同时是判断治疗效果、复发的指标特异性强，准确性高，但无法判断是否为现症梅毒敏感性高，有一定的假阳性率不同方法具有各自的特点梅毒感染检测（一）（一）TRUSTTRUST实验实验 实验原理实验原理v凝集法凝集法-检测非特异
26、性抗体检测非特异性抗体+抗心类脂抗原反应卡滴加血清产生凝集现象抗原中加入了甲苯胺红染料，因甲苯胺红颗粒均匀，结果易于观察实验试剂及器材实验试剂及器材1.实验试剂 甲苯胺红溶液重悬的类脂抗原、阳性对照血清、阴性对照血清，2.实验器材 滴管、反应纸卡操作步骤操作步骤一、甲苯胺红不加热血清试验（一、甲苯胺红不加热血清试验（TRUSTTRUST）1.试剂及待检血清室温下平衡10min 2.在样本圈内加入待检血清及阴性、阳性血清，每圈50l，尽量将血清铺匀涂满但不要超出卡圈 3.垂直向血清中心加入抗原1滴（50l）4.旋转摇动卡片8分钟后立即观察结果 加血清加抗原旋转摇动观察结果结果分析结果分析v 甲苯
27、胺红不加热血清试验（甲苯胺红不加热血清试验（TRUSTTRUST）v 阴性：呈现粉红色均匀分散的沉淀物阴性：呈现粉红色均匀分散的沉淀物v 阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小可以分为阳性：出现粉红色凝集块，根据凝集块大小可以分为4 4个阳个阳性级别（性级别（1+1+4+4+）阴性阴性阳性阳性弱阳性弱阳性实验注意事项实验注意事项稀释血清应准确及避免交叉污染及时观察实验结果抗体浓度过高可能发生前带现象而致假阴性,若TPPA或ELISA检测结果为阳性或弱阳性，需生理盐水稀释样本后重复实验。临床意义临床意义 1.TRUST实验为梅毒螺旋体感染的血清学过筛试验，阴性不可排除感染，阳性需用特异性抗体的检
28、测方法进行确认。2.TRUST实验对现症梅毒的诊断具有较高价值，通过连续监测抗体滴度能够动态反映病程，此法在一期、二期梅毒的阳性率较高，与ELISA或TPPA检测结果综合分析能够更准确的诊断疾病。（二）（二）TPPA法法-检测特异性抗体检测特异性抗体实验试剂及器材实验试剂及器材1.实验试剂 血清稀释液、致敏粒子、未致敏粒子以及其相应的溶解液，阳性对照血清2.实验器材 专用滴管、反应板、微量加样器、微量加样器吸头、移液管管号1234567稀释液(l)1 00252525252525待检血清(l)25252525252525未 致 敏 颗 粒(l)-25-致敏颗粒(l)-25252525最终稀释倍
29、数-1:401:801:1601:3201:6401 2 3 4 5未致敏颗粒致敏颗粒倍比稀释血清TPPATPPA法操作步骤法操作步骤结果分析结果分析 TPPA间接凝集实验：1）反应图像的判定 阴性（-）：粒子集中于孔底呈纽扣状，呈现外周边缘均匀平滑的圆圈 弱阳性（+）：粒子形成小环状，呈现外周边缘均匀平滑的圆圈 阳性（+）：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围。强阳性（+）：产生均匀的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。2）最终判定基准：未致敏粒子的反应图像应为阴性。致敏粒子（最终稀释度1:80及以上）反应图像为阳性，最终应判定为阳性。反应图像为阳性的最终稀释倍数作为抗体效价
30、。1:40 1:80未致敏颗粒阴性致敏颗粒 阳性阳性对照最终判断：阳性待检血清注意事项注意事项1.试剂及检测样品应充分混匀，及时更换加样吸头避免交叉污染。2.实验中不能随意移动反应板，否则容易造成假阳性。3.保证足够的反应时间、及时观察结果。4.阳性结果用另一种方法如ELISA法复查。临床意义临床意义 v 梅毒螺旋体感染后2周左右患者血清中即可出现特异性IgM抗体，4周左右即可检测出特异性IgG抗体，TPPA法为检测 特异性IgG抗体的较好方法之一，其阳性可以提示曾经或现 在感染梅毒，与TRUST法的检测结果综合分析对梅毒的诊断、分期及治疗效果评价具有重要价值。实验讨论实验讨论梅毒血清学的联合
31、应用对梅毒诊断有何意义？梅毒血清学的联合应用对梅毒诊断有何意义？实验讨论实验讨论v TRUST法检测非特异性抗体，是现症梅毒患者实验室诊断的重要指标，但初期或晚期梅毒病人抗体浓度较低可出现假阴性，抗体浓度过高时出现前带现象也可出现假阴性，而某些疾病如自身免疫性疾病则可出现假阳性。v TRUST检测的非特异性抗体在感染1-2周即可出现，如滴度1 4，又具有典型的临床表现，则现症梅毒的可能性较大。v 需注意TRUST检测结果阳性需谨慎对待，低滴度(1 4)除可能为生物学造成的假阳性外，还有可能是发病初期或使用抗生素延长了阳性血清出现的潜伏期。v TRUST滴度与病情活动呈正相关，并且可作为判定复发
32、或再感染指征,对于高滴度者(1 8)应考虑为现症梅毒病人，并结合临床症状给予适当治疗。实验讨论实验讨论v ELISA检测梅毒抗体具有较高的敏感性，并可用全自动酶标仪进行批量初筛，但特异性稍差，有一定的假阳性率，采用ELISA两步法可在一定程度上提高检测结果的敏感性和可靠性。v TPPA法特异性及敏感性均较高，可作为ELISA法及TRUST法筛查的确证实验。但该方法操作复杂费时。v ELISA和TPPA两种方法检测的梅毒抗体均为特异性抗体，该抗体即使经治疗后也可终生阳性，因此不能作为评价治疗效果，复发或再感染的指标。实验讨论实验讨论v综合应用特异性抗体和非特异性抗体两种方法检测及滴度分析不仅能够
33、提高梅毒感染检测的敏感性和特异性，同时能够进行疗效观察，对于早期发现，早期诊断，早期治疗梅毒患者以及有效控制梅毒流行具有重要意义。实验五实验五 人类巨细胞病毒抗体人类巨细胞病毒抗体IgM检测检测实验目的实验目的通过通过ELISA捕获捕获法检测法检测HCMV-IgM抗体的操作抗体的操作 掌握掌握ELISA捕获捕获法检测法检测HCMV-IgM的实验原理的实验原理及操作程序及操作程序熟悉方法的特点熟悉方法的特点及应用及应用实验原理实验原理v 用抗人IgM（u链）包被微孔板，与待检血清反应，使血清中所有IgM（特异性与非特异性IgM）均被捕获，经洗涤除去IgG，加入HCMV抗原，与固相上捕获的特异性I
34、gM结合，加入针对HCMV抗原的酶标抗体形成固相二抗-IgM-抗原酶标抗体复合物，在底物酶的作用下显色，根据吸光度判断是否存在HCMV特异性抗体IgM及抗体量。实验试剂及器材实验试剂及器材1.实验试剂 抗CVBIgM阳性对照、阴性对照、弱阳性对照、血清，抗人IgM（u链），稀释液，底物A、底物B，终止液。2.实验器材 包被有CVB抗原的微孔板、微量移液器、微量加样器吸头、试管、恒温水浴箱 操作步骤操作步骤1.稀释待测样本2.温育3.洗涤4.加抗原5.洗涤同步骤36.加酶结合物7.洗涤同步骤38.加酶底物/色原溶液9.加终止液10.酶标仪测定吸光度值结果判断结果判断v采用反应底物的最大吸收波长即
35、（450nm）处测定各孔吸光度值。以样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）1.0时判定为阳性。注意事项注意事项1.实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性、和空白对照。2.洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗过猛过急导致假阴性。3.严格控制反应时间和显色时间。实验讨论实验讨论v 捕获法是以抗人IgM 抗体(抗人链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM 类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，而IgG则被洗去，再加入特异抗原可与固相上捕获的特异性IgM 抗体结合，而不与非特异性IgM结合，这样非特异性IgM及IgG均被除去，排除了非特异性IgM等干扰因素。实验讨论实
36、验讨论v 间接法易受RF因子及非特异性IgM 的影响。间接法测定时，血清中特异的IgG 与包被的特异性抗原结合，而后与RF反应造成假阳性。同时，特异性的IgG能与IgM 竞争结合特异性抗原而造成假阴性。v 捕获法利用抗人IgM链直接从被检血清中捕获IgM,再进行特异性结合，避免了RF等干扰物质的影响，具有更强的特异性。实验讨论实验讨论 请结合所学知识，分析酶联免疫技术请结合所学知识，分析酶联免疫技术中其他方法的优点及缺陷。中其他方法的优点及缺陷。v 患者，男，49岁主诉“右上腹隐痛、腹胀隐痛8年，反复牙龈出血2年”v 体格检查：巩膜黄染，腹壁静脉曲张，肝脏于肋下4横指可触及，质硬，压痛，腹水征
37、阳性。CT示：肝左叶大，肝裂增宽。v 实验室检查：HGB:115g/L，WBC：5.4X109/L，NEU:41.6%，LYM:57.3%,PLT：96 X109/L血清抗HCV抗体：阳性，HCV-RNA：9.26X104copies/ml,其余肝炎病毒血清标志物检查均为阴性，肝功能：ALB:29.6g/L，GLB:37.4g/L A/G:0.8，PA:54mg/L，ALT:146 U/L，AST:249U/L，ALP:213U/L，r-GGT:169U/L，CHE:1858U/L，TBA:130.4umol/L，T-Bil:46.1 mmol/L,D-Bil：26.8 mmol/L，LDH:
38、,337 U/L,a-HBD:234U/L。v 问题：请结合以上资料，分析该患者可能的诊断及实验室诊断依据？v 患者右上腹隐痛不适、腹胀患者右上腹隐痛不适、腹胀8年，肝脾肿大，腹壁静脉曲年，肝脾肿大，腹壁静脉曲张，腹水征阳性，提示存在门脉高压，伴腹水，肝脏血清张，腹水征阳性，提示存在门脉高压，伴腹水，肝脏血清酶增高明显，胆红素升高；应考虑肝硬化或肝癌。酶增高明显，胆红素升高；应考虑肝硬化或肝癌。v 近两年反复出现牙龈出血，考虑因肝脏合成凝血因子减少近两年反复出现牙龈出血，考虑因肝脏合成凝血因子减少以及脾功能亢进致血小板减少导致凝血功能障碍所致。提以及脾功能亢进致血小板减少导致凝血功能障碍所致。
39、提示肝脏功能已经失代偿，出现肝功能严重受损的各种症状示肝脏功能已经失代偿，出现肝功能严重受损的各种症状。v 丙型肝炎病毒抗体阳性，丙型肝炎病毒抗体阳性，HCV-RNA拷贝数高，提示病因拷贝数高，提示病因为丙型肝炎病毒感染，肝脾增大，影像学检查无肝内占位为丙型肝炎病毒感染，肝脾增大，影像学检查无肝内占位性病变，可排除肝癌。性病变，可排除肝癌。v诊断：丙型肝炎后肝硬化肝功能失代偿期。诊断：丙型肝炎后肝硬化肝功能失代偿期。答案提示答案提示v 患者，女性，患者，女性，25岁，主诉岁，主诉“会阴部皮疹会阴部皮疹3月余，全身皮疹伴月余，全身皮疹伴腹股沟淋巴结肿大半月余腹股沟淋巴结肿大半月余”v 体格检查：
40、肛门周围及外阴部大小阴唇间有隆起的丘疹，体格检查：肛门周围及外阴部大小阴唇间有隆起的丘疹，部分融合，表面平坦，表面湿烂，有少许渗出液。双侧下部分融合，表面平坦，表面湿烂，有少许渗出液。双侧下颌、颈前、腹股沟处可扪及多个拇指大小肿大淋巴结，轻颌、颈前、腹股沟处可扪及多个拇指大小肿大淋巴结，轻压痛。压痛。v 实验室检查：血清实验室检查：血清TRUST阳性，阳性，TPPA阳性，滴度为阳性，滴度为1:640，宫颈分泌物查衣原体抗体阴性，脑脊液，宫颈分泌物查衣原体抗体阴性，脑脊液TPPA阴性。阴性。v 问题：问题：请结合以上资料，分析该患者可能的诊断及实验室诊请结合以上资料，分析该患者可能的诊断及实验室
41、诊断依据？断依据？v 根据主诉和体格检查，患者有逐渐加重的皮疹及浅表淋巴根据主诉和体格检查，患者有逐渐加重的皮疹及浅表淋巴结肿大；查体有皮疹及渗出，全身多个浅表淋巴结肿大；结肿大；查体有皮疹及渗出，全身多个浅表淋巴结肿大；提示存在梅毒感染的症状和体征。提示存在梅毒感染的症状和体征。v 血清梅毒抗体特异性和非特异性抗体均为阳性。血清梅毒抗体特异性和非特异性抗体均为阳性。提示该提示该患者为梅毒螺旋体感染。患者为梅毒螺旋体感染。v 根据梅毒分期：一期梅毒典型表现为硬下疳；晚期梅毒脑根据梅毒分期：一期梅毒典型表现为硬下疳；晚期梅毒脑脊液梅毒抗体一般呈阳性，该患者脑脊液脊液梅毒抗体一般呈阳性，该患者脑脊
42、液TPPA检测结果检测结果阴性。阴性。v 诊断：诊断：二期梅毒二期梅毒答案提示答案提示v 患儿，男，患儿，男，62天，父母诉天，父母诉3天前体检肝功能异常。天前体检肝功能异常。v 体检体检:前囟软，全身皮肤及巩膜无明显黄染，肝脾无肿大。前囟软，全身皮肤及巩膜无明显黄染，肝脾无肿大。v 实验室检查实验室检查:WBC：3.76X109/L,NEU:24.2%,LYM:69.9%，Hb:102g/L;ALT:64U/L，AST:97U/L，ALP:432U/L，r-GGT:118U/L,CHE:8670U/L，LDH:280U/L,a-HBD:189U/L，T-Bil:27.3 mmol/L,D-B
43、il：20.8 mmol/L。乙肝两对半检。乙肝两对半检测结果均为阴性，甲肝抗体阴性，丙肝抗体阴性，巨细胞病测结果均为阴性，甲肝抗体阴性，丙肝抗体阴性，巨细胞病毒毒IgM:阳性。阳性。v 问题：问题：请结合以上病史资料，分析该患者可能的诊断及实验室请结合以上病史资料，分析该患者可能的诊断及实验室诊断依据？诊断依据？v 根据患儿病史，实验室检查肝脏血清酶及胆红素升高，应根据患儿病史，实验室检查肝脏血清酶及胆红素升高，应考虑与肝脏损伤有关的疾病。考虑与肝脏损伤有关的疾病。v 在婴儿期以病毒感染多见，该患儿甲肝、丙肝抗体阴性，在婴儿期以病毒感染多见，该患儿甲肝、丙肝抗体阴性，乙肝两对半阴性，风疹抗体
44、阴性，可排除前述感染。乙肝两对半阴性，风疹抗体阴性，可排除前述感染。v 巨细胞病毒抗体巨细胞病毒抗体IgM阳性，因此多考虑巨细胞病毒感染。阳性，因此多考虑巨细胞病毒感染。巨细胞病毒在婴儿期感染可导致黄疸消退延迟，肝功能异巨细胞病毒在婴儿期感染可导致黄疸消退延迟，肝功能异常，白细胞升高或降低等症状，与患儿表现一致。常，白细胞升高或降低等症状，与患儿表现一致。v 诊断：诊断：婴儿肝炎综合征（巨细胞病毒感染婴儿肝炎综合征（巨细胞病毒感染 ）答案提示答案提示v 患者，男，患者，男，13岁，主诉岁，主诉“右下肢疼痛半年余右下肢疼痛半年余”，夜间及寒，夜间及寒冷潮湿天气明显，之前曾有感冒病史，无关节肿胀。
45、冷潮湿天气明显，之前曾有感冒病史，无关节肿胀。v 体格检查：右下肢膝关节及肌肉轻压痛，无明显红肿及活体格检查：右下肢膝关节及肌肉轻压痛，无明显红肿及活动受限。动受限。v 实验室检查：血常规：实验室检查：血常规：WBC：4.7X109/L,L:51%，N:40%,血沉：血沉：1h:24mm,2h:36mm，ASO：288IU/ml，CRP：1.74mg/L。自身抗体。自身抗体ANA、抗双链、抗双链DNA、ENA抗抗体谱均为阴性，关节体谱均为阴性，关节X片：右侧膝关节软组织影像模糊，片：右侧膝关节软组织影像模糊，炎性改变。炎性改变。v 问题：问题：请结合以上资料分析该患者可能的诊断及实验室诊请结合以上资料分析该患者可能的诊断及实验室诊断依据？断依据？v患者关节疼痛半年，之前曾有感冒史。血沉加快，抗链球菌溶血素：“O”明显增高，支持风湿性关节炎的诊断。v患者症状局限，仅表现为单个大关节的疼痛及软组织炎性改变，不累计小关节，自身抗体谱均为阴性，可初步排除类风湿性关节炎。v诊断：诊断：风湿性关节炎风湿性关节炎。答案提示答案提示昆明医学院昆明医学院 杨红英杨红英
