1、图31 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 虚线处为点样位置图3一2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白；2，3，4，5分别为1-，2-，-及-球蛋白；6为点样原点 此法由于操作简单快速、分辨率高及重复性好等优点，目前已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。实验六实验六 蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定FolinFolin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）和考马斯亮蓝法法）和考马斯亮蓝法（BrodfordBrodford法）法）一一 FolinFolin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）
2、目的和要求目的和要求学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。进一步掌握分光光度法求标准曲线、准确测定未知样品、正确使用仪器 原理原理蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操纵简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般的浓度测定较为适应。Folin-酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Folin-酚法。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中
3、的肽键起显色反应。试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。实验步骤实验步骤1.标准曲线的制作：按下表操作管 号BSA（300gmL）H2OPr.含量g步 骤12345600.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20050100150200250各试管加入试剂甲5.0mL，混合后放置10分钟，加入试剂乙0.5mL，立即混合，37度恒温反应20分钟。以1号为参比，测A750的值。2.样品（小白菜）液的提取称取小白菜1-
4、4克（菜杆2-4克，菜叶1-2克）置于研钵中，加5mL蒸馏水在低温下研磨成匀浆，全部转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度，然后抽滤，在3000rpm离心20分钟，上层清液为提取液，待用。1.样品的测定吸取提取液和稀释250倍的血清液各1.0mL于试管中（三次重复），分别加5.0mL试剂甲，放置10分钟后，加试剂乙0.5mL，立即混匀，恒温37度反应20分钟，测A750的值。管 号小 白 菜T 或 A管 号血 清T 或 A123123小白菜用mgg，血清用mgmL。实验七实验七 去污剂对红血球细胞膜稳定性的影响去污剂对红血球细胞膜稳定性的影响目的和要求目的和要求了解各种去污剂对红血球细胞膜稳定性
5、的影响学会制备红血球细胞原理原理多种去污剂可以溶解细胞膜上的磷脂化合物，从而使细胞膜破裂，释放出细胞内物质。血红蛋白在540nm有特异吸收峰。去污剂作用后的无细胞膜溶液于540nm处的A值大小可以表示其红血球细胞对不同去污剂的敏感性。步骤步骤 红血球等渗溶液的制备 取已加抗凝剂的猪血2.5mL，加生理盐水10.0mL，离心20方针（2000rpm），收集沉下的红血球，用生理盐水洗涤一次（5mL），再离心20分钟（2500rpm），收集沉淀，加10mL生理盐水，悬浮红血球，即为红血球等渗溶液，备用。取4支试管各加0.2mL红血球等渗溶液，分别对应加入10.0g/L的Triton X-100，Br
6、ij58，CTAB，SDS 5mL，小心混匀，2500rpm离心20分钟，收集上清液，测540nm的A值（以相同操作，不含红血球的去污剂作参比）。以Triton X-100的A值作为100%的溶解作用，计算其它去污剂的相对溶解作用。1.不同浓度的中性去污剂对细胞膜的溶解作用取6支试管，各加生理盐水5mL，红血球等渗液1.0mL，向各管对应加入10.0g/L、8.0g/L、6.0g/L、4.0g/L、2.0g/L、1.0g/L的Triton X-100 50Ul，小心混匀，置于37度恒温水浴中20分钟，2500rpm离心20分钟，取上清液于540nm处测吸收值，计算相对溶解作用（参比液：5.0m
7、L生理盐水+50uL不同浓度的Triton X-100）。以Triton X-100的不同浓度为X轴，相对溶解作用为Y轴，作图。实验八实验八 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白目的和要求目的和要求掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，包括制胶、灌胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，利用盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质和血清球蛋白-血清清蛋白-铁氧还原蛋白的混合液 原理盘状聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量的交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。改变
8、单体的浓度或单体与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，将次凝胶灌装于直立的玻璃管中，再加样品，进行电泳分离，称为盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳。一般常采用7.5%的盘状聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，2.4%的分离核酸。盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳又常分为两大类，第一类是连续的凝胶电泳，第二类是不连续的凝胶电泳不连续的凝胶电泳亦可称为盘状电泳。在这种电泳过程中，除去一般的电荷效应外，还有两种物理效应：（1）凝胶对样品分子的筛选效应：颗粒小，形状为圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大形状不规则的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力较大，移动较慢。（2）不连续系统对样品的浓缩效应：高度的浓缩效应，大大提高电泳分离的分辨
9、率，特别适用于稀浓度的样品的分离。关于不连续系统的浓缩效应，可由两方面进行分析（以碱性pH缓冲液体系为例）第一，两层凝胶孔径不同。第二，缓冲液与凝胶的离子成分和pH不同。本实验采用不连续系统，碱性缓冲体系，分离血清蛋白质。由于具有电荷效应、分子筛效应、浓缩效应，所以分离效果好，分辨率高。实验中聚合凝胶时表面覆盖一层水，是为了防止空气中的氧气进入混合液，使聚合作用受抑制，并保证胶面的平整。步步 骤骤1 分离胶的制备：TEMED（pH8.9）2mL；分离胶原液 4mL；A.P（0.14%）10mL（加样顺序不可颠倒）。2 浓缩胶的制备：TEMED（pH6.7）1mL；浓缩胶原液 2mL；核黄素（0
10、.1mgml），1ml。3 上槽（略）4 加样：BSA、胃蛋白酶各10-20L，混合样品30-40L，猪血清5-10L，加1/2体积的蔗糖。电泳：2mA/管，10-20分钟后，于3mA/管电泳至溴酚蓝指示剂离胶下端0.5cm时，停止电泳。剥胶，染色。脱色绘图，计算Rf值。实验九实验九 动物组织核糖核酸的制备及测定动物组织核糖核酸的制备及测定目的和要求目的和要求1 学习和掌握用苯酚法及盐溶液法从动物组织提取核酸的原理及操作技术。2 练习从动物组织提取RNA，并鉴定纯度。实验原理实验原理利用苯酚法可以直接从动物组织中提取RNA，组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水层中，DNA和
11、蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后RNA即呈白色絮状沉淀析出。实验十实验十 脲酶脲酶KmKm值的简易测定值的简易测定目的和要求目的和要求掌握测定米氏常数的原理和方法，学习并掌握一般的数据处理方法实验十一实验十一 粗脂肪提取粗脂肪提取索氏（索氏（SoxhletSoxhlet）提取法）提取法目的和要求目的和要求学习和掌握粗脂肪提取的原理和测定方法。熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括样品的处理、定量转移、烘干、恒重等。实验十二实验十二 ATPATP的生物合成的生物合成综合性实验之一 2006-5-13一、目的一、目的1.了解ATP生物合成的意义。2.掌握无机磷的测定方法。3.掌握DEAE-纤维素薄
12、板层析法测ATP的形成。二、原理二、原理在适当条件下，酿酒酵母分解发酵液中的葡萄糖，释出能量，同时还利用无机磷，使AMP转变成ATP，一部分能量即贮存于ATP分子中。因此，在发酵过程中，可测得发酵液中的无机磷含量降低和ATP含量的上升。实验十三实验十三 动物肝脏动物肝脏RNARNA的制备的制备(苯酚法苯酚法)和纯度测定和纯度测定原理原理细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此分离RNA时必须使RNA与蛋白质解离，并除去蛋白质。除去蛋白质的方法主要有：（1）用氯仿辛醇混合液剧烈振荡，使蛋白质变性。（2）在冷的2mol/L盐酸胍溶液中沉淀RNA，大部分蛋白质仍处于溶解状态
13、。（3）以去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）处理，使核蛋白解离，蛋白质变性。（4）以含水的酚溶液除去蛋白质。去污剂和酚均能抑制RNA酶活力，有利于制备核酸大分子。目前应用最广的是苯酚法。以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中，加等体积水饱和的酚，通过剧烈振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被酚变性的蛋白质或溶于酚相、或在两相界面处形成凝胶层。实验所用的0.15mol/L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离，在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性；在低温条件下，从水相中除去，这样得到的RNA制品中混杂的DNA量极低。RNA制品继续用氯仿异戊醇处理，可以进一步
14、除去其中含有的少量蛋白质。最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来。实验所得制品的核酸含量可用紫外吸收法和定磷法测定，然后用地衣酚显色法测定RNA含量，二苯胺显色法测定DNA含量，Folin酚试剂法测定蛋白质含量。实验十四实验十四 胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响血糖是指血液中糖，由于正常人血液中糖主要是葡萄糖，所以一般认为，血糖是指血液中的葡萄糖。正常人空腹血糖浓度为4.46.7mmol/L（80120mg/100ml）。血糖是糖在体内的运输形式。全身各组织都从血液中摄取葡萄糖以氧化供能，特别是脑、肾、红细胞、视网膜等组织合成糖原能力极低，几乎没有糖原贮存，必须不断由血液供应葡萄糖。当血糖下降到一定程度时，就会严重妨碍脑等组织的能量代射，从而影响它们的功能。所以维持血糖浓度的相对恒定有着重要的临床意义。
