1、实验实验 蚕豆根尖细胞微核检测技术蚕豆根尖细胞微核检测技术一一 原理原理二二 目的目的 学习蚕豆根尖细胞微核制片与检测技术，了解该技术在诱变作用检测上的应用。微核(Micronucleus,MCN)，也叫卫星核，是真核生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。微核是各种理化因子，如辐射，化学药剂对分裂细胞作用产生的。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。其折光率及细胞化学反应性质与主核一样，也具有合成DNA的能力。一般认为微核是有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成
2、了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。微核率的多少与和作用因子的剂量或辐射累积效应有正相关。微核测试用于辐射损伤、辐射保护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断。三三 材料材料 蚕豆根尖（新鲜的固定材料）四四 步骤步骤 1 蚕豆浸种催芽 2 待测液对根尖的处理 3 根尖细胞的恢复培养 4 根尖的固定5 根尖的酸水解：将固定的幼根放入青霉素瓶中，用dH 2 O 浸洗2次，除去水后加入5N HCL 将幼根泡住，放入30OC水浴中水解28 min 左右（水解时间与水温有反相关关系），待幼根软化（同时变为半透明
3、）即可取出，用dH 2 O 浸洗幼根2次，5min/次。6 制片：将幼根放在擦净的载片上，用解剖针截下4mm左右的根尖部分，捣碎，加入1-2滴改良苯酚品红染色液，染色10分钟左右，然后加盖片，压片。7 镜检：先在低倍镜下找出具微核的细胞，再转入高倍镜进行仔细观察。五五 作业作业 绘出一个具微核的蚕豆根尖细胞图。附微核识别标准附微核识别标准：1、凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核；2、小核着色与主核相当或稍浅；3、小核形态可为圆形，椭圆形，不规则形等。凡符合以上3条的小核就是微核（micronucleus,MN)微核形成机制：微核形成机制：附：实验数据的处理和污染程度的划分将微核观察记
4、录于表上片号镜检日期镜检者各次观察的细胞数与微核数微核数/细胞数总计微核千分率（MN%o)平均值1）各测试样品（包括对照组）微核千分率（MN)的计算为：MN=某测试样点（或对照）观察到的微核数/某测试样点（或对照）观察的细胞数）MN 在10以下的为基本污染10-18 区间为轻度污染18 -30 区间为中度污染30 以上为严重污染注：每个处理观察3个根尖，每个根尖记数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数然后平均，即为该处理的微核千分率。2）污染指数（pollution index)污染指数（PI)=样品实测MN 平均值/标准水MN 平均值PI在 0-1.5 区间为基本无污染 1.5-2.0区间
5、为轻度污染 2.0-3.5区间为中度污染 3.5以上为严重污染注：1）对严重污染的水环境，监查处理时造成根尖死亡，应稀释后再做测试；2）如RT 35，MN本底会增高，但可经污染指数数据处理，不会影响监测结果。In an individual heterozygous for a paracentric inversion,the chromosomes form an inversion loop during pairing in prophase I.后期后期染色体桥染色体桥后期后期染色体桥和染色体断片染色体桥和染色体断片二分体时期微核二分体时期微核倒位的细胞学特征：倒位的细胞学特征：粗线
6、期倒位圈；后期桥和断片；微核粗线期倒位圈；后期桥和断片；微核倒位的遗传效应：倒位的遗传效应：改变重组率；基因重排改变重组率；基因重排 微核试验自70 年代初产生以来的近30 年的时间里,在环境物质遗传毒理检测方面发挥了重要的作用。它以经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点,已成为检测染色体损害的致突变剂和环境污染物的快速初筛试验,已广泛用于筛检具有染色体损伤作用的致突变剂(Mutagens)和环境污染物(Environmental Pollutants)。微核(micronucleus,MN)是指位于生物细胞的细胞质中独立于主核,直径小于主核1/201/3,完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小
7、核。它可以是整条染色体,也可以是染色体断片,染色性与主核一致,其中部分微核具有DNA 复制能力。微核是由于外界损害因素使染色体发生断裂,细胞进入下一次分裂时,染色体不能随有丝分裂进入子细胞,而导致染色体丢失或断裂,从而形成一个或数个小核.微核试验的产生与发展微核试验的产生与发展 微核试验创建于20 世纪70 年代初,首先由Heddle 和Schmid 利用啮齿类骨髓细胞建立了微核测定方法。1970 年Schmid 及Heddle 用中国金黄地鼠观察了抗肿瘤药三亚胺醌,观察骨髓与外周血细胞学的变化。并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中MN 发生率来作为微核试验的基本指标,并正式命名为MNT。
8、此后至70 年代中期,该研究小组的工作,全面奠定了MNT 的理论及应用基础。经Heddle 等人30 多年的发展,许多国家和国际组织已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品、环境化学物质等毒理安全性评价必做的实验。随着分子生物学技术的迅速发展和不断渗透到微核研究中,使微核试验的检测应用范围不断扩大,现已发展成为能同时检测染色体断裂、染色体丢失、分裂延迟、不分离、DNA 损伤修复障碍、Hprt 基因突变、细胞凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传损害终点。自20 世纪70 年代Heddle 和Schmid 利用啮齿类骨髓细胞建立了微核试验检测方法以来,各国都在不断研究探索微核试验技术。主要从三个方面来
9、进行:一是探索微核试验的实验技术,即研究材料、实验方法、给药方式、染毒途径、制片方法、染色方法等;二是利用微核试验来检测各种致突变物质;三是通过微核试验来预测疾病。微核形成机理化学毒性物质化学毒性物质染色体断裂剂可诱发染色体发生断裂的遗传毒性物质。细胞核的主要成分是染色体,在正常的情况下细胞分裂时染色体被纺锤丝牵引平均分向细胞的二极,形成二个正常的核,被平均分配给二个细胞。在染色体断裂剂如丝裂霉素存在下,染色体发生断裂,并不发生重接或不在原处重接,则形成了无着丝粒的段片,在细胞分裂后期不能向两极移动,而残留在细胞中央的赤道板附近,当子细胞形成时则游离于细胞质中形成不含着丝粒的微核。非整倍体剂可
10、以使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损。在细胞分裂时,染色体不发生分离而产生非整倍体子细胞,同时在赤道板中央残留一条或多条染色体,它们在子细胞形成时不能被包在子核中,而游离于细胞质中形成含着丝粒的微核。一般的遗传毒性物质兼有染色体断裂剂和非整倍体剂两方面的作用。核体出芽核体出芽间期的细胞核向外形成瘤状突起,形成芽体最后脱离开主核而形成微核。放射线放射线放射线可以引起DNA 损伤,产生错误修复的双链断裂,导致微核出现。自发在正常情况下生物也会自然出现较低频率的微核,在人类一般随年龄增大而增加,往往女性高于男性。主要由于自身的免疫力低下和超氧化物、自由基、易氧化物等因素较多有关。化学诱变剂
11、即染色体断裂剂和非整倍体剂。细胞组成成份VB12、叶酸缺乏可引起微核。抗氧化剂谷胱甘肽、VC、VE、硒等具有降低微核产生的能力,主要是可以清除体内的超氧化物等物质有关。其他因素微核也是细胞凋亡的产物,当程序性死亡基因激活,随之Ca+依赖性内切酶激活,切割DNA,形成细胞核碎片,形态学表现为核深染,染色质边缘分布的帽形核,最后导致微核形成。影响微核产生的因素影响微核产生的因素常规微核试验常规微核试验是利用细胞生物学方法经显微制片后在显微镜下直接计数待测材料微核率的方法。这是普遍采用的基本方法,可以分为两类:1)将微核试验材料,在加入待测物质的环境中培养一段时间,染色制片,显微观察计算微核率。2)
12、直接将受遗传毒理损害生物的相应材料制片,显微观察计算微核率。细胞分裂阻滞微核分析法细胞分裂阻滞微核分析法1985 年Fenech 等人建立的方法,用胞质分裂阻滞剂阻断胞质分裂,但不影响细胞核分裂,有丝分裂细胞呈特殊形态的双核细胞,未发生核分裂的细胞则维持单核细胞形态。检测致突变因素作用后的双核细胞率和双核细胞微核率,可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和对细胞周期影响的信息。微核试验技术的种类微核试验技术的种类荧光原位杂交试验与荧光原位杂交试验与DNA 探针探针荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是近年来开展起来的分子生物学新技
13、术。它是使用生物荧光素标记的各类DNA和RNA 探针与细胞或组织在玻片上进行原位杂交,被观察的特定DNA 片段(或序列)在荧光显微镜下固定在细胞核或染色体的原有部位显示荧光。利用荧光原位杂交试验可以检测是染色体断裂还是染色体丢失,以及可以判断是哪一条染色体,那一段所产生的微核。目前已成功用于MN 实验的DNA 探针主要有两类:第一类:是含DNA 重复序列的探针,主要用于检测染色体着丝粒的DNA。第二类:是含染色体端粒DNA 序列的探针,它主要显示染色体臂的存在。抗着丝粒抗体染色抗着丝粒抗体染色(CREST 染色染色)抗着丝粒抗体(Anti-kinetochore antibodies)是美国学
14、者Moroi 及其同事于1980年在硬皮病病人血清中发现的一种自动抗体,这些自动抗体可以通过免疫荧光技术检测到。他们与染色体着丝粒蛋白(抗原)成份相结合。具有较强的特异性。但并不所有硬皮病病人的血清中都含有该自动抗体,含该抗体的病人皮肤损害往往并不严重和广泛。但却有显著的CREST 征。所以将用该种病人的血清对染色体着丝粒的染色直接称为CREST 染色(CREST staining)。CREST 染色用来区分MN来源(染色体段片还是整条染色体),了解诱导MN 的化合物性质(断裂剂还是整倍体剂)。自动化检测法自动化检测法流式细胞仪检测方法流式细胞仪检测方法流式细胞仪(Flow cytometry
15、)检测方法是20 世纪70 年代发展起来的定量测定细胞和亚细胞成份的方法。流式细胞仪是利用激光束为光源,将待测样品进行荧光染色,然后在液体载体里以单个细胞通过激光束,产生荧光信号并转变为电信号通过仪表显示来达到定量测定的目的。流式细胞仪检测MN 有很多优点:1)检测速度至少比人工读片快40100 倍。2)减少了人为的主观因素。3)新型流式细胞仪具有分选功能,对判定为含MN 的细胞,可以分类检出并收集在玻片上或试管里,在显微镜下检查验证,以证实其真实性并计算其可置信度。计算机图像分析系统检测计算机图像分析系统检测计算机图像分析系统是将高分辨力摄像机和计算机结合起来将图像分解为若干点,再将每个点的
16、图像色差转换为数字信号,储存在计算机里进行各定量参数的计算。从80 年代中期开始利用计算机图像分析技术,其检测速度也至少比人工计算快10 倍以上,但容易受条件因素影响,还需进一步完善。微核试验的应用微核试验的应用 微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测,为接触有害物质人群提供遗传损害检测和工作环境监测,为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。环境物质监测和致突变物检测环境物质监测和致突变物检测 化疗后的细胞学损伤观察化疗后的细胞学损伤观察 放疗的遗传学损伤分析放疗的遗传学损伤分析 特定人群的突变损伤检测和早期预报特定人群的突变损伤检测和早期预报 利用微核试验筛选抗癌物质利用微核试验筛选抗癌物质 利用微核试验指示环境污染的程度利用微核试验指示环境污染的程度 总之,用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法,在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用.
