1、复习 一、果酒制作一、果酒制作 1 1、酵母菌：、酵母菌： 4 4、流程：、流程：选果选果冲洗冲洗榨汁榨汁发酵发酵酒精酒精 2 2、原理：、原理： 5 5、检验：酸性条件酒精遇重铬酸钾呈、检验：酸性条件酒精遇重铬酸钾呈灰绿色灰绿色 真菌、异养兼性厌氧型、繁殖最适温度真菌、异养兼性厌氧型、繁殖最适温度2020 C6H12O6+6O2+6H2O 6CO2+12H2O+能量能量 酶酶 C6H12O6 2C2H5OH+2 CO2+能量能量 酶酶 （1 1）前期繁殖需）前期繁殖需O O2 2 （2 2）后期酒精发酵不需）后期酒精发酵不需O O2 2 3 3、发酵条件：、发酵条件： 18182525 二、
2、果醋制作二、果醋制作 1 1、醋酸菌：、醋酸菌： 2 2、原理：、原理： （1）氧气、糖源都）氧气、糖源都 ：醋酸菌将葡萄汁中的：醋酸菌将葡萄汁中的 分分 解成解成 。 （糖制醋）（糖制醋） （2）氧气充足、糖源不足：醋酸菌将）氧气充足、糖源不足：醋酸菌将 乙醛乙醛 。 （酒变醋）（酒变醋） 果酒制作果醋的反应式为果酒制作果醋的反应式为: 。 充足充足 糖糖 醋酸醋酸 乙醇乙醇 醋酸醋酸 C C2 2HH5 5OH + OOH + O2 2 CHCH3 3COOH + HCOOH + H2 2OO 3 3、条件：、条件： 最适温度为最适温度为3035，需要充足的，需要充足的氧气氧气。 4 4、
3、流程：、流程：选果榨汁选果榨汁酒精发酵酒精发酵醋酸发酵醋酸发酵 原核、异养需氧型原核、异养需氧型 思考讨论：思考讨论： （1）装置中充气口、排气口和出料口分）装置中充气口、排气口和出料口分 别有哪些作用？别有哪些作用？ （2）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？）为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？ （3）为什么发酵瓶中只装入）为什么发酵瓶中只装入2/3的液体？的液体？ 其目的是其目的是先让酵母菌有氧呼吸快速繁殖先让酵母菌有氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进，耗尽氧气后再进 行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生的行酒精发酵；其次，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵造成发酵
4、液的溢出。液的溢出。 充气口：充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气在醋酸发酵时连接充气泵进行充气 排气口：排气口：排出发酵时产生的排出发酵时产生的CO2，以免发酵，以免发酵 瓶爆裂。瓶爆裂。 出料口：出料口：用来取样。用来取样。 排气管长而弯，可排气管长而弯，可防止空气中微生物的污染。防止空气中微生物的污染。 讨论：你认为应该先冲洗葡萄还是先除 去枝梗？为什么？ 应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避 免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂 菌污染的机会 1 1、为什么在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？为什么在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？ “通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。“通
5、气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。 “密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。“密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。 2 2、酒精发酵过程中发生“先来水后来酒”现象，其酒精发酵过程中发生“先来水后来酒”现象，其 原因是什么？原因是什么？ 酵母菌首先进行有氧呼吸产生了水，然后进酵母菌首先进行有氧呼吸产生了水，然后进 行无氧呼吸才产生酒精。行无氧呼吸才产生酒精。 例：有酿制葡萄酒的两个简易装置，请分析回答例：有酿制葡萄酒的两个简易装置，请分析回答 （1）果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌在有氧无氧）果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌在有氧无氧 条件下都能生存，所以，它属于条件下都能生存
6、，所以，它属于_微生物。微生物。 （2）在葡萄酒的自然发酵过程中，酵母菌的来源）在葡萄酒的自然发酵过程中，酵母菌的来源 是是 。 （3）制作果酒，需将温度严格控制在）制作果酒，需将温度严格控制在_。制。制 作果酒后制果醋，应将温度控制在作果酒后制果醋，应将温度控制在_。 （4）葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约）葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约1/3的空的空 间，这是因为间，这是因为_。 既为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气，又防止发酵旺盛时汁液溢出既为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气，又防止发酵旺盛时汁液溢出 兼性厌氧型兼性厌氧型 葡萄皮上的野生型酵母菌葡萄皮上的野生型酵母菌 1825 3035 （5）甲
7、装置中，）甲装置中，A液体是液体是 _，NaHCO3溶液的作用溶液的作用 是是 ； 葡萄汁葡萄汁 若用乙装置，在发酵过程中，必须进行的操作若用乙装置，在发酵过程中，必须进行的操作 是是 。与乙装置相。与乙装置相 比，甲装置的优点是比，甲装置的优点是 。 （6）果汁发酵后是否有酒精产生，可用）果汁发酵后是否有酒精产生，可用 来检来检 验。在酸性条件下，该试剂与酒精反应呈现验。在酸性条件下，该试剂与酒精反应呈现 。 在果酒酿造过程中，如果果汁灭菌不严格，含有醋在果酒酿造过程中，如果果汁灭菌不严格，含有醋 酸杆菌酸杆菌 ，在酒精发酵旺盛时，醋酸杆菌能否将果汁，在酒精发酵旺盛时，醋酸杆菌能否将果汁 中
8、的糖发酵为醋酸中的糖发酵为醋酸? ? 。 灰绿色灰绿色 不能不能 吸收酵母菌酒精发酵产生的吸收酵母菌酒精发酵产生的CO2 每隔每隔12小时左右（一定的时间）将瓶盖拧松一次小时左右（一定的时间）将瓶盖拧松一次 既能及时吸收（发酵产生的）既能及时吸收（发酵产生的）CO2，又能减少被杂菌污染的机会，又能减少被杂菌污染的机会 重铬酸钾重铬酸钾 1（2010 广东理综，广东理综，25）小李）小李 尝试制作果酒，他将葡萄汁放入已尝试制作果酒，他将葡萄汁放入已 灭菌的发酵装置中进行试验（见灭菌的发酵装置中进行试验（见 图），恰当的做法是（双选）图），恰当的做法是（双选） （ ） 高考真题高考真题 A加入适量
9、的酵母菌加入适量的酵母菌 B一直打开阀一直打开阀b通气通气 C一直关紧阀一直关紧阀a，偶尔打开阀，偶尔打开阀b几秒钟几秒钟 D把发酵装置放到把发酵装置放到4冰箱中进行实验冰箱中进行实验 AC 三、泡菜制作三、泡菜制作 1 1、乳酸菌：、乳酸菌： 3 3、流程：、流程： 2 2、原理：、原理： 原核、异养厌氧型原核、异养厌氧型 C C6 6H H12 12O O6 62C 2C3 3H H6 6O O3 3+ +少量能量少量能量 酶酶 用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？ 水封闭坛口水封闭坛口隔绝空气，保证无氧环境隔绝空气，保证无氧环境。这样，。这
10、样， 坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发 酵。如不封闭，则会有许多酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会需氧菌生长，蔬菜会 腐烂腐烂。 4 4、亚硝酸盐及其含量测定：、亚硝酸盐及其含量测定： （1）测定亚硝酸盐含量的方法：）测定亚硝酸盐含量的方法： 比色法比色法 （2）测定亚硝酸盐含量的原理：）测定亚硝酸盐含量的原理： 在在盐酸酸化条件下盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸 发生重氮化反应后，再与发生重氮化反应后，再与N N- -1 1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐 结合形成结合形成玫瑰红玫瑰红染料，通过目测比较
11、，大致估算染料，通过目测比较，大致估算 其含量。其含量。 检测亚硝酸步骤检测亚硝酸步骤 （1 1）配臵溶液）配臵溶液 （2） 配制标准液配制标准液 （3） 制备泡菜样品处理液制备泡菜样品处理液 （4）比色）比色 4mg/ml对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液：称取称取0.4 克对氨基苯磺酸，溶解于克对氨基苯磺酸，溶解于100ml体积分数为体积分数为 20的盐酸中，的盐酸中，避光保存避光保存。 （1 1）配臵溶液）配臵溶液 2mg/ml N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液：萘基乙二胺盐酸盐溶液： 称取称取0.2克克N-1萘基乙二胺盐酸盐，溶解于萘基乙二胺盐酸盐，溶解于 100ml的水中，的水中，避光保存。
12、避光保存。 加入各成分的作用（参考笔记或生物周报）加入各成分的作用（参考笔记或生物周报） 5ug/ml亚硝酸钠溶液：亚硝酸钠溶液： 称取称取0.10克于硅胶干燥器中干燥克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚小时的亚 硝酸钠，用水溶解至硝酸钠，用水溶解至500ml，再转移，再转移5 ml溶液溶液 至至200 ml容量瓶，定容至容量瓶，定容至200ml 提取剂提取剂： 分别称取分别称取5050克克氯化镉氯化镉、氯化钡氯化钡，溶解于溶解于 10001000mlml蒸馏水中蒸馏水中，用盐酸调节用盐酸调节pHpH至至1 1。 氢氧化铝乳液和氢氧化铝乳液和2 2. .5 5mol/Lmol/L的氢氧化钠溶液的氢
13、氧化钠溶液。 （2 2） 配制标准液配制标准液 用移液管吸取用移液管吸取0.20mL0.20mL、0.40mL0.40mL、0.60mL0.60mL、 0.80mL0.80mL、1.00mL1.00mL、1.50mL1.50mL亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶液( (相相 当于当于1 1ug，2ug，3ug，4ug，5ug和和7.5ug亚硝亚硝 酸钠酸钠) )，分别臵于，分别臵于50mL50mL比色管中，再比色管中，再取取1 1支比色支比色 管作为空白对照管作为空白对照。 并分别加入并分别加入2.0mL2.0mL对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液，混匀，混匀， 静臵静臵3 35 5分钟后；分钟后； 再分别
14、加入再分别加入1.0mL N1.0mL N- -1 1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐 溶液溶液，加蒸馏水至，加蒸馏水至50mL50mL，混匀；，混匀； 观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化。 （3 3）制备样品处理液的步骤是：）制备样品处理液的步骤是： 称取称取 0.4 kg0.4 kg泡菜，粉碎榨汁，过滤得约泡菜，粉碎榨汁，过滤得约200mL200mL 汁液。汁液。 取取100mL100mL汁液倒入汁液倒入500mL500mL容量瓶，添加容量瓶，添加200mL200mL 蒸蒸 馏水馏水 和和100mL 100mL 提取剂提取剂 ，摇床振荡，摇床振荡1h1h，再加，
15、再加40mL 40mL 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 ，最后用，最后用 蒸馏水蒸馏水 定容到定容到500mL500mL并并 立刻立刻 过滤过滤 获得滤液。获得滤液。 将滤液将滤液60mL60mL移入移入100mL100mL容量瓶，用容量瓶，用 氢氧化铝乳氢氧化铝乳 液液（吸附脱色）（吸附脱色）定容后过滤，获得定容后过滤，获得 无色透明无色透明 的滤液。的滤液。 专题专题2：微生物的培养与应用：微生物的培养与应用 . .培养基基本成分：培养基基本成分： 碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐 碳源碳源 无机碳源：无机碳源： 有机碳源：有机碳源： COCO2 2、COCO3 32 2- -、HC
16、OHCO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物自养微生物 异养微生物异养微生物 氮源氮源 无机氮源：无机氮源： 有机氮源：有机氮源： N2 、 、NH NH4 4 、 、NONO3 3- - 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等 含含C C、H H、O O、N N的有机物是异养型微生物的碳源、的有机物是异养型微生物的碳源、 氮源、能源。氮源、能源。 主要用于合成细胞物质、作为能源物质主要用于合成细胞物质、作为能源物质 主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 注意：注意：培养基还需要满足微生物对培养基还需要
17、满足微生物对PH、特殊营、特殊营 养物质养物质以及以及氧气氧气的需求。的需求。 3 3、类型、类型 液体培养基液体培养基 固体培养基固体培养基 选择培养基：选择培养基：在培养基中在培养基中加入某种化学物质加入某种化学物质, , 以以抑制不需要的微生物的生长抑制不需要的微生物的生长, ,促进所需要促进所需要 的微生物的生长。的微生物的生长。 鉴别培养基：鉴别培养基：在培养基中在培养基中加入某种指示剂或加入某种指示剂或 化学药品化学药品, ,用以鉴别不同种类的微生物。用以鉴别不同种类的微生物。 例如，在培养基中例如，在培养基中加入青霉素加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的，以抑制细菌、放线菌的 生长，
18、从而生长，从而分离到酵母菌和霉菌。分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中又如，在培养基中加加 入高浓度的食盐入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但可以抑制多种细菌的生长，但不影响金不影响金 黄色葡萄球菌的生长。黄色葡萄球菌的生长。 根据微生物的代谢特点，在培养基中加根据微生物的代谢特点，在培养基中加 入某种指示剂或化学药品配制而成，用入某种指示剂或化学药品配制而成，用 以鉴别不同种类的微生物。例如，在培以鉴别不同种类的微生物。例如，在培 养基中养基中加入伊红和美蓝加入伊红和美蓝，可以用来鉴别，可以用来鉴别 饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等 细菌：细菌：如果有
19、大肠杆菌如果有大肠杆菌，其代谢产物就，其代谢产物就 与伊红和美蓝结合，使与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，菌落呈深紫色， 并带有金属光泽。并带有金属光泽。 使用使用 方法方法 结果结果 常用的方法常用的方法 举例举例 消消 毒毒 灭灭 菌菌 较为较为温温 和和的物的物 理或化理或化 学方法学方法 强烈强烈的的 理化因理化因 素素 仅杀死物体表面或仅杀死物体表面或 内部内部一部分一部分对人体对人体 有害的微生物（不有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）包括芽孢和孢子） 杀死物体内外杀死物体内外所有所有 的微生物，包括芽的微生物，包括芽 孢和孢子孢和孢子 煮沸消毒法、煮沸消毒法、 巴氏消毒法、巴氏消毒
20、法、 化学药剂消毒法、化学药剂消毒法、 紫外线消毒法等紫外线消毒法等 灼烧灭菌、灼烧灭菌、 干热灭菌、干热灭菌、 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 二、无菌技术二、无菌技术 泛指在培养微生物的操作中，所有泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染防止杂菌污染的方法的方法 灭菌：强烈方法杀死一切微生物、孢子和芽孢灭菌：强烈方法杀死一切微生物、孢子和芽孢 （1 1）灼烧灭菌：接种环、试管口）灼烧灭菌：接种环、试管口 （2 2）干热灭菌：玻璃器皿、金属用具）干热灭菌：玻璃器皿、金属用具 （3 3）高压蒸气灭菌：培养基、无菌水）高压蒸气灭菌：培养基、无菌水 三、微生物培养技术三、微生物培养技术 （一）实验操作
21、步骤（以培养大肠杆菌为例）：（一）实验操作步骤（以培养大肠杆菌为例）： 1 1、制备培养基、制备培养基 （1 1）计算）计算 （2 2）称量称量 （3 3）溶化）溶化（注意取出称量纸）（注意取出称量纸） （4 4）灭菌）灭菌: : 高压蒸气灭菌锅高压蒸气灭菌锅，在压力为，在压力为100kPa100kPa、温度为、温度为 121121，灭菌，灭菌151530min30min。 （5 5）倒平板）倒平板: : 待培养基待培养基冷却到冷却到50 50 左右时，在酒精灯附左右时，在酒精灯附 近倒平板近倒平板。2d2d后观察平板，无杂菌污染才可用后观察平板，无杂菌污染才可用 来接种来接种。 倒平板技术倒
22、平板技术 溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热? ? 加琼脂的目的是什么加琼脂的目的是什么? ?为什么要用玻璃棒搅拌？为什么要用玻璃棒搅拌？ 在灭菌前在灭菌前, , 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的 锥形瓶的目的是什么？锥形瓶的目的是什么？ 培养皿能否用高压蒸汽灭菌？培养皿能否用高压蒸汽灭菌？ 可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中, , 减少误差减少误差 作为凝固剂；防止琼脂糊底导致烧杯破裂。作为凝固剂；防止琼脂糊底导致烧杯破裂。 在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞在灭菌时能
23、避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞, ,在取出培养在取出培养 基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用 不能不能, ,因为培养皿要保持干燥因为培养皿要保持干燥, ,应该用干热灭菌应该用干热灭菌. . 问题讨论 答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。答：用手触摸锥形瓶，感觉刚刚不烫手时。 2.2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 问题讨论 1.1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 50 左右时，才能用左右时，才能用 来倒平板。
24、你用什么办法来估计培养基的温度？来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 答：答：既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以 防止皿盖上的水珠落入培养基防止皿盖上的水珠落入培养基，影响微生物的生长。，影响微生物的生长。 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖 与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？为什么？ 答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。
25、答：最好不要用。因为空气中的微生物可能在此滋生。 2 2、纯化大肠杆菌：、纯化大肠杆菌： 平板划线法平板划线法和和稀释涂布平板法稀释涂布平板法 在培养基上将细菌逐步在培养基上将细菌逐步稀释或分散成单稀释或分散成单 个细胞个细胞，使其，使其长成单个的菌落长成单个的菌落，这个菌落就，这个菌落就 是一个纯化的细菌菌落。是一个纯化的细菌菌落。 *菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。 （1 1）原理：）原理： （2）常用常用接种方法接种方法： 1.1.为什么在操作的第一步以及划线之前都为什么在操作的第一步以及划线之前都 要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼要灼烧接种环？在划线操作结
26、束时，仍然需要灼 烧接种环？烧接种环？ 操作的第一步灼烧接种环是为了操作的第一步灼烧接种环是为了_ 每次划线前灼烧接种环是为了杀死每次划线前灼烧接种环是为了杀死_ 划线结束后仍然要灼烧接种环，能划线结束后仍然要灼烧接种环，能_ 讨论讨论 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 上次划线结束后，接种环上残留的菌种上次划线结束后，接种环上残留的菌种。 及时杀死接种环上残留的菌种及时杀死接种环上残留的菌种， 避免避免_和和_ 细菌污染环境细菌污染环境 感染操作者感染操作者 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后
27、再进行 划线？划线？ 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是 从上一次划线的末端开始划线？从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，划线后，线条末端细菌的数目线条末端细菌的数目比比_要要少少， 每次从上一次划线的末端开始，能使每次从上一次划线的末端开始，能使_随着随着 _而逐步而逐步_， 最终能得到由最终能得到由 _繁殖而来的繁殖而来的_。 以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。 线条起始处线条起始处 细菌的数目细菌的数目 划线次数的增加划线次数的增加 减少减少 单个细菌单个细菌 菌落菌落 2.2.稀释涂布平板稀释涂布平板
28、的操作方法的操作方法 讨论讨论 涂布平板的所有操作都应在涂布平板的所有操作都应在_进行。结合平进行。结合平 板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2 2步应如步应如 何进行无菌操作？何进行无菌操作？ 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒 精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任 何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。 将将_和和_（作为对照组）的培（作为对照组）的培 养基养基均均放到放到37370 0C C的恒温箱中，培
29、养的恒温箱中，培养121224h24h后进后进 行观察并记录结果。行观察并记录结果。 火焰附近火焰附近 如何对照？如何对照？ 接种后接种后 未接种未接种 课题延伸课题延伸菌种的保存菌种的保存 1.1.试管低温临时保存试管低温临时保存 将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌 落后，置于落后，置于4 4O OC C的冰箱中保存（每隔的冰箱中保存（每隔3 36 6个月要重新接种个月要重新接种 培养后再保存）。培养后再保存）。 2.2.甘油管长期保存甘油管长期保存 在在3mL3mL的甘油瓶中加入的甘油瓶中加入1mL1mL的甘油，高压灭菌。将的甘油，高压
30、灭菌。将1mL1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于2020O OC C的的 冷冻箱中保存。冷冻箱中保存。 标准： 低温 干燥 低氧 降低新陈代谢速度 一、实验室中微生物筛选的原理：一、实验室中微生物筛选的原理： 人为人为提供有利于目的菌株生长的提供有利于目的菌株生长的 条件条件（包括营养、温度、（包括营养、温度、PHPH等），同等），同 时抑制或阻止其他微生物生长。时抑制或阻止其他微生物生长。 二、分离能够分解尿素的细菌的培养基：二、分离能够分解尿素的细菌的培养基： 以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源 三、统计菌落数目：三、统计菌落数目
31、： 2、间接计数法（活菌计数法）、间接计数法（活菌计数法） 利用特定利用特定细菌计数板或血细胞计数板细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜，在显微镜 下计算一定容积里样品中微生物的数量。下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点此法的缺点 是不能区分死菌和活菌。是不能区分死菌和活菌。( (结果偏大结果偏大) ) 1、显微镜直接计数法、显微镜直接计数法 当样品的当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的稀释度足够高时，培养基表面生长的 一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过通过 统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有统计平板上的菌落数，就能推测出
32、样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。 （1）常用方法：）常用方法： （2）原理：）原理： 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 例题例题 某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平 板上菌落数的平均数为234，那么每克样品 中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体 积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4 B 每克样品中的菌株数 =（CV）M C C：代表某一稀释度下平板上生长的：代表某一稀释度下平板上生长的 平均菌落数平均菌落数。 V V：代表涂布平板时所用的稀释液的：代表涂布平板时所用的稀释液的 体积体积（mLmL）。 M M：代表稀释倍数：
33、代表稀释倍数。 注意事项 选择菌落数在30-300的平板上进行计数。 用三个或三个以上的平板，计算出菌落平 均数 （重复实验，减少误差）。 统计的细菌数往往比实际数目低。 因为当两个 或多个细胞 连在一起时， 繁殖后形成 的还是一个 菌落 （二）统计菌落数目 判断培养基中是否有杂菌污染： 将未接种的培养基同时进行培养。 判断选择培养基是否具有筛选作用： 完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观 察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素（无 关变量）对实验结果的影响，提高实验结果 的可信度。 （三）设置对照 实验流程：实验流程： 样品稀释涂布平板样品稀释涂布平板 微生物的培养与观察微生
34、物的培养与观察 菌落计数菌落计数 土壤取样土壤取样 制备培养基制备培养基 三、实验设计三、实验设计 从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。 先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入 事先准备好的信封中。 “微生物的天然培养基” 数量最大、种类最多 大约70%90%是细菌 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前 都要灭菌。 三、实验设计三、实验设计 （一）土壤取样 准备选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白 胨培养基。 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目，应明显 多于选择培养基。因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以 作为对照，用来判断选择培养基是否起到
35、了选择作 用。 三、实验设计三、实验设计 （二）制备培养基 三、实验设计三、实验设计 （三）样品的 稀释 稀释倍数稀释倍数 目的目的 细菌细菌 10104 4、10105 5、 10106 6 保证获得菌保证获得菌 落数在落数在3030 300300之间、之间、 适于计数的适于计数的 平板平板 放线放线 菌菌 10103 3、10104 4、 10105 5 真菌真菌 10102 2、10103 3、 10104 4 分离不同的微生物采用不分离不同的微生物采用不 同的稀释度同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含原因：不同微生物在土壤中含 量不同，稀释倍数也不同量不同，稀释倍数也不同 在菌落计数
36、时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培 养时间丌足而导致遗漏菌落的数目。 培养丌同微生物往往需要丌同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。 三、实验设计三、实验设计 （五）微生物的培养与观察 KHKH2 2POPO4 4 1.4 g1.4 g NaNa2 2HPOHPO4 4 2.1 g2.1 g MgSOMgSO4 4 7H7H2 2O O 0.2 g0.2 g 葡萄糖葡萄糖 10 g10 g 尿素尿素 1 g1 g 琼脂琼脂 15 g15 g 将上述物质溶解后，用蒸馏将上述物质溶解后，用蒸
37、馏 水定容到水定容到100 mL100 mL （4 4）转为固体培养基时，常）转为固体培养基时，常 的方法接种的方法接种. . （5 5）下列材料或用具：培养细菌用的培养基与培养皿，玻棒、试管、锥）下列材料或用具：培养细菌用的培养基与培养皿，玻棒、试管、锥 形瓶和吸管，实验操作者的双手。其中需形瓶和吸管，实验操作者的双手。其中需 要灭菌的是：要灭菌的是： ；需要消毒的是：；需要消毒的是： （6 6）在进行分离分解尿素的细菌实验时，）在进行分离分解尿素的细菌实验时，A A同学从培养基上筛选出大约同学从培养基上筛选出大约150150个个 菌落，而其他同学只选择出大约菌落，而其他同学只选择出大约50
38、50个菌落。个菌落。A A同学的实验结果产生的原因可能同学的实验结果产生的原因可能 有有 （填序号）（填序号） 由于土样不同由于土样不同 由于培养基污染由于培养基污染 由于操作失误由于操作失误 （7 7）实验结束后，使用过的培养基应该进行）实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。处理后，才能倒掉。 （1）右表所示的培养基不能用于植物组织培养）右表所示的培养基不能用于植物组织培养 的理由是的理由是 。 （2）培养基中加入尿素的目的是筛选）培养基中加入尿素的目的是筛选 。 （3）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来）“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来 自培养基中的自培养基中的 和和
39、 ，实验需要振荡，实验需要振荡 培养，原因是培养，原因是 。 缺少植物激素缺少植物激素 目的菌目的菌 尿素尿素 葡萄糖葡萄糖 为目的菌提供氧气为目的菌提供氧气 稀释涂布平板法或平板划线法稀释涂布平板法或平板划线法 和和 灭菌灭菌 实例：分解尿素的细菌的分离与计数实例：分解尿素的细菌的分离与计数 一、菊花组织的培养一、菊花组织的培养 1 1、原理：植物细胞的全能性、原理：植物细胞的全能性 2 2、步骤、步骤：（：（1 1）制备）制备MSMS固体培养基固体培养基（灭菌）（灭菌） 无机盐、维生素、无机盐、维生素、蔗糖蔗糖、激素激素 （2 2）外植体）外植体消毒消毒（未开花新生侧枝）（未开花新生侧枝）
40、 （3 3）接种）接种 （4 4）培养）培养 （5 5）移栽）移栽 （6 6）栽培）栽培 专题专题3 植物组织培养技术植物组织培养技术 培养条件：培养条件：PH5.8、温度、温度18-22、每日光照、每日光照12h 讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题 2 2中微生物培养基的配方相比，中微生物培养基的配方相比，MSMS培养基的配方培养基的配方 有哪些明显的不同？有哪些明显的不同？ 答：答：微量元素和大量元素微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必提供植物细胞生活所必 需的需的无机盐无机盐；蔗糖蔗糖提供提供碳源碳源，同时能够维持细胞，同时能够维持细胞
41、 的的渗透压渗透压；甘氨酸、维生素甘氨酸、维生素等物质主要是为了满等物质主要是为了满 足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后 所产生的所产生的特殊营养需求特殊营养需求。 微生物微生物培养基以培养基以有机营养为主有机营养为主。与微生物的培养。与微生物的培养 不同，不同，MSMS培养基培养基则需提供则需提供大量无机营养大量无机营养，无机，无机 盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元 素两大类。素两大类。 3 3、过程：、过程： 离体器官、 组织或细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 根、 芽 植物体 根、芽根、芽
42、 （胚状体）（胚状体） 4 4、不同植物激素使用顺序和使用量、不同植物激素使用顺序和使用量 使用顺序使用顺序 实验结果实验结果 先生长素，后先生长素，后 细胞分裂素细胞分裂素 先细胞分裂素，先细胞分裂素， 后生长素后生长素 同时使用同时使用 生长素生长素/ /细细 胞分裂素胞分裂素 结果结果 比值高时比值高时 比值低时比值低时 比值适中比值适中 有利于有利于分裂分裂 但不分化但不分化 细胞既细胞既分裂分裂 也分化也分化 分化频率分化频率 提高提高 有利于根的分化，有利于根的分化， 抑制芽的形成抑制芽的形成 有利于芽的分化，有利于芽的分化， 抑制根的形成抑制根的形成 促进愈伤组织生长促进愈伤组织生长
