1、h1第十二章第十二章 制备型高效液相色谱制备型高效液相色谱h2制备型高效液相色谱的用途：制备型高效液相色谱的用途：v1重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规重组蛋白药物生产的工艺优化、中试以及大规模生产的必备手段。模生产的必备手段。h3h4v2天然产物中活性物质发现的重要手段天然产物中活性物质发现的重要手段:蛋白蛋白质质,多肽多肽,多糖。抗菌肽多糖。抗菌肽v3从天然产物来源药品生产的重要手段：胰岛从天然产物来源药品生产的重要手段：胰岛素，蕲蛇酶。素，蕲蛇酶。v4实验室制备样品用于临床试验和报批。实验室制备样品用于临床试验和报批。v5 在在 2-D 电泳电泳,blotting,ELISA 等之
2、前的样等之前的样品制备。品制备。h5h6h7第一节第一节 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介1.1 1.1 液相色谱的发展史液相色谱的发展史 v19031903年，色谱法问世。年，色谱法问世。俄国植物学家茨维特俄国植物学家茨维特 19031903年年3 3月月2121日，日，大会报告大会报告 “一种新型一种新型吸附现象及其在生化吸附现象及其在生化分析上的应用分析上的应用”1906 1906年年在德国植物学杂志发表在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 h8v19311931年，库恩（年，库恩（KuhnK
3、uhn）分离胡萝卜素，分离胡萝卜素，19381938年，年，KuhnKuhn和和LedererLederer从维生素从维生素B B中分离出中分离出B B6 6，获得了获得了19381938年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。v19411941年，马丁（年，马丁（MartinMartin）和辛格（和辛格（SyngeSynge）提提出液液分配色谱法，出液液分配色谱法，19521952年度的诺贝尔奖。年度的诺贝尔奖。h9v6060年代末，年代末，7070年代初，高效液相色谱仪的成功研制年代初，高效液相色谱仪的成功研制v高效填料，高压泵，仪器检测高效填料，高压泵，仪器检测h101.2 基本仪器装置基本
4、仪器装置v输液系统输液系统v进样系统进样系统v分离系统分离系统v检测系统检测系统v收集系统收集系统v数据处理系统数据处理系统h11h122 1 高效液相色谱高效液相色谱仪仪组成组成1 输液系统输液系统 (1)高压输液泵高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。h13h14(2)在线脱气装置在线脱气装置作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气 装置再输送到色谱柱。装置再输送到色谱柱。
5、超声脱气、真空脱气等超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。基线飘移，噪音增加。Pressure Dampers O2,N2,CO2h15（3）梯度洗脱装置）梯度洗脱装置Isocratic elution恒定组成的单一溶剂体系恒定组成的单一溶剂体系Gradient elution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分目的是分离多组容量因子相差较大的组分High-Pressure Mixingh162 进样系统进样系统六通阀六通阀h173 分离
6、系统分离系统3.1色谱柱色谱柱h18 3.2色谱柱填色谱柱填料料spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle.K.K.Unger,Porous silica,Elsevier,1979 基质：载体或担体。数基质：载体或担体。数 m m数十数十 m m，球形。，球形。硅胶或有机高分子聚合物硅胶或有机高分子聚合物h19Pellicular particlePorous particle30-50m1-2m3-10 mh20 3.3色谱柱填料色谱柱填料功能层：物理吸附或化学键功能层：物理吸
7、附或化学键合合h21v检测系统：检测系统：h22v收集系统：收集系统：h23v数据处理系统：数据处理系统：h24三、高效液相色谱法的特点三、高效液相色谱法的特点v采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。v和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高辨率高、自动化程度高 等。等。h25四、四、制备型高效液相色谱与分析型高制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别效液相色谱法的区别 v输液泵不同：输
8、液泵不同：两种泵设计的特点及其性能两种泵设计的特点及其性能AKTA prime AKTA purifier AKTA xpress 系统泵及样品泵 泵型：单泵 流速：0.1-50ml/min 泵压：1Mpa 增量:0.1ml/min 粘度：10cp 泵型：双泵 4 泵头高效柱塞泵 流速0.001-10ml/min 泵压：25Mpa 流速精度k1，则，则k2/k1，所以，所以又称为相对保留时间又称为相对保留时间（美国药典美国药典）。要使两组分得到分离，必须使）。要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充
9、情况无关。从本柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，质上来说，的大小表示两组份在两相间的平衡分的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。12kkh32v分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下一般情况下,分离度大于分离度大于1.51.5时称分离完全时称分离完全.只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求：在色谱分析中要求：两组分的保留值差别要足够大。两组分的保留值差别要足够大。两色谱峰要足够窄
10、。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.2121)(2)(211212WWttWWttRrrrrh33六、制备型高效液相色谱的重要参数六、制备型高效液相色谱的重要参数：Capacity:Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。是体积也可以是质量。Speed:Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。Recovery:Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少
11、步鄹和保持一种对生物样品环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。合适的环境条件。Resolution:Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。其是杂质的结构和目的物结构相似时。h34七、分离机理和色谱类型七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据分离蛋白质类物质时的分离依据：疏水性疏水性分子大小分子大小等电点等电点结构特异性结构特异性h35色谱介质按分离机理分为色谱介质按分离机理分为正相色谱：正相色谱：反相色谱：常加入反相色谱：常加入TFA离子交换色谱：阴离子交换色谱（离子交换色谱：阴离
12、子交换色谱（DEAE二乙基二乙基氨基乙基，氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基羧甲基S磺酸基）磺酸基）凝胶过滤色谱：凝胶过滤色谱：疏水色谱：苯基，辛基等。疏水色谱：苯基，辛基等。金属螯合色谱：镍、铜等金属螯合色谱：镍、铜等亲合色谱亲合色谱:h36第二节第二节 分离方案的设计分离方案的设计vWhat is the intended use of the product?vWhat kind of starting material is available and how should it be handled?vWhat are the purity iss
13、ues in relation to the source material and intended use of the final product?vWhat has to be removed?vWhat must be removed completely?vWhat will be the final scale of purification?vWhat are the economical constraints and what resources and equipment are available?h37一、分离方法之间的组合一、分离方法之间的组合 四步纯化法：四步纯化
14、法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrate and stabilize)Intermediate purification:(Remove bulk impurities)Polishing:(Achieve final high level purity）h38v色谱之间的组合方案色谱之间的组合方案vAC、GF、IEX、HICh39GFIEXHICACCrude sampleIEXIEXGFxGFGFHICGFGFxGFxGFxSuitable preparationh40二、分离条件的优化二、分离条件的优化 合适的溶剂强度合适的溶剂强度:容量因子容
15、量因子k 足够的柱效足够的柱效N:良好的分离选择性良好的分离选择性:h41当柱过载时：当柱过载时：1 N1 N和和k都随样品负荷的增加而迅速地减小都随样品负荷的增加而迅速地减小2 2 流速对于塔板数流速对于塔板数N的影响大大地降低的影响大大地降低 3 通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过降低柱压（或流速）来达此目的降低柱压（或流速）来达此目的 h42h43h44 制备分离的两种途径：制备分离的两种途径：第一种，基本上同于分析型，进样量不过载，利用第一种，基本上同于分析型，进样量不过载，利用大内径的柱，通过调整分离方程中的有关参数来达大内径的柱，通过调整分
16、离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料（约（约10m）来制取少量价值高而难分离的物质。来制取少量价值高而难分离的物质。第二种，使用大粒度填料（第二种，使用大粒度填料（50m）的大内径柱，的大内径柱，在过载情况下制备相对大量的纯物质。当在过载情况下制备相对大量的纯物质。当值相当值相当大时（例如大时（例如1.2），提高洗脱液的流速并不至于严），提高洗脱液的流速并不至于严重降低分离度，从而大大缩短分离时间。重降低分离度，从而大大缩短分离时间。h45三、三、制备型高效液相色谱常见问题及解决制备型高效液相色谱常见问题及解决办法办法v
17、待分离成分呈单一主峰待分离成分呈单一主峰v不易分开的两组分不易分开的两组分v目的组分含量少目的组分含量少h46v待分离成分呈单一主峰待分离成分呈单一主峰h47v不易分开的两组分不易分开的两组分h48v目的组分含量少目的组分含量少h49第三节第三节 实验条件的选择实验条件的选择 v色谱柱的选择与填装色谱柱的选择与填装v柱填料柱填料v流动相选择流动相选择v检测器的选择检测器的选择v仪器设备仪器设备h50一、柱的选择和装填 柱：柱：v不锈钢柱不锈钢柱：200kg，生物适应性差生物适应性差v玻璃柱：玻璃柱：1015kgv聚合物柱：聚合物柱：装填：装填：v当粒度小于当粒度小于20m，用较大的匀浆罐湿法填
18、装。粒，用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于度大于30m时；利用轻敲柱外壁的干填法时；利用轻敲柱外壁的干填法h51二、柱填料 v硅胶：硅胶：v葡聚糖和琼脂糖：葡聚糖和琼脂糖：v高分子聚合物：高分子聚合物：h52v颗粒大小h53v在在很小的分离制备中，要求较高的很小的分离制备中，要求较高的N N值，宜用小值，宜用小粒度的填装柱。粒度的填装柱。v当当很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处。处。h54三、洗脱剂 v可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比，离子强度，和要求的流动相
19、的组成（如溶剂的配比，离子强度，pHpH等），将其直接或略加修改后用于制备分离等），将其直接或略加修改后用于制备分离 v一般不采用梯度洗脱一般不采用梯度洗脱 v选择合适的溶剂溶解样品选择合适的溶剂溶解样品v采用色谱纯的试剂采用色谱纯的试剂h55四、仪器设备v对 泵 的 精 密 度 和 准 确 度 要 求 不 高（对 泵 的 精 密 度 和 准 确 度 要 求 不 高（0.0 10.0 1 100100mL/minmL/min）v对检测器的高灵敏要求不高对检测器的高灵敏要求不高v流路系统尽可能用惰性聚合材料流路系统尽可能用惰性聚合材料 v柱外效应试验结果影响较小柱外效应试验结果影响较小 h56第
20、四节第四节 操作变量的确定操作变量的确定 一、样品的进样量一、样品的进样量v宜注射低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度小体宜注射低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度小体积的样品。积的样品。v样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。h57柱内径，柱内径，mmmm困难的分离（困难的分离（1.21.2），），mgmg容易的分离（容易的分离（1.21.2），），mgmg2 20.20.22 25 525258 81010505010010050050025251001005005
21、001000100050005000h58二、制备产率 v产率随分离度的提高而增加。产率随分离度的提高而增加。v不过载的柱子，不过载的柱子，k k值较小时，产率较高。值较小时，产率较高。v用全孔填料时产率高于用薄壳型的。用全孔填料时产率高于用薄壳型的。v对于对于值小的分离，宜利用小粒度（值小的分离，宜利用小粒度（5 51010mm）填料的柱子；在填料的柱子；在较大时，使用较大颗粒、大内径较大时，使用较大颗粒、大内径的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。v柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。v 产率随柱长、流动
22、相的流速的增加而增加。产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。h59三、回收率计算和纯度鉴定v除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，冷冻干燥。冷冻干燥。v纯度：纯度：HPLCHPLC，TCLTCL。v回收率：重量，活性。回收率：重量，活性。h60第五节第五节 应用实例应用实例-蛇毒中溶栓组分的分离蛇毒中溶栓组分的分离h61h62制备型高效液相色谱的应用制备型高效液相色谱的应用v肽的分离肽的分离v蛋白质的分离蛋白质的分离v多糖的分离多糖的分离v核酸的分离核酸的分离h63 肽的分离：肽的分离：常用方法为反相色谱和离子交换色谱常用方法为反相色谱和离
23、子交换色谱 肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。肽的检测：肽的检测：UV200UV200230nm230nm，荧光检测。荧光检测。h64蛋白质的分离蛋白质的分离1 1填料填料：孔径孔径3003005005002 2流动相流动相（1 1）pH pH 低低pHpH使蛋白质羧基解离受到抑制，使蛋白质羧基解离受到抑制，极性降低，与反相键合相的作用强。对大极性降低，与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言，使用多蛋白质而言，使用pH2.5pH2.53.53.5的流动相
24、的流动相可以得到最好的分离。可以得到最好的分离。h65（2 2）离子强度和离子对试剂）离子强度和离子对试剂 增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用，较高的离子强度（用，较高的离子强度（0.20.2）可使蛋白质有较好）可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。的分辨率和回收率。缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则如
25、果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则复合离子对保留时间减少。复合离子对保留时间减少。h66v（3 3）有机溶剂）有机溶剂 v有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。一。较常用的有乙腈和丙醇。v使用复合溶剂（如异丙醇使用复合溶剂（如异丙醇-乙醇、乙腈乙醇、乙腈-异丙醇等）异丙醇等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。h67v（4 4）表面活性剂）表面活性剂 两性离子表面活性剂可以减少两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，使分离得高分子量、疏水性较强
26、的蛋白质的拖尾，使分离得以改善。以改善。v（5 5）温度）温度 为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，分离一般在室温或低温下进行分离一般在室温或低温下进行。h68 三、多糖的分离三、多糖的分离 分离：高效体积排阻色谱分离：高效体积排阻色谱检测：常用示差折射仪（检测：常用示差折射仪（RIRI）h69示差折射检测器示差折射检测器 通过连续监测参比池和测量池中溶液的折通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器整体性质检测器 凡是与流动相光折射率有差别的样品都可凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（用它来测定，其检测限可达（10-610-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数越为大多数溶剂折射率的温度系数越为5 10-4，因，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。h70四、核酸与核苷酸的分离四、核酸与核苷酸的分离五、脂类的分离五、脂类的分离
