1、HLJ1在肝细胞癌组织中的表达及生物学意义第1页，共28页。随着分子生物学技术的不断发展，肝癌转随着分子生物学技术的不断发展，肝癌转移复发预测分子水平的研究成为近年研究的重移复发预测分子水平的研究成为近年研究的重点和热点，进一步研究肝癌转移的基因改变、点和热点，进一步研究肝癌转移的基因改变、寻找新的肝癌异常表达或缺失基因发生，从基寻找新的肝癌异常表达或缺失基因发生，从基因水平认识肝细胞的发生、发展和转移的分子因水平认识肝细胞的发生、发展和转移的分子机制，从而为早期诊断治疗肝癌，判断预后，机制，从而为早期诊断治疗肝癌，判断预后，实行针对患者个体生物学特点的治疗提供新的实行针对患者个体生物学特点的
2、治疗提供新的方法。方法。第2页，共28页。热休克蛋白（热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）是广泛存在于）是广泛存在于生物界中具有高度保守性质的蛋白质，在应激状态下可以生物界中具有高度保守性质的蛋白质，在应激状态下可以被诱导表达被诱导表达4，根据同源程度及分子量大小可分为，根据同源程度及分子量大小可分为Hsp110、Hsp90、Hsp70和和Hsp60、Hsp40、小分子、小分子Hsp(2223 kD)以及泛素等几个家族。热休克蛋白家以及泛素等几个家族。热休克蛋白家族在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发族在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用，其主
3、要的生物学功能是在应激状态下挥重要的作用，其主要的生物学功能是在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质。热休克蛋白与不同保护细胞生命活动必需的蛋白质。热休克蛋白与不同功能的多种蛋白质形成复合体，并通过其结合和解离功能的多种蛋白质形成复合体，并通过其结合和解离参与靶蛋白的折叠、亚基间装配、细胞内运输及降解，参与靶蛋白的折叠、亚基间装配、细胞内运输及降解，以调节靶蛋白的活性和功能，故热休克蛋白又被称作以调节靶蛋白的活性和功能，故热休克蛋白又被称作“分子伴侣分子伴侣”(molecular chaperone)5-8。近年发现。近年发现HSP与肿瘤发生发展、生物学行为及其预后有较密切的关系与肿瘤发生发
4、展、生物学行为及其预后有较密切的关系9。第3页，共28页。HLJ1是最新发现的是最新发现的Dnaj类类Hsp40家族成员之一，定位家族成员之一，定位于人类染色体于人类染色体1P31.1，HLJ1蛋白由蛋白由337个氨基酸残基构成，个氨基酸残基构成，分子量约分子量约40kDa，属于，属于Hsp40家族家族10。HLJ1基因内含有基因内含有一个能驱动其转录活性的区域，序列分析显示此区缺一个能驱动其转录活性的区域，序列分析显示此区缺失失TATA盒，存在一个盒，存在一个CCAAT盒，并有四个转录因子盒，并有四个转录因子YY1（Yin-Yang-1，又称，又称NF-E1）的结合位点，这对）的结合位点，这
5、对调控调控HLJ1的表达是非常重要的的表达是非常重要的11。第4页，共28页。最新的研究证实，最新的研究证实，HLJ1参与了参与了STAT1和和P21WAF1信号路径，能够上调信号路径，能够上调STAT1、P21WAF1的表达，的表达，同时下调同时下调Cyclin D1的表达的表达12。P21WAF1的表达上调和的表达上调和Cyclin D1的表达下调能够减缓细胞分裂和肿瘤细胞的表达下调能够减缓细胞分裂和肿瘤细胞的生长的生长13-17。此外，。此外，HLJ1能上调钙粘蛋白能上调钙粘蛋白E的表的表达并能抑制达并能抑制CD44的表达，从而降低细胞的侵袭力的表达，从而降低细胞的侵袭力18-19。Ch
6、en等进行了筛选肿瘤侵袭和转移相关基等进行了筛选肿瘤侵袭和转移相关基因的实验，用基因芯片技术检测了一个肺癌侵袭因的实验，用基因芯片技术检测了一个肺癌侵袭性细胞系模型，发现性细胞系模型，发现HLJ1跟肿瘤侵袭转移相关。跟肿瘤侵袭转移相关。第5页，共28页。HLJ1是一个新的抑癌基因，具有抑制细胞是一个新的抑癌基因，具有抑制细胞生长、增殖、侵袭、迁移，促进凋亡、参与细胞生长、增殖、侵袭、迁移，促进凋亡、参与细胞周期调控等作用，并与肿瘤的复发、转移密切相周期调控等作用，并与肿瘤的复发、转移密切相关。但目前国内外有关关。但目前国内外有关HLJ1在肝细胞癌中表达在肝细胞癌中表达情况，情况，HLJ1与肝细
7、胞癌临床病理特征的关系等与肝细胞癌临床病理特征的关系等研究尚未见报道。因而，本课题将研究研究尚未见报道。因而，本课题将研究HLJ1在在原发性肝细胞癌中的表达情况及其与肝细胞癌临原发性肝细胞癌中的表达情况及其与肝细胞癌临床病理特征的关系。床病理特征的关系。第6页，共28页。第二章第二章 材料和方法材料和方法2.1 2.1 材料材料2.1.1 2.1.1 标本收集及临床病理资料标本收集及临床病理资料 组织标本取自组织标本取自2005年年3月至月至2006年年12月中月中南大学湘雅医院外科手术切除的南大学湘雅医院外科手术切除的32例肝细胞癌例肝细胞癌组织和组织和32例相对应的癌旁组织（距肿瘤边缘例相
8、对应的癌旁组织（距肿瘤边缘2cm），标本离体后迅速取材，一部分置入液），标本离体后迅速取材，一部分置入液氮速冻后转入氮速冻后转入-70超低温冰箱存放。在取材时超低温冰箱存放。在取材时务必注意避开坏死组织，全部病例均未接受包务必注意避开坏死组织，全部病例均未接受包括肝动脉化疗栓塞术等在内的多种肿瘤治疗。括肝动脉化疗栓塞术等在内的多种肿瘤治疗。第7页，共28页。32例例HCC中男性中男性27例，女性例，女性5例，年龄例，年龄2762岁，岁，中位年龄中位年龄41岁；其中合并肝硬化的岁；其中合并肝硬化的20例（例（62.5），无），无肝硬化的肝硬化的12例（例（37.5）；直径大于）；直径大于5cm的
9、共的共21例例（65.6），小于或等于），小于或等于5cm的共的共11例（例（34.4）；有）；有静脉浸润的静脉浸润的16例（例（50.0），无静脉浸润的），无静脉浸润的16例（例（50.0）；单结节的）；单结节的21例（例（65.6），多结节的），多结节的11例（例（34.4）；）；Edmonson 分级分级级的级的12例（例（37.5），），级的级的20例（例（62.5）。所有标本均经病理组织学检）。所有标本均经病理组织学检查证实诊断。查证实诊断。第8页，共28页。2.1.2 2.1.2 主要试剂主要试剂TRIZOL 晶美生物科技公司晶美生物科技公司RT-PCR试剂盒（试剂盒（DR019A
10、）大连宝生物公司）大连宝生物公司2.1.3 2.1.3 引物引物所有引物均由上海英俊公司负责合成所有引物均由上海英俊公司负责合成2.1.4 2.1.4 主要仪器主要仪器移液枪移液枪 Eppendorf低温高速离心机低温高速离心机 EppendorfPCR 仪仪 Perkin ElmerDNA 凝胶电泳设备凝胶电泳设备 BioRad凝胶电泳成像分析仪凝胶电泳成像分析仪 BioRad第9页，共28页。2.2 2.2 方法方法2.2.1 2.2.1 实验技术路线实验技术路线组织标本（组织标本（3232对）对）提取组织总提取组织总RNARNART-PCRRT-PCR临床病理资料临床病理资料分析结果得出
11、结论分析结果得出结论相关性分相关性分析析第10页，共28页。2.2.2 RT-PCR2.2.2 RT-PCR检测法检测法2.2.2.1 RT-PCR2.2.2.1 RT-PCR引物设计引物设计 分别从分别从GeneBank中获取中获取HLJ1和和GAPDH的的mRNA全长全长序列（详见附录）。利用序列（详见附录）。利用Primer 5引物设计软件设计引物。引物设计软件设计引物。HLJ1引物：引物：Forward：5-ATATTGTGAAACCCGGAATG-3Reverse：5-TTTGCCTATTTATTTGACCC-3产物长度产物长度325bpGAPDH引物：引物：Forward：5-GG
12、TGAAGGTCGGAGTCAACG-3Reverse：5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3产物长度产物长度500bp第11页，共28页。2.2.2.2 2.2.2.2 组织总组织总RNARNA提取提取 取肝癌组织和癌旁组织各取肝癌组织和癌旁组织各100mg/ml Trizol，置于消，置于消毒硏砵中，加入液氮使之易于研磨粉碎。研磨粉碎后，毒硏砵中，加入液氮使之易于研磨粉碎。研磨粉碎后，加入加入1ml Trizol，室温放置，解冻后继续研磨成浆。要研，室温放置，解冻后继续研磨成浆。要研磨细致，不要留有组织残渣。成浆后吸入磨细致，不要留有组织残渣。成浆后吸入1.5ml EP管。管。冰
13、上放置冰上放置5分钟。加入分钟。加入0.2ml 氯仿，用力震荡氯仿，用力震荡30s，冰上，冰上静置静置5min。4 12000转转/min 离心离心15min。取上清夜于另。取上清夜于另一一EP管。加异丙醇管。加异丙醇0.5ml，震荡，震荡1分钟，冰上静置分钟，冰上静置15min。4 12000转转/min 离心离心10min，倒掉液体。加，倒掉液体。加75的酒精的酒精1ml，震荡，震荡1min。4 7500转转/min 离心离心5min，倒掉液体，倒掉液体，重复此步骤一次。短离心，将离心出来的残液用小重复此步骤一次。短离心，将离心出来的残液用小Tip头吸净。头吸净。EP管置于滤纸上晾干。根据
14、产量用管置于滤纸上晾干。根据产量用DEPC处理处理的水的水30l-50l，溶解，溶解RNA。琼脂糖凝胶电泳并测定。琼脂糖凝胶电泳并测定OD值，分析提取值，分析提取RNA的纯度和浓度。的纯度和浓度。第12页，共28页。2.2.2.3 2.2.2.3 第一链第一链cDNAcDNA的合成的合成 逆转录合成第一链逆转录合成第一链cDNA，操作按，操作按RT-PCR试剂盒（试剂盒（DR019A）说明书进行。整个操作过程）说明书进行。整个操作过程中要戴口罩帽子，并始终在冰上操作，采用中要戴口罩帽子，并始终在冰上操作，采用20l反应体系反应体系。2.2.2.4 PCR2.2.2.4 PCR扩增扩增 新合成的
15、引物新合成的引物12000转转/min短暂离心，用短暂离心，用消毒双蒸水稀释引物至消毒双蒸水稀释引物至100M，将合成的第，将合成的第一链一链cDNA稀释至稀释至100l，取，取10l作为模板，加作为模板，加引物引物PCR扩增，扩增，采用采用20l20l反应体系，反应体系，进行进行30个个循环。循环。第13页，共28页。2.2.2.5 2.2.2.5 电泳及分析结果电泳及分析结果 反应结束后取反应结束后取PCR产物产物4l加加2l 6上样缓冲液，于上样缓冲液，于1.5的琼脂糖凝胶电泳（的琼脂糖凝胶电泳（100V，15min），采用凝胶自动），采用凝胶自动分析仪计算产物的光密度值。分析仪计算产物
16、的光密度值。2.2.3 2.2.3 临床病理特征研究临床病理特征研究 每例标本均需记录详细的临床病理特征，包括性别、每例标本均需记录详细的临床病理特征，包括性别、肝硬化有无、结节数、肿瘤直径；肝癌组织有无静脉浸润肝硬化有无、结节数、肿瘤直径；肝癌组织有无静脉浸润及细胞分化程度资料由湘雅医院病理科提供。及细胞分化程度资料由湘雅医院病理科提供。HCC细胞分细胞分化根据化根据Edmonson-Steiner分级而定分级而定21：级癌细胞在级癌细胞在形态上较接近正常肝细胞，分化较高；形态上较接近正常肝细胞，分化较高；级癌细胞胞级癌细胞胞核大而深染，胞浆少，分化低。镜下见血管内有癌细胞浸核大而深染，胞浆
17、少，分化低。镜下见血管内有癌细胞浸润伴血管内皮染色不连续或见管腔内有癌栓存在，即为静润伴血管内皮染色不连续或见管腔内有癌栓存在，即为静脉浸润。肿瘤直径为肿瘤组织的最大直径。（见图脉浸润。肿瘤直径为肿瘤组织的最大直径。（见图4）第14页，共28页。2.3 2.3 实验设计与分组实验设计与分组 临床标本按取材部位不同分为临床标本按取材部位不同分为HCC组（组（n1=32）和和PCLT组（组（n2=32）。检测上述两组中）。检测上述两组中HLJ1 mRNA的的表达，比较组间表达，比较组间HLJ1 mRNA的表达水平的差异。根据的表达水平的差异。根据RT-PCR结果，以结果，以32例肝细胞癌中例肝细胞
18、癌中HLJ1 mRNA表达量的表达量的均数均数X1与对应的与对应的32例癌旁组织中例癌旁组织中HLJ1 mRNA表达量的表达量的均数均数X2的比值：的比值：X1/X2=0.61为界值，分为为界值，分为HLJ1低表达低表达组组(n1=18)和高表达组和高表达组(n2=14)。每组再根据性别、肝。每组再根据性别、肝硬化有无、肿瘤结节数目、肿瘤直径、有无静脉浸润、硬化有无、肿瘤结节数目、肿瘤直径、有无静脉浸润、HCC细胞分化程度等临床病理特征分组，形成四方表格细胞分化程度等临床病理特征分组，形成四方表格资料，比较资料，比较HLJ1表达水平与表达水平与HCC临床病理特征间的关临床病理特征间的关系。系。
19、第15页，共28页。2.4 2.4 统计分析方法统计分析方法 全部数据采用全部数据采用SPSS 11.5统计软件包进行统计统计软件包进行统计学分析，计量资料的均数用学分析，计量资料的均数用X SD表示，计量表示，计量资料比较采用非配对资料比较采用非配对t检验。计数资料的组间比较检验。计数资料的组间比较采用采用Fishers 确切概率法。以确切概率法。以P 0.05作为差异具有作为差异具有显著性意义的界值。显著性意义的界值。第16页，共28页。第三章第三章 结结 果果3.1 RNA3.1 RNA质量检测质量检测 提取的组织提取的组织RNA采用琼脂糖凝胶电泳检测，发采用琼脂糖凝胶电泳检测，发现现1
20、8S、28S条带明亮、清晰、锐利（图条带明亮、清晰、锐利（图1）。同时）。同时检测了检测了RNA在在280nm和和260nm的吸光度值，发现的吸光度值，发现OD260/OD280（Ratio，R）比值均位于）比值均位于1.82.0之之间（表间（表1）。以上检测结果均证实，所提取的组织）。以上检测结果均证实，所提取的组织RNA质量良好，可用于后续的质量良好，可用于后续的RT-PCR实验。实验。第17页，共28页。NLHCCPLCTHCCPLCT5S18S28S图图1 1：组织：组织RNARNA琼脂糖凝胶电泳图琼脂糖凝胶电泳图NLNL：正常肝组织；：正常肝组织；HCCHCC：肝癌组织；：肝癌组织；
21、PLCTPLCT：癌旁组织癌旁组织第18页，共28页。表表1：组织：组织RNA在在280nm和和260nm的吸的吸光度值及吸光度比值光度值及吸光度比值样品名称样品名称吸光度值吸光度值比值比值260nm280nmNL37.0119.2931.92HCC60.49930.9861.95PLCT60.85331.491.93HCC62.45232.3271.93PLCT47.14824.1561.95第19页，共28页。3.2 HLJ1 3.2 HLJ1 在在HCCHCC和和PLCTPLCT中的中的mRNAmRNA表达水平表达水平 32例肝癌组织及例肝癌组织及32例对应的癌旁组织的例对应的癌旁组织的
22、RT-PCR结果显示，结果显示，HCC组织中组织中HLJ1 mRNA的表达水平为的表达水平为1.18 0.82，PLCT组织中组织中HLJ1 mRNA的表达水平为的表达水平为1.92 1.15，HCC组织中组织中HLJ1 的的mRNA表达水平显著性低于癌旁组织，表达水平显著性低于癌旁组织，差异具有显著的统计学意义（差异具有显著的统计学意义（P 0.05）。）。（图（图2、图、图3）第20页，共28页。HCCHCCPLCTPLCTHLJ1GAPDH325bp500bp图图2：HLJ1 RT-PCR结果琼脂糖凝胶电泳图结果琼脂糖凝胶电泳图HCC：肝癌组织；：肝癌组织；PLCT：癌旁组织：癌旁组织
23、HCCPLCT相对表达量相对表达量图图3：HLJ1 RT-PCR统计分析直方图统计分析直方图HCC：肝癌组织；：肝癌组织；PLCT：癌旁组织：癌旁组织第21页，共28页。3.3 HLJ1 mRNA3.3 HLJ1 mRNA表达与肝细胞癌临床病理特征的关系表达与肝细胞癌临床病理特征的关系 结果显示，两者在肿瘤细胞分化程度（结果显示，两者在肿瘤细胞分化程度（P=0.010）、静）、静脉浸润（脉浸润（P=0.001）方面的差异具有显著性意义，而在性别、）方面的差异具有显著性意义，而在性别、肝硬化有无、肿瘤结节数目和肿瘤直径方面无显著性差异。肝硬化有无、肿瘤结节数目和肿瘤直径方面无显著性差异。（图（图
24、4，表，表2）第22页，共28页。图图4：肝癌细胞分化程度和静脉浸润的：肝癌细胞分化程度和静脉浸润的HE染色图（染色图（400倍）倍）A：正常肝组织；：正常肝组织；B：Edmonson-Steiner分级分级级；级；C：Edmonson-Steiner分级分级级；级；D：Edmonson-Steiner分级分级级；级；E：Edmonson-Steiner分级分级级；级；F：镜下静脉浸润，箭头所示。：镜下静脉浸润，箭头所示。A AB BC CD DE EF F第23页，共28页。第24页，共28页。第四章第四章 讨论讨论 我们采用逆转录聚合酶链反应（我们采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法
25、，检测了）方法，检测了32例肝癌组织及例肝癌组织及32例对应的癌旁组织中的例对应的癌旁组织中的HLJ1基因的基因的mRNA表达表达水平。水平。RT-PCR结果显示结果显示HCC组织中组织中HLJ1 mRNA的表达水平为的表达水平为1.18 0.82，PLCT中中HLJ1 mRNA的表达水平为的表达水平为1.92 1.15，两者间存在显著性差异，两者间存在显著性差异，HCC组织中组织中HLJ1 mRNA表达水平显著表达水平显著下调（下调（P 0.05）。）。Tsai等运用等运用RT-PCR法测量法测量HLJ1在在71例非小例非小细胞肺癌病人的癌与癌旁组织中的表达，亦发现细胞肺癌病人的癌与癌旁组织
26、中的表达，亦发现HLJ1在癌组织在癌组织中的表达低于癌旁组织，这与我们的研究结果一致中的表达低于癌旁组织，这与我们的研究结果一致22。研究证。研究证实，在实，在HLJ1基因里有一个能驱动其转录活性的区域，序列分析基因里有一个能驱动其转录活性的区域，序列分析显示此区缺失显示此区缺失TATA盒，存在一个盒，存在一个CCAAT盒，并有四个转录因盒，并有四个转录因子子YY1（Yin-Yang-1，又称，又称NF-E1）的结合位点，这也许对调控）的结合位点，这也许对调控HLJ1的表达是重要的，转录因子的表达是重要的，转录因子YY1能够增强能够增强HLJ1启动子活性，启动子活性，过表达过表达YY1能增加能
27、增加HLJ1的表达的表达23。HLJ1基因在肝癌组织中下调基因在肝癌组织中下调表达，亦可能是通过转录因子表达，亦可能是通过转录因子YY1的转录调控所致，这有待于的转录调控所致，这有待于进一步的深入研究。进一步的深入研究。第25页，共28页。HCC的侵袭转移是一个多因素和多步骤的过程，其本身的侵袭转移是一个多因素和多步骤的过程，其本身的各种生物学特性，比如细胞分化程度和静脉浸润等也决定的各种生物学特性，比如细胞分化程度和静脉浸润等也决定了侵袭转移潜能的不同了侵袭转移潜能的不同24-30。因此，我们分析了。因此，我们分析了HLJ1 mRNA表达水平与表达水平与HCC临床病理特征之间的关系，探讨其临
28、床病理特征之间的关系，探讨其可能的生物学意义。本研究中我们观察到可能的生物学意义。本研究中我们观察到HLJ1 mRNA在在分化程度高的分化程度高的HCC中表达要高于分化低者（中表达要高于分化低者（P=0.010），），在无静脉浸润的在无静脉浸润的HCC中表达要高于有静脉浸润者（中表达要高于有静脉浸润者（P=0.001）。肿瘤细胞的分化程度是判断）。肿瘤细胞的分化程度是判断HCC恶性程度的标恶性程度的标准准21，其分化程度越高，肿瘤细胞的形态和功能越接近，其分化程度越高，肿瘤细胞的形态和功能越接近正常组织，其恶性表现也就越低，表现为肿瘤的侵袭力正常组织，其恶性表现也就越低，表现为肿瘤的侵袭力和转
29、移潜能显著降低。和转移潜能显著降低。HCC的静脉浸润与的静脉浸润与HCC的血行转的血行转移密切相关，也是移密切相关，也是HCC恶性程度高，侵袭转移能力强的恶性程度高，侵袭转移能力强的表现表现24。第26页，共28页。HLJ1基因可能参与了肝癌的发生发展，并可能在基因可能参与了肝癌的发生发展，并可能在肝癌细胞分化、侵袭转移中发挥重要作用。肝癌细胞分化、侵袭转移中发挥重要作用。Tsai等等22研研究证实，低侵袭性肺腺癌中的究证实，低侵袭性肺腺癌中的HLJ1的的mRNA表达表达水平比高侵袭性肺腺癌高。实时定量水平比高侵袭性肺腺癌高。实时定量PCR测量发现，测量发现，低侵袭性肺腺癌中的低侵袭性肺腺癌中
30、的HLJ1的的mRNA表达水平是高表达水平是高侵袭性肺腺癌中的八倍。进一步研究证实，侵袭性肺腺癌中的八倍。进一步研究证实，HLJ1是一个转移抑制因子，是一个转移抑制因子，HLJ1的表达水平跟肺癌细的表达水平跟肺癌细胞的侵袭能力负相关，过表达胞的侵袭能力负相关，过表达HLJ1能抑制肺癌细能抑制肺癌细胞的侵袭力胞的侵袭力20。第27页，共28页。本研究结果提示，本研究结果提示，HLJ1下调参与了肝细胞癌下调参与了肝细胞癌的发生发展，的发生发展，HLJ1有可能成为有可能成为HCC发生发展过程发生发展过程中的重要的基因靶点，本研究为早期诊断治疗肝癌，中的重要的基因靶点，本研究为早期诊断治疗肝癌，判断肝癌预后，实行针对患者个体生物学特点的治判断肝癌预后，实行针对患者个体生物学特点的治疗提供理论依据。疗提供理论依据。第28页，共28页。
