1、动物细胞培养动物细胞融合动物细胞核移植基础克隆猴中中和华华概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。原理：动物细胞培养培养对象：细胞增殖（有丝分裂）动物组织的选择幼龄动物或老龄动物幼龄个体的细胞分化程度低、分裂能力强，易培养。动物体组 织单个细胞取出分散需要哪些条件呢？适宜条件细胞生长和增殖1、营养：由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，通常需加入血清和血浆等一些天然成分。成分：将细胞所需的上述营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。培养细胞动物时一般使用液体培养基，也称培养
2、液2.无菌、无毒的环境如果要防止培养过程中微生物的污染，还可以在细胞培养液中添加一定量的抗生素。需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理在无菌环境下操作培养液还需要定期更换（以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害）3.温度、pH和渗透压一般与动物体内相同适宜的温度：适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为 。7.2-7.4适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。哺乳动物细胞培养的温度多以 为宜。36.50.54.气体环境气体的组成及作用95%空气5%CO2培养装置:培养皿或松盖培养瓶CO2培养箱置于维持培养液的pH细胞代谢所必需可以用胃蛋白酶处理吗？不可以，pH不适宜。用胰蛋白酶、
3、胶原蛋白酶等处理，去掉组织间蛋白，将组织分散成单个细胞动物组织处理后的初次培养当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。取动物组织制成细胞悬液放入CO2培养箱中培养转入培养液进行原代培养体外培养的动物细胞悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁生长类：（大多数）除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象。动物细胞培养的过程一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。原因：a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
4、保证细胞所需的营养物质的供应及有害产物的及时排出。分瓶后的细胞培养取动物组织制成细胞悬液放入CO2培养箱中培养转入培养液进行原代培养放入CO2培养箱中培养传代培养悬浮生长类：直接用离心法收集贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件适宜条件分瓶培养传代培养思考1.什么样的动物材料更容易成功呢？原因:细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官（细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养）动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养
5、瓶在适宜条件适宜条件分瓶培养传代培养机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理思考2.用什么方法可以将动物组织块分散成单个细胞？动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件适宜条件分瓶培养传代培养思考3.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？说明细胞间的物质主要是蛋白质。说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜胃蛋白酶作用的适宜pH约为约为2，当，当pH大于大于6时，胃蛋时，胃蛋白酶就失去活性，白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜多数动物细胞培养的适宜pH为为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋，胃蛋白酶在此环境中没有活
6、性，所以用胃蛋白酶不行白酶不行。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件适宜条件分瓶培养传代培养思考4.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜 条件适宜条件分瓶培养传代培养思考5：体外培养动物细胞分为哪两类？悬浮生长细胞：细胞能够悬浮在培养液中生长増殖贴壁生长细胞细胞需要贴
7、附于某些基质（如培养瓶壁）表面才能增殖（主要类型）动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜 条件适宜条件分瓶培养传代培养思考6：为什么要将动物组织块分散成单个细胞，制成细 胞悬液？a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在 一起，彼此限制了生长和增殖；b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。保证细胞所需的营养物质的供应及有害产物的及时排出。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜 条件适宜条件分瓶培养传代培养细胞贴壁：某些细胞需要贴附于某些基质表面才能增殖，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，
8、细胞停止分裂增殖的现象。思考：思考：“细胞增殖到互相接触的时候，细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白糖蛋白识别了这识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象象”试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。象，并阐述原因。癌细胞；癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少肿瘤细胞失去接触抑制，条件适宜在培养液可以肿瘤细胞失去接触抑制，条件适宜在培养液可以无限增殖下去。无限增殖下去。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件
9、适宜条件分瓶培养传代培养原代培养 将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。传代培养将分瓶后的细胞培养称为传代培养。动物组织块分散成单个细胞加培养液细胞悬液原代培养放入培养瓶在适宜条件适宜条件分瓶培养传代培养思考思考7 7.为什么要进行分瓶培养？为什么要进行分瓶培养？悬浮生长贴壁生长(大多数）细胞密度过大有害代谢物积累培养中营养物质缺乏接触抑制细胞分裂受阻思考8:进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？离心法收集胰蛋白酶处理制成细胞悬液分瓶培养悬浮细胞贴壁细胞原理培养基性质培养基特有成分培养过程培养结果培养目的获得细胞 及代谢产物细胞的全能性动物细胞群完整植株快速繁殖、培
10、育无病毒植株等葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素液体培养基固体培养基细胞增殖2.动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？脱分化、再分化原代培养、传代培养(2021浙江浙江1月选考月选考)下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是正确的是 ()A步骤步骤的操作不需要在无菌环境中进行的操作不需要在无菌环境中进行B步骤步骤中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离C步骤步骤到到的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理D步骤步骤培养过程中不会发生细胞转化培养过程中不会发生细胞转化解析：解析：步骤步骤和细
11、胞培养过程都需要在无菌环境中进行，和细胞培养过程都需要在无菌环境中进行，A错误；步骤错误；步骤需要胰蛋白酶处理使细胞分离，盐酸会杀死细胞，需要胰蛋白酶处理使细胞分离，盐酸会杀死细胞，B错误；步骤错误；步骤传代培养传代培养过程中，细胞的形态和功能可能会发生变化，从而使细胞发生转化，过程中，细胞的形态和功能可能会发生变化，从而使细胞发生转化，D错误。错误。答案：答案：C在某些动物细胞培养的过程中，贴壁的细胞不一定都能增殖并形成克隆在某些动物细胞培养的过程中，贴壁的细胞不一定都能增殖并形成克隆(单个细胞繁殖形成的细胞群体单个细胞繁殖形成的细胞群体)，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的，而形成克隆
12、的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞，这一特点可用于测定动物细胞的增殖能力。大致流程如图，相关叙述细胞，这一特点可用于测定动物细胞的增殖能力。大致流程如图，相关叙述正确的是正确的是()A出现接触抑制后，细胞停止增殖出现接触抑制后，细胞停止增殖B克隆细胞与接种的细胞的遗传信息一定相同克隆细胞与接种的细胞的遗传信息一定相同C需采用固体培养基培养才能形成细胞克隆需采用固体培养基培养才能形成细胞克隆D胰蛋白酶可使细胞分散成单层，利于计数胰蛋白酶可使细胞分散成单层，利于计数2 2回答下列有关动物细胞培养的问题：回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面在动物细胞
13、培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面_时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的_。要使贴壁的。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是_。(2)人们通常将分瓶之前的细胞培养称为人们通常将分瓶之前的细胞培养称为_，将分瓶之后的细，将分瓶之后的细胞培养称为胞培养称为_。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心。在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞要怎样收集？法收集，贴壁细胞要怎样收集？_。相互接触相互接触接触抑制接触抑制胰蛋白酶胰蛋白酶(或胶原蛋白或胶原蛋白酶)原代
14、培养原代培养传代培养传代培养贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集之分散成单个细胞，然后再用离心法收集(3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是细胞不染色，原因是_。(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到_期的细胞用显微镜进行观察。期的细胞用显微镜进行观察。(5)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为给患者移植经细胞培养形成的
15、皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作机体把移植的皮肤当作_进行攻击。进行攻击。活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色，而死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色 中抗原电镜下的胚胎干细胞（照片经后电镜下的胚胎干细胞（照片经后期人工上色处理，放大约期人工上色处理，放大约15001500倍）倍）干细胞培养及其应用（1）干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞，这些细胞叫作干细胞。存在部位：干细胞存在于_、_和_等多种组织和器官中早期胚胎骨髓脐带血分类：胚胎干细胞和成体干细胞等。（1）胚胎干细胞（简称ES细胞
16、）存在：_中潜能：应用：早期胚胎 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等细胞（2）成体干细胞存在：_内种类：包括_中的_、_中的_、_中的_等；潜能：_ _发现最早、研究最多的、应用最成熟的一类成体干细胞：成体组织或器官骨髓造血干细胞神经系统神经干细胞睾丸精原干细胞一般认为，成体干细胞具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。造血干细胞：主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中干细胞应用应用：与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关正常干细胞患者体内受损的器
17、官或组织治愈疾病移植修复或替换正常造血干细胞患者体内受损的血细胞白血病造血系统、免疫系统功能障碍疾病移植修复或替换正常神经干细胞患者体内受损的神经组织治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）移植修复或替换治疗治疗诱导多能干细胞（iPS细胞）存在问题：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用作出假设：已分化的体细胞类似胚胎干细胞的一种细胞 各种类型细胞病人体内体外诱导分化移植实验：2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞（简称iPS细胞），之后用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。
18、2007年，科学家通过类似的方法成功诱导出人类的iPS细胞。科学家利用载体将特定基因导入细胞中表达，体细胞可诱导转变为iPS细胞iPS细胞的诱导及应用成纤维细胞T细胞和B细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物诱导iPS细胞治疗阿尔茨海默症治疗心血管疾病优点：诱导过程诱导过程无无须须破破坏胚胎坏胚胎；iPS细胞可以来源细胞可以来源于病人自身的体细胞，于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内将它移植回病人体内后，理论上可以后，理论上可以避免避免免疫排斥反应免疫排斥反应。干细胞应用面临的问题存在着导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用缺点：胚胎干细胞必须从胚胎中获取，但这涉及伦理
19、问题，因而限制了它在医胚胎干细胞必须从胚胎中获取，但这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用。科学家通过体外诱导成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细学上的应用。科学家通过体外诱导成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞(简称简称iPSiPS细胞细胞)。因为诱导过程无。因为诱导过程无须破坏胚胎，而且须破坏胚胎，而且iPSiPS细胞可来源于病人自身的体细胞，因此细胞可来源于病人自身的体细胞，因此iPSiPS细胞细胞的的应用前景优于胚胎干细胞。如图为应用前景优于胚胎干细胞。如图为iPSiPS细胞的获得及用其培育不同种细细胞的获得及用其培育不同种细
20、胞的示意图胞的示意图(c cMycMyc、Klf4Klf4、Sox2Sox2和和Oct3/4Oct3/4等基因与细胞的脱分化有关等基因与细胞的脱分化有关)。回答下列问题回答下列问题：(1)在对成纤维细胞进行培养时，常用胰蛋白酶处理使之分散成单个细胞，这说明细胞间的物质为_，_(填“能”或“不能”)用胃蛋白酶处理成纤维细胞，原因是_。蛋白质不能多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中失活变性(2)在培养iPS细胞的过程中，培养基中应含有细胞所需的各种营养物质，并定期更换培养液。定期更换培养液的目的是_。清除代谢物防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害(3)(3)过程过程为为iP
21、SiPS细胞提供的条件不同，分化得到的细胞不同，可知细细胞提供的条件不同，分化得到的细胞不同，可知细胞分化是胞分化是_的的结果。若结果。若iPSiPS细胞来源于病人自身体细胞的细胞来源于病人自身体细胞的诱导，再将其分化出的细胞移入患者诱导，再将其分化出的细胞移入患者体体内的内的优势是优势是_。基因选择性表达基因选择性表达(4)(4)如果诱导如果诱导iPSiPS细胞定向分化为细胞定向分化为原始生殖细胞，该技术可能的应原始生殖细胞，该技术可能的应用是用是_。解决不育问题解决不育问题避免了免疫排斥问题避免了免疫排斥问题考点三 动物细胞融合技术与单克隆抗体一、动物细胞融合技术1、定义：指两个或多个动物
22、细胞结合形成一个细胞的技术。2、原理：细胞膜的流动性诱导 融合3、结果：融合形成杂交细胞具有原来两个细胞的遗传信息4、融合方法：诱导 融合与植物原生质体融合的方法相同物理方法：电融合法、离心法化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法生物方法：灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有）【问题1】灭活病毒诱导细胞融合的原理（1）灭活：（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。动物细胞融合完成的标志？细胞核的
23、融合【问题2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。诱导 融合5.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒
24、诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏反复注射动物体内抗原 多种浆细胞多种抗体（血清）每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体体内产生的特异性抗体多达百万种缺点单克隆抗体技术1.机体通过什么免疫过程分泌抗体？体液免疫2.抗体主要分布在哪里？血清3.早期获得抗体的方法有哪些单克隆抗体的制备过程注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。
25、PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法思考：不注射抗原，直接提取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，能得到单克隆抗体吗？给小鼠注射特定抗原的目的是什么？能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。不能若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞（杂交瘤细胞）多种杂交细胞杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)第一次筛选用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？培养基中加入氨基蝶呤。资料分析：资料分析：a.a.细胞合成细胞合成DNADNA有有D
26、 D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被氨途径能被氨基蝶呤阻断。基蝶呤阻断。b.b.免疫的免疫的B B淋巴细胞中有这两种淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。它不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。c.c.鼠骨髓瘤细胞中只有鼠骨髓瘤细胞中只有D D途径，没有途径，没有S S途径，但它能途径，但它能不断分裂增殖。如果它的不断分裂增殖。如果它的D D途径被阻断的话，它会途径被阻断的话，它会因不能合成因不能合成DNADNA而死。而死。第二次筛选克隆化培养、抗体检测经多次筛选能产生所需抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞(既能迅
27、速大量增殖，又能产生抗体)抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）克隆化培养、抗体检测多孔细胞培养板96孔板每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。检测原理？抗原抗体杂交技术将杂交瘤细胞群稀释，将杂交瘤细胞群稀释，约每孔约每孔1个进行培养（克隆化培养）个进行培养（克隆化培养）一段时间后，一
28、段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）（抗原抗体能结合即为阳性孔）经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）AB1、AB2、AB3 多孔细胞培养板多孔细胞培养板第二次筛选：筛选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞第二次筛选：筛选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞方法：克隆化培养和专一抗体检测多孔细胞培养板抗体检测板抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔内体内培养细胞培
29、养液提取小鼠腹水中提取特异性强，灵敏度高，可大量制备单克隆抗体易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低，规模小，产量少需要人为控制培养条件，成本相对较高单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因筛选目的 筛选出？筛选出 的杂交瘤细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞能分泌所需抗体死亡抗体检测生长诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞
30、等由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞注射特定蛋白免疫小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞选择培养基克隆化培养专一抗体检测注射到小鼠腹腔内增殖体外培养单克隆抗体诱导融合单克隆抗体小结动物细胞融合动物细胞培养筛选一筛选二多次筛选特异性强、灵敏度高、可大量制备细胞增殖细胞膜具有流动性既能大量繁殖又能产生专一抗体（1）第一次筛选的目的：（2）如何筛选：（3）筛选原理：（4）杂交瘤细胞的特点：（5）第二次筛选的目的：（6）如何筛选：筛选获得杂交瘤细胞 在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具
31、有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长单克隆抗体及其应用获得足够数量的能分泌所需抗体杂交瘤细胞 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）（7）选择抗体检测呈_性的杂交瘤 细胞，即_（8）抗体检测原理_阳分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞（10）如何获取单克隆抗体体外培养_小鼠腹腔内培养_（11）单克隆抗体的优点在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异
32、性结合，并且可以大量制备单克隆抗体的优点（1）能准确地识别抗原的细微差异；（2）与特定抗原发生特异性结合；（3）可以大量制备。单克隆抗体的应用（1）广泛用作诊断试剂利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。乙肝测定试剂艾滋病检测试剂（2）运载药物：如抗体-药物偶联物（ADC）。生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤(单抗导向，药物为弹头)优点：位置准确、疗效高、副作用小（3）直接用于治疗疾病。实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补
33、体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。资料使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。问题：但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害解决方法：抗体一药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。抗体药物接头单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC抗体药物接头ADC被细胞吞噬释放药物溶酶体裂解细胞凋亡用于疾病的治疗和运载药物(主要用于癌症的治疗)生物导弹单克隆抗体抗癌药物(放射性
34、同位素/细胞毒素）单克隆抗体：(1).特异性强、灵敏度高 生物导弹单抗抗癌药物原理：组成：(2).疗效高、毒副作用小：不损伤正常细胞 ，减少剂量导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置抗癌药物：杀死癌细胞下列有关动物细胞融合和植物细胞融合的说法，正确下列有关动物细胞融合和植物细胞融合的说法，正确的是的是()A都可以用灭活的病毒促进细胞融合都可以用灭活的病毒促进细胞融合B细胞融合前都要先制备原生质体细胞融合前都要先制备原生质体C依据的原理都是细胞的全能性依据的原理都是细胞的全能性D都能够使远缘杂交成为可能都能够使远缘杂交成为可能新冠病毒表面的刺突蛋白可特异性结合宿主细胞上的受体新冠病毒表面的刺突蛋
35、白可特异性结合宿主细胞上的受体CD147，从，从而介导新冠病毒入侵宿主细胞。研究人员制备了针对刺突蛋白的单克隆抗而介导新冠病毒入侵宿主细胞。研究人员制备了针对刺突蛋白的单克隆抗体，该抗体可结合刺突蛋白，从而阻断新冠病毒刺突蛋白与体，该抗体可结合刺突蛋白，从而阻断新冠病毒刺突蛋白与CD147的结的结合，阻止病毒继续感染新的细胞。下列说法正确的是合，阻止病毒继续感染新的细胞。下列说法正确的是()A新冠病毒入侵人体后可刺激浆细胞增殖，促进其分泌抗体新冠病毒入侵人体后可刺激浆细胞增殖，促进其分泌抗体BB淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，至少要经过淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，至少要经过1次选择才能够得到次选择
36、才能够得到专门分泌抗刺突蛋白抗体的杂交瘤细胞专门分泌抗刺突蛋白抗体的杂交瘤细胞C需将杂交瘤细胞置于含需将杂交瘤细胞置于含5%空气和空气和95%二氧化碳混合气体的二氧化碳混合气体的CO2培培养箱中培养养箱中培养D可借助单克隆抗体的导向作用，在单克隆抗体上连接抗新冠病毒可借助单克隆抗体的导向作用，在单克隆抗体上连接抗新冠病毒的药物制成生物导弹的药物制成生物导弹(2020全国卷全国卷)为研制抗病毒为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：回答下列问题：(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒上述实验前必
37、须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是，该处理的目的是_。诱导小鼠甲诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒产生能够分泌抗病毒A抗体的抗体的B淋巴细胞淋巴细胞(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_。(3)为了得到能产生抗病毒为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选选。图中筛选1所采用的培养基属于所采用的培养基属于_，使用该培养基进行细胞，使用该培养基进行细胞培养的结果是培养的结果是_。图中筛选。图中筛选2含多次筛选，筛选所含多次筛选，筛选所依据的基本原理是依据的基本
38、原理是_。取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液成单细胞悬液 选择培养基选择培养基 只有杂交瘤细胞能够生存只有杂交瘤细胞能够生存抗原与抗体的反应具有特异性抗原与抗体的反应具有特异性(4)若要使能产生抗病毒若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有用的方法有_(答出答出2点即可点即可)。将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养将杂交瘤细胞在体外培养 动物体细胞核移植技术和克隆动物动物体
39、细胞核移植技术和克隆动物考点41.定义动物细胞核移植技术是将动物一个细胞动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。发育成动物个体的技术。卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物2.原理 动物细胞核的全能性整个细胞随分化程度的提高，分化整个细胞随分化程度的提高，分化潜能逐渐减弱，全能性受到限制。潜能逐渐减弱，全能性受到限制。3.分类胚胎细胞核移植卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物体细胞核移植分化程度低，表现
40、全能性容易分化程度高，表现全能性困难4.生殖方式无性生殖因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植如：多莉羊体细胞核移植的过程以体细胞克隆牛为例从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞(研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞)，在体外培养到M期高产奶牛(供体)从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行细胞培养通过显微操作去核将供体细胞注射入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚胎将胚胎移入受体(代孕)母牛体内出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛1.选择M中期的卵母细胞的原因从屠宰场收集牛卵巢，采集卵母细胞(研究人员正在使用设备从牛的卵巢采集卵母细胞)
41、，在体外培养到M期卵母细胞的细胞质内存在激卵母细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。发细胞核全能性表达的物质。卵母细胞体积大，便于操作。卵母细胞体积大，便于操作。卵母细胞内卵黄多，营养卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富物质丰富2.供体细胞的选择和培养从供体高产奶牛身体的某一部位(如耳)上取体细胞，进行细胞培养一般选用传代一般选用传代1010代以内的细胞，代以内的细胞，因为因为1010代以内的细胞一般能保持代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。细胞正常的遗传基础。高产奶牛(供体)3.卵母细胞去核（1）卵母细胞去核的原因是什么？保证克
42、隆动物的遗传物质最大限度保证克隆动物的遗传物质最大限度来自优良供体。来自优良供体。（2）卵母细胞去核的方法显微操作去核法显微操作去核法使DNA变性失活，达到去核的目的。没有刺破卵母细胞膜对卵母细胞伤害小。梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理通过显微操作去核(3)“去核”去的是什么？纺锤体纺锤体-染色体复合物染色体复合物4.供体核移植到去核卵母细胞将供体细胞注射入将供体细胞注射入去核的卵母细胞去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞融合，供体通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚胎核进入卵母细胞，形成重构胚胎重构胚胎：人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。重构胚胎：人工重
43、新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。将供体细胞整个注入去核卵母细胞中的原因：对卵母细胞损伤较小；对卵母细胞损伤较小；保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。5.重构胚胎的激活、胚胎移植将胚胎移入受体(代孕)母牛体内用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。6.分娩获得克隆动物将胚胎移入受体(代孕)母牛体内出生与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 新生个体的细胞质基因一部分来自去核卵母细胞，一般分来自供体细胞。克隆动物不是核供体动物100%复制的原因是什么？克隆动物的细胞质遗传物质来自受克
44、隆动物的细胞质遗传物质来自受体卵母细胞的细胞质体卵母细胞的细胞质生物的性状不仅与遗传物质有关，生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境等因素的影响还受环境等因素的影响卵母细胞动物细胞取核去核移入重组细胞发育新胚胎发育克隆动物思考讨论早早期期胚胚胎胎培培养养动动物物细细胞胞培培养养胚胚胎胎移移植植动动物物细细胞胞融融合合重构胚重构胚早期胚胎早期胚胎通过通过电融合法电融合法使两细胞融使两细胞融合，供体核进入卵母细胞合，供体核进入卵母细胞用用物理或化学方法激物理或化学方法激活重构胚活重构胚，使其完成，使其完成细胞分裂和发育细胞分裂和发育过程过程将将胚胎移入受体胚胎移入受体（代孕）母牛体内（代孕）母牛体
45、内采集牛卵巢中的采集牛卵巢中的卵母细胞，在体卵母细胞，在体外培养到外培养到MM期期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞培养供体细胞培养将将供体细胞注入供体细胞注入去核的卵母细胞去核的卵母细胞通过通过显微显微操作操作去核去核高产奶牛高产奶牛（供体供体）从供体身体的某从供体身体的某一部位（如耳）一部位（如耳）上取上取体细胞体细胞生出生出与供体奶牛遗传与供体奶牛遗传物质基本相同物质基本相同的犊牛的犊牛动动物物细细胞胞核核移移植植1.1.该过程中应用到的技术该过程中应用到的技术_动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞培养动物细胞培养早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植知识点总结动物细胞融合动物细胞融
46、合2.采集的卵母细胞应培养至_3.选择M期卵母细胞的原因_ _4.卵母细胞去核的方法_5.“去核”去的是什么？_MM期（减数分裂期（减数分裂中期）中期）含有促进细胞核表现全能性的物质和营养条件细胞体积大，易于操作显微操作（去核）法去除的为纺锤体去除的为纺锤体-染色体复合物染色体复合物*去核时，由于去核时，由于MM期卵母细胞核的位置靠近第期卵母细胞核的位置靠近第一极体，用微型吸管一极体，用微型吸管一般一般一并吸出第一极体一并吸出第一极体6.去核的原因_7.供体细胞注入卵母细胞的优点 _8.诱导融合的方法9.融合的结果10.重构胚概念_使核移植得到的胚胎或动物核内遗传物质全部来自有重要利用价值的动
47、物对卵母细胞损伤较小*直接将供体细胞注入去核卵母细胞的透明带内电融合法供体核进入卵母细胞，形成重构胚人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力11.激活重构胚的方法物理方法 _化学方法 _12.以上方法处理重构胚的目的 _13.该技术证明_电刺激电刺激CaCa2+2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂激活重构胚，使其完成细激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程胞分裂和发育过程证明了动物已分化的体细胞证明了动物已分化的体细胞的细胞核具有全能性的细胞核具有全能性应用前景加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。快速、大量“复制”优良家 畜,加速品种改良。传统的杂交育种存在费时
48、、费力、成功率低的弊端,要得到一个优良品种往往要耗费几十年时间,且对于牛这样 的单胎动物还会遇到很大的困难。畜牧生产方面乳腺生物反应器通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白。医药卫生方面治疗人类疾病方面a.转基因克隆动物的细胞、组织和器官用于异种器官移植b.以患者为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者可以避免发生免疫排斥反应。治疗性克隆治疗性克隆与iPS细胞治疗病人取核去核卵母细胞重构胚胎各种细胞组织或器官诱导取出体细胞核移植移植成纤维细胞取出转入相关因子iPS细胞各种细胞组织
49、或器官胚胎干细胞取出诱导移植治疗性克隆iPS细胞治疗细胞发生转化科学研究方面a.研究克隆动物可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程b.克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因c.克隆特定疾病模型的动物，为研究该疾病的致病机理和开发相应药物提供帮助。保护濒危物种方面通过克隆技术，增加濒危物种的存活数量。可以快速繁育濒危野生动物,尤其是近年来发展起来的异种核移植技术,可使操作不受受体来源的限制,有望解决大熊猫等珍贵野生动物的保护问题。黑草黄弄蝶白鳍豚金丝猴存在问题(1)成功率非常低在进行克隆羊多莉的实验中，科学家当时一共培育了277个胚胎，最后只有多利成功出生。体细胞克隆技
50、术的低成功率，一直到现在也没有明显改善。克隆技术各个环节有待于进一步改进，相对于技术研究，核移植的理论研究较为滞后。(2)克隆动物存在健康问题许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷和免疫失调等。克隆羊多莉没过多久(6岁半)就产生了严重的疾病，由于病情来得实在太突然，难以救治，最终在2003年不得不将多利羊进行安乐死。按照普通绵羊的正常寿命为12岁来算的话，这只克隆羊还是比较年轻的，存在问题(2021辽宁选择性考试辽宁选择性考试)下图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的下图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，有关叙述正确的是简易流程图，有关叙述正确
