1、 1ppt课件 制定依据医疗机构临床实验室管理办法（卫医发200673号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）医学实验室质量和能力认可准则 ISO15189(CNAS-CL02:2012)医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明 （CNAS-CL36:2012）医学实验室质量和能力认可准则在组织病理学检查领域的应用说明 （CNAS-CL37：2012）2ppt课件基本内容质量管理体系建立人员实验室设置、设施和环境设备、材料与信息系统分析前分析中分析后3ppt课件质量管理体系建立质量手册、程序文件、操作规程、记录 l现行有效l适合自身实际情况l写你所做
2、的、做你所写的、记你所做的 4ppt课件文件至少应包括组织和人员管理：各类人员的岗位职责、岗位培训、继续教育、定期考核、评估等环境、设施及安全管理文件或程序仪器、设备采购、验收、管理、领用及使用的文件或程序检验试剂及耗材的采购、验收、管理、领用及使用样品的采集、运送、接收、处理及保存检验方法的选择、确认或验证5ppt课件检验项目及仪器设备标准操作程序的建立和管理检验结果质量保证检验报告管理的规定：结果的发放方式、报告的格式和内容、保护患者隐私的规定记录的管理：记录的修改。保存及期限对差错事故及不符合工作的纠正及预防措施对服务对象投诉处理6ppt课件 人员要求实验室至少应有2名取得PCR上岗证，
3、并为本单位在职技术人员实验室负责人应具有中级或以上专业技术任职资格开展遗传性疾病基因芯片诊断技术或基于组织等分子病理检测技术并出具诊断报告的实验室，还应具备至少2名取得医师执业证书、主治医师或以上专业技术、从事本专业的本单位在职医师 7ppt课件实验室有培训制度、计划，保证其技术人员得到及时培训，并对培训效果进行评估 实验室应定期评审员工的工作能力，保存评审记录 实验室应分册建立技术人员技术档案，档案至少应包括以下内容:学历、职称、上岗证书复印件；培训、能力评审等资料，并定期更新 8ppt课件人员培训、能力评估能力评估方式可有：直接观察常规工作过程和程序，包括所有使用的安全操作、直 接观察设备
4、维护和功能检查、监控检验结果的记录和报告过程、核查工作记录（实验室原始记录、质控记录、定标记录、试剂、使用记录、仪器保养维护记录、仪器维修记录等）、评估解决问题的技能、使用特殊材料执行一个给定程序（盲样检测、留样再测）培训方法可有：讲座（包括小组教学）、计算机相关的练习、自学、观看示例-现场或视频、实践监督、实践结果的自我评估、特殊样品的检验或鉴定 培训效果考核方式：口头提问、笔试、现场操作演示、获取合格证、填写培训 小结等 培训记录至少包括：培训通知、培训课件、培训照片、签到表、效果评价证据9ppt课件 实验室设置原则上应分为四个区：试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区如使用全自动扩增
5、分析仪，后两区可合并如使用核酸提取、扩增和产物分析一体化的全自动分析系统，后三区可合并各区有独立的缓冲区各区都有水池 各区有独立的通风系统（建议有窗户的房间为PCR实验室），标本制备区有冲眼器和生物安全柜高通量测序实验室分区 原则：工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时10ppt课件 设施和环境 实验室有足够的空间保证：标本处置符合分析前、后样本分区放置、仪器放置符合维修和操作要求、打印检验报告时交叉污染的控制 标本接收区建议放在四个区域以外的房间开展基于组织的分子病理项目宜有独立的切片制备和前处理（脱蜡、水化）区域 11ppt课件设施和环境进入和使用实验室各区域应有明确的限制和措施，防止患者
6、和其他非相关人员的随意进出 各工作区域应有明确的标记，应按照单一方向进入各工作区域，不同区域内的设备、物品不得混用 实验室应规定环境温、湿度的要求，实施监控，并有记录 应有指定的经过培训的内务管理人员（如保洁人员），有相应清洁用具，有实验室清洁和消毒相关的记录 12ppt课件 产物分析区 扩增区 标本制备区 试剂准备区 缓冲间基本原则：基本原则：1 1、四个区域必须相互独立、四个区域必须相互独立 2 2、各区不能直通，应有缓冲间、各区不能直通，应有缓冲间 3 3、各区有独立通风系统、各区有独立通风系统13ppt课件设备、材料与信息系统使用的仪器、试剂、耗材、辅助品必须符合国家相关规定。仪器：必
7、须三证齐全 试剂：必须CFDA批准相同检验项目在不同仪器或系统上进行检测时，须对检验结果进行比对(2次/年，每次至少20份标本，计算回归方程，系统误差应7.5%）14ppt课件应保存主要设备的档案，档案内容应包括：设备标识、型号、序号或其它唯一性识别、到货日期和投入运行日期、目前放置地点、接收时的状态、仪器使用说明书或其存放处、证实设备可以使用的设备验证报告、校准和/或检定报告、维护、损坏、故障或维修的记录应制定各类仪器维护保养，校准/检定计划，并有执行记录。15ppt课件仪器校准需校准仪器：温度计、温湿度计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪、测序仪；开展分子病理
8、项目需校准切片机（包括冰冻切片机）、捞片水浴槽校准单位资质合格的校准/检定报告校准周期：参照国家计量部门或生产厂商的要求进行，厂家没有规定的则每年至少进行一次 内部校准的辅助设备，实验室应根据国家计量部门或生产厂商的规定制定内部校准操作规程和要求，并有内部校准的详细记录校准/检定设备，应贴校准/检定标识，并标明下次校准/检定日期16ppt课件 扩增仪维护：75%乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔 用无水乙醇清洁光路部分校准：校准单位：厂家 校准周期：定期校准、仪器搬动 校准参数：光路部分、背景荧光、温控部分（温度准确度、均一性、温度升降速率）17ppt课件恒温金属浴维护：75%乙醇擦拭加热孔校准：校
9、准单位：厂家、计量院、内部校准 温度准确度（1）（应涵盖试验过程中所涉及的温度）孔间温度的均一性（1）（内部校准应规定测定孔的选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）18ppt课件移液器维护：75%乙醇擦拭校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、校准量程（应涵盖试验过程中所涉及的量程）计量性能要求（容量允许误差、测量重复性）内部校准-参照定量、可调移液器试行检定规程(JJG646-2006)注意：环境的要求 计量性能要求（标称容量、标定点、容量允许 误差、测量重复性）校准点涵盖试验过程中所涉及的量程19ppt课件生物安全柜清洁:75%乙醇擦拭,不宜用次氯酸钠溶液清洁检定：有资质的第三方检测机构检定
10、参数：高效过滤器完整性、流入气流流速、下降气流流速、气流模式 20ppt课件高速冷冻离心机维护保养：75%乙醇擦拭校准：转速、温度21ppt课件设备出现故障时处理措施应立即停止使用，并加上明显标识 修复的设备如影响方法性能，必须经校准、检定（验证）或检测满足要求后方能再次投入使用 可校准的项目实施校准质控品检测结果在允许范围内与其他仪器的检测结果比较（5个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏移7.5%）使用留样再测结果进行判别(5个样本，覆盖测量范围，至少4个样本测量结果偏移7.5%）实验室应检查由于上述缺陷对以前所进行的检测工作的影响，并记录相关分析、处理意见 22ppt课件耗材、试剂
11、要求耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检 1 1、定性：阴性标本、弱、定性：阴性标本、弱 阳性标本阳性标本,结果符合结果符合 2 2、定量：、定量：5 5份临床样本（覆盖测量范围），至少份临床样本（覆盖测量范围），至少4 4个样本测量个样本测量 结果偏移结果偏移 7.5%7.5%试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检 更换试剂批号：试剂批间差，应评价核酸提取效率和扩增效率 1 1、定性：阴性标本、弱、定性：阴性标本、弱 阳性标本阳性标本,结果符合结果符合 2 2、定量：、定量：5 5份临床样本（覆盖测量范围），至少份临床样本（覆盖测量范围），至少4 4个样本测量个样本测量 结结 果偏移果偏移
12、 90%。符合率可采用下列方法之一 a、标准血清盘 b、临床诊断明确的阴性和阳性样本各10份 c、与公认或主流方法比对38ppt课件 室内质量控制目的 监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性凡出具临床检测报告的项目均应开展室内质控39ppt课件质控品来源及使用来源:第三方、试剂盒自带、自制使用:1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量 2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确 3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇 4）避免反复冻融 5）室内质控应监控核酸提取、扩增、产物分析等标本检测全过程 40ppt课件质控
13、品设置、数量 定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染 翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染 定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本
14、相同）41ppt课件 质控品位置室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。42ppt课件质控品均值建立暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以
15、最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均值。43ppt课件常用质控规则的符号及定义符 号 定 义 12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间 的差值超出4s控制限。41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。10X 十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。44ppt课件统计质控方法Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合W
16、estgard多规则质控方法“即刻法”质控方法 45ppt课件 Levey-Jennings质控图方法46ppt课件 x47ppt课件48ppt课件49ppt课件50ppt课件51ppt课件52ppt课件53ppt课件 54ppt课件55ppt课件l 56ppt课件57ppt课件。XX58ppt课件X10X1059ppt课件“即刻法”质控方法 只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。将连续的质控测定值按从小到大排列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1为最小值，xn为最大值）；计算均值和标准差(s);按下述公式计算SI上限和SI下限值；SI上限=（x最大值 均值）/s SI
17、下限=（均值 x最小值）/s将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。60ppt课件 SI值表 n n3s n2s n n3s n2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.5661ppt课
18、件质控结果的判断SI上限和SI下限值均 n n3s3s对应的值时，说明该质控测定值的变化已超出3s，属“失控”。62ppt课件即刻法优缺点优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控缺点：繁琐 初始阶段的质控数据，前3个质控值的CV对随后的结果影响大。63ppt课件临床基因扩增检验室内质量控制操作前20个数据使用即刻法，可对第320个数据进行质控判断第21个数据开始使用常规质控方法进行质控判断64ppt课件 失控处理及时查找原因，采取纠正措施填写失控原因分析报告相关负责人决定报告是否可发放65ppt课件失控原因分析阳性质控样本常见的失控原因核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的
19、去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。66ppt课件失控原因分析阴性质控样本的失控原因扩增产物的“污染”临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”.67ppt课件避免基因扩增检验假阳性结果的措施严格的实验室分区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。68ppt
20、课件避免基因扩增检验假阴性结果的措施避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准69ppt课件注意事项在试剂准备区配置反应混合液，先将dNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再分装；配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含UNG的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心
21、后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心70ppt课件注意事项吸弃上清提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放；将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。扩增条件一致的
22、不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理；工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁71ppt课件结果判断在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。基线值（阈值）设定：遵从厂商规定72ppt课件实验结果有效性判断标准标准曲线平滑均匀，相关系数、内参等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效。73ppt课件实验灰区标
23、本的处理定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。复星CT：38Ct值40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct40判断为阳性，否则判为阴性。达安CT:ABI7000：27Ct值30为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值30判为阳性，否则判为阴性。Roche LightCycler：37Ct40为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值40判为阳性，否则判为阴性74ppt课件组织标本的处理与质量控制均应该由有经验的病理技术人员和医师负责。如需要用显微切割法刮取组织以保证有足量的肿瘤细胞，应由病理医师审阅，标注出肿瘤细
24、胞所在区域必要时，被检基因组核酸（DNA和/或RNA）浓度应符合制造商规定的要求 扩增条件相同的不同检测项目扩增时应使用各自的标准曲线 75ppt课件 室间质评目的:监测检测结果的准确性凡出具临床检测报告的项目均应参加室间质评室间质评样本应与临床标本同等对待，及时分析室间质评反馈结果；对不合格项目，应查找原因，（人员操作误差、仪器状态、试剂、质控品质量、评价方式、分组问题等）采取纠正措施76ppt课件PCREQA评价方式:组均值3SD、组均值0.5log10 溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值0.4 77ppt课件无室间质评的检测项目应进行实验室间比对或用其他方法验证其检测结果的可靠性
25、其它方式可有：盲样检测、人员比对、与临床诊断一致性比较规定比对实验室或其他方法的选择原则、样品数量5份，覆盖测量范围、2次/年，应有80%的结果满足要求不符合项进行原因分析（人员操作误差、仪器状态、试剂、质控品质量、评价方式、分组问题等）78ppt课件 检验后质量控制检验后过程包括系统性评审，规范格式和解释，授权发布、报告和传送结果，以及保存检验样品。79ppt课件结果报告定性检测 定性检测的结果报“阴性”或“阳性”。但由于目前国内商品试剂盒的灵敏度多为500-1000IU/ml，在报告结果时应告知临床医生方法的局限性。定量检测 1）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。2）样本未出现扩
26、增曲线，则报告为“低于检测下限”，不能报告为“0”或“阴性”。如果低于检测下限，但又有扩增曲线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限”。3）结果高于检测上限，则报告“高于检测上限”，如果需要精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行100-1000倍稀释后再重新进行检测，结果乘上稀释倍数；或将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。80ppt课件 检测报告单信息检测结果的报告应准确、清晰和客观患者基本信息、标本信息（采集、送检、检测、报告时间、标本性状及类型）、检测方法、检测结果、结果解释（必要时）、其它评注（例如可能影响检测结果的原始样品的质和量）分子病理检测报告还应包括标本类
27、型、质量、肿瘤组织的含量等信息81ppt课件结果解释临床可以肺结核患者痰涂片阴性，而TB菌PCR阳性或时阴时阳，可能患者为初起病间断排菌且排菌量不大所致；或经抗结核治疗后，常有矛盾报告培养（-）、PCR（+）较多，因为只要有TB靶片段存在，PCR即可阳性，而测得阳性，不一定有活菌，加之病情与菌量不一定成正比HBV（及HCV）感染在抗病毒治疗过程中，可出现HBV-DNA(及HCV-RNA)阴转情况，有时停药后又转阳。药物是否能彻底清除病毒还要根据肝脏酶学、病毒血清学标志物及核酸结果综合考虑，仅有核酸阴转而其他指标不改变并不能证明临床痊愈另外，PCR检测结果阴性并不能排除样本含有病原体，只能说明含有的病原体浓度低于本试剂的检测下限 82ppt课件 谢谢 谢谢83ppt课件
