1、生物工业分析生物工业分析第八章高效液相色谱分析第八章高效液相色谱分析 第一节第一节基本原理基本原理 第二节第二节液相色谱操作液相色谱操作 第三节第三节应用实例应用实例 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 第一节基本原理第一节基本原理一、液相色谱过程 1流程图 高效液相色谱的流程如图8-1所示。高压泵输送流动相和试样组分高速流过色谱分离柱时，具有不同分配系数的组分在两相间经过反复多次的分配平衡时被分离，通过检测器时被检测并给出信号。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高压输液泵高压输液泵 高压泵是高效液相色谱的动力源，用来使液体流动相高速通过色谱分离柱以达到快速分析的目的。在高效液相色谱中，通常使用
2、往复式柱塞泵，结构如图82所示。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗就是流动相中含有两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，使被分离组分在两相中的分配系数改变，达到提高分离效果，调节出峰时间的目的。两种方式来实现：外梯度（也称低压梯度）和内梯度（也称高压梯度），外梯度是在常压下，按一定程序将溶剂混合后再通过高压泵输入色谱柱；内梯度是利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。进样装置进样装置 高效液相色谱是在很高的压力状态下工作的，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图83所示
3、。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高效分离柱高效分离柱 高效液相色谱的分离柱具有很高的柱效，理论塔板数达每米3万。柱体为直型不锈钢管，内径l6nm，柱长540cm。液相色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，因此柱较短。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器紫外光度检测器最小检测量可达10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。其原理是基于试样中各组分对特定波长的紫外光有选择性吸收，组分浓度与吸光度之间服从朗伯-比耳定律，因此要求在测定波长处，流动相应无明显的吸收，而被测组分应有较大的吸光系数。紫外光度检测器有固定波长和可变波长两种，
4、前者的测定波长固定（254nm或280nm），适用于芳烃化合物的检测。后者可根据试样选择测定波长，方便灵活适用面广。紫外光度检测器的光路图如图8-4所示。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 光电二极管阵列检测器，由211个（或更多）二极管组成阵列，各检测特定波长，将吸收后透过的紫外光束分光投射到二极管阵列上，用计算机快速处理，可获更多信息及显示吸光度、波长、时间三维立体谱图，如图8-5所示。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 差示折光检测器差示折光检测器的最低检测量达10-7gmL-1，对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。其原理是基于含有被测组分的流动相和纯流动相的溶液折射率之差与被测组分在流动相中
5、的浓度有关，可根据流动相折射率的变化，测定试样组份含量。高效液相色谱法还可利用其高效分离的特点，将柱后流出组分分别收集，蒸去流动相，获得难于通过一般方法制备的高纯度样品（色谱纯）。液相色谱制造技术要求高，仪器价格、操作、维护费用也相对较高，故远没有气相色谱的普及程度高。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 2高效液相色谱法的主要分离类型 （1）吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。分离原理是组分在两相间经过反复多次的吸附与解吸分配平衡。（2）分配色谱（液-液分配色谱）：早期通过在担体上徐渍一薄层固定液制备固定相，与流动相一起构成液液两相，各组分
6、在两相间分配系数的不同，经反复多次分配平衡而实现分离。现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。通常反应发生在硅胶表面的SiOH基团上，形成硅氧碳键型（Si-O-C），硅氧硅碳型（Si-O Si-C），硅碳型（Si-C）,硅氮型（Si-N）四种类型。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （3）离子交换色谱：固定相为离子交换树脂（H+或OH-），流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子因它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。（4）凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为固定相。凝胶色谱法又称凝胶渗透法、凝胶过滤法。当试样随流动相进入分离柱时，试样中的小分子扩散、
7、渗透到孔穴内部，而大分子则被排阻在孔穴之外，不同大小的分子，可通过的孔穴大小、数目不同，走过的路径和需要的时间不同，被排阻的大分子首先被流动相带出，其他不同大小的分子依次流出。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 二、色谱流出曲线试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱拄，经检测器转换为电讯号，然后用记录仪将各组分的浓度变化记录下来，即得色谱图。色谱图是以组分的浓度变化作为纵坐标，流出时间作横坐标的，这种曲线称为色谱流出曲线。三、色谱中有关术语 高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的，但有其不同之处。液相色谱法的流动
8、相为液体，气相色谱法的流动相为气体。液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一、液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍左右（见表8-1）。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 参数气体液体扩散系数 Dm/cm2s-110-110-5密度/gcm-110-31粘度/g（cms）-110-410-2表 8-1影响峰扩散的主要物理性质 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 第二节液相色谱操作第二节液相色谱操作一、操作条件的选择 在高效液相色谱中，液体流动相的分子量要比气相色谱中的气体流动相的分子量大得多，由于被测组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的分子量成反比，因此速率方程中的分子扩散项Bu较小
9、，可以忽略不计，故只有两项，即 HACu液相色谱与气相色谱两者的H-u曲线的形状不同，如图8-6所示。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （1）流速：在液相色谱中，被测组分分子在流动相中的扩散系数比气相中小45个数量级，当流速大于0.5cmsl时，H-u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流速仍是一个调整分离度和出峰时间的重要的可选择参数。（2）固定相及分离柱：气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （3）流动相及流动相的极性：液相色谱流动相的作用除与气相色谱中载气的作用相同之外，还具有调节组分与固
10、定相之间作用力大小的能力，也即溶剂效应。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。在液液色谱中，为了避免固定液的流失，一般来说，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相液液色谱法，极性柱也称为正相柱。反之，若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱，这是由于后者的出峰顺序与前者相反。对于目前常用的化学键合固定相来说，固定液的流失大大减小，流动相的选择范围则要大得多。流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式分，有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂的极性（由小到大）顺序如下：庚烷、己烷、
11、环己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丁酮、四氢呋喃、二氧六环、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酸胺、水。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择流动相时应注意下列几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝吸附剂固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器
12、时，流动相不应有紫外吸收。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 二、操作步骤与色谱的定性、定量分析操作步骤首先是进行分析中所用各种标准液、试样液、混合液等的配制及流动相的配制；二进行色谱系统的选择及有关参数的确定；三进行进样分析测定；最后是计算并出具报告。色谱的定性、定量分析高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的，虽有其不同之处即液相色谱法与气相色谱法的主要区别可归结于流动相的不同，但其常用的定性、定量分析方法与气相色谱法相同。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 第三节应用实例第三节应用实例一、青霉素含量测定 （l）0.05m
13、ol/L磷酸盐缓冲液（pH6）的配制在水900ml中溶解磷酸二氢钾6.8g，用lmol/L氢氧化钠调节PH值为6.00，用水稀释至1000ml，混匀。（2）流动相的配制将认0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH6）和乙腈按4:1混合，滤过。（3）标准液的配制精密称取青霉素钾标准品（USP Penicillin G potassium RS）约 80mg，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （4）供试液的配制按标准液同法配制（如果供试品的溶液配制栏目中没有另加说明）。（5）混合液的配制用流动相配制浓度约为lmgml的青霉素V钾溶液，与标准液等体积混合。（
14、6）色谱系统配有225nm波长紫外检测器的液相色谱仪；色谱柱为4mm30cm；填料为Packing L1（C18硅烷键合硅胶 10m）；流速为 2ml/min。分别进样混合液和标准液约10l，适当调节实验参数，使得青霉素和青霉素V钾色谱峰的柱效均不小于600理论塔板数，两峰间的分辨率不低干2.0，标准液重复进样的相对标准差不大于1.0。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （7）测定分别进样等体积（约10l）的标准液、供试液和混合液，记录相应的色谱图，测量主要峰的响应。青霉素和青霉素V钾的相对保留时间分别是0.7和1.0。按下式计算供试品中青霉素（C16H18N2O4S）的百分含量Pu：式中：Gs
15、 标准品中青霉素的百分含量；Ws 为配制标准液所用标准品的重量（mg）；Wu 为配制供试液所用供试品的重量（mg）；rs 为标准液的色谱响应；ru 为供试液的色谱响应。suussurWrWGP高效液相色谱分析高效液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注Amdinocillin4.6mm25cm,Packing L1（5m）pH5.0缓冲液（a）-乙腈（85:15）1UV220nmAmdinocillin0.1mg/ml（溶剂:水）0.1mg/ml（溶剂:水）20USP（XX）外标校正法氨苄青霉素Ampicillin4m3
16、0cm,Packing L1（5-10m）水-乙腈-lmol/L磷酸二氢钾-lmol/L醋酸（909:80:10:1）2UV254nm氨苄青霉素1mg/ml（溶液:（b）1mg/ml（溶剂:水（b）20USP（XX）外标校正法氨苄青霉素钠Ampicillin Sodium4mm30cm Packing L1（5-10m）2UV254nm氨苄青霉素1mg/ml（溶液:（b）1mg/ml（溶剂:水（b）20USP（XX）外标校正法邻氯青霉素钠Cloxacillin Sodium4.6mm25cm,Packing L1（5-10m）PH5缓冲液（c）-乙腈（75:25）1UV2250nm邻氯青霉素钠
17、1.1mg/ml（溶液:（c）1.1mg/ml（溶剂:水（c）10USP（XX）外标校正法表8-2-内酰胺类抗生素的高效液相色谱法测定 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注普鲁卡因青霉素Penicillin G Procaine4mm30cm,Packing L1（10m）PH7缓冲液（d）-乙腈-水（500:250:2501）,用lmol/L氢氧化钾或10%磷酸调节PH值为7.50.051UV235nm青霉素钾0.8mg/ml盐酸普鲁卡因0.54mg/ml（溶剂:流动相）1.4mg/ml（溶剂:
18、流动相）10USP（XX）外标校正法青霉素VPenicillin V4mm3cm,Packing L1（5-10m）水-乙腈-冰醋酸（650:350:5.75）1UV254nm青霉素V钾2.5mg/ml（溶剂:流动相）2.5mg/ml（溶剂:流动相）10USP（XX）外标校正法青霉素V钾Penicillin V Potassium4mm30cm,Packing L1（5-10m）水-乙腈-冰醋酸（650:350:5.75）1UV254nm青霉素V钾2.5mg/ml（溶剂:流动相）2.5mg/ml（溶剂:流动相）10USP（XX）外标校正法高效液相色谱分析高效液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料
19、流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注 哌拉西林PiperacillinC18硅烷键合硅胶甲醇-0.2mol/L磷酸氢钠液-10%氢氧化四乙基铵液-水（400:50:3:547），用磷酸调节pH值至5.5 UV254nm哌拉西林0.4mg/ml（溶液:（e）0.4mg/ml（溶液（e）10中国药典（1990）内标校正因子法哌拉西林钠Piperacillin Sodium4.6mm25cm,Packing L1（5-10m）甲醇-0.2mol/L磷酸氢钠液-10%氢氧化四丁基铵液-水（450:100:3:447），用磷酸调节pH值至5.51UV254nm哌
20、拉西林0.4mg/ml（溶液:流动相）0.4mg/ml（溶液:流动相）10USP（XX）外标校正法头孢唑林Cefazolin4.0mm3cm,Packing L1（10m）PH3.6缓冲液（f）-乙腈（9:1）2UV254nm头孢唑林0.05mg/ml（溶液:（g）0.05mg/ml（溶液:（g）10USP（XX）内标校正因子法头孢唑林钠Cefazolin Sodium4.0mm30cm,Packing L1（10m）PH3.6缓冲液（f）-乙腈（9:1）2UV2250nm头孢唑林0.05mg/ml（溶液:（g）0.02mg/ml（溶液（h）10USP（XX）内标校正因子法高效液相色谱分析高效
21、液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注 头孢哌酮CefoperazonC18硅烷键合硅胶三乙胺醋酸液（i）-1mol/L醋酸-乙腈-水（1.2:1.8:120:876）2UV235nm头孢哌酮0.48mg/ml（溶液:（j）0.48mg/ml（溶液:（j）10中国药典（1990）内标校正因子法头孢哌酮钠Cefoperazon Sodium4.0mm30cm,Packing L1（5-10m）三乙胺醋酸液（i）-1mol/L醋酸-乙腈-水（1.2:1.8:120:876）2UV254nm二水合头孢哌酮头孢哌酮浓度:0.1
22、6mg/ml（溶剂:流动相）头孢哌酮浓度:0.16mg/ml（溶剂:流动相）10USP（XX）外标校正法头孢噻肟钠Cefotaxime Sodium3.9mm30cm,Packing L1（5-10m）磷酸缓冲液（k）-甲醇（1000:120）1.5UV254nm头孢噻肟钠0.1mg/ml（溶剂:水）0.1mg/ml（溶剂:水）10USP（XX）外标校正法头孢替坦双钠Cefotetan disodium4.6mm25cm,Packing L1（5-10m）0.1mol/L磷酸-甲醇-乙腈-冰醋酸（1700:105:105:100）1.5UV254nm头孢替坦0.2mg/ml（溶液:（l）0.2
23、mg/ml（溶液:（l）20USP（XX）外标校正法高效液相色谱分析高效液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注 头孢西丁钠Cefoxitin Sodium3.9mm30cm,Packing L1（5-10m）水-乙腈-冰醋酸（840:160:10）1UV254nm头孢西丁0.3mg/ml（溶液:（m）0.3mg/ml（溶液:（m）10USP（XX）外标校正法头孢他啶Ceftazidime4.6mm15cm,Packing L1（5m）PH7.0缓冲液（n）-乙腈-水（200:40:1400）2UV254nm五水合头孢他
24、啶头孢全啶浓度0.1mg/ml（溶液:（o）0.115mg/ml（溶液:（p）20USP（XX）外标校正法头孢唑肟钠Ceftizoxime sodium4.0mm30cm,Packing L1（5-10m）PH3.6缓冲液（q）-乙腈（9:1）2UV2250nm头孢唑肟0.02mg/ml（溶液:（r）头孢唑肟浓度:0.02mg/ml（溶液（r）10USP（XX）内标校正因子法头孢三嗪钠Ceftraxone Sodium4.0mm15cm,Packing L15*（5m）PH7.0缓冲液（s）-乙腈（含溴化四庚铵3.2g）-PH5.0缓冲液（t）-水（44:400:4:552）2UV235nm头
25、孢三嗪钠0.2mg/ml（溶剂:流动相）0.2mg/ml（溶液:流动相）20USP（XX）外标校正法高效液相色谱分析高效液相色谱分析 抗生素名称色谱柱和填料流 动 相流 速（ml/min检测器标准品及其浓度供试品浓度进样量（l）备 注 头孢呋新钠Cefuroxime sodium4.6mm30cm,Packing L1（5-10m）PH3.4醋酸缓冲液（u）-乙腈（10:1）2UV254nm头孢呋新钠:0.05mg/ml（溶剂:（v）0.05mg/ml（溶剂:（v）10USP（XX）内标校正因子法头孢匹林钠Cephapirin sodium3.9mm30cm,Packing L1（5-10m）
26、水-二甲基酰铵-冰醋酸-11.7mol/L氢氧化钾（1894:100:4:2）2UV254nm头孢匹林钠0.21mg/ml（溶剂:（w）0.21mg/ml（溶剂:（W）20USP（XX）内标校正因子法*Packing L1为C18硅烷键合硅胶填料。*Packing L15为C6硅烷键合硅胶填料。表中括号内的英文字母与下面的“表8-2中所用缓冲液和浓液的配制”内容中的英文字母编号相对应。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 表8-2中所用缓冲液和溶液的配制（a）pH5.0缓冲液 用水溶解并稀释磷酸二氢钾1.36g至1000ml，用磷酸或10mol/L氢氧化钠调节pH值为5.00.1。（b）溶液 取1
27、mol/L磷酸二氢钾10ml和1ml，用水稀释至1000ml。（c）pH5.0 缓冲液 取磷酸二氢钾5.44g，用水溶解并稀释至2000ml，用8mol/L氢氧代钾调节pH值为5.00.1。（d）pH7.0缓冲液 取磷酸二氢钾14g和40%氢化四丁基铵溶液6.5g，用水溶解并稀释至1000ml，用1oml/L氢氧化钾液调节pH值至7.0。（e）乙酰氨基苯甲醚内标液 取乙酰氨基苯甲醚50mg，以甲醇溶解，用流动相稀释至100ml。溶液用甲醇溶解，取样品40mg，准确加内标液10.0ml，用流动相稀释至100ml。（f）pH3.6缓冲液 取无水磷酸氢二钠0.900g和水合枸椽酸1.298g，用水溶
28、解并稀释至1000ml。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （g）pH7.0缓冲液 取无水磷酸氢二钠5.68g和磷酸二氢钾3.63g，用水溶解并稀释至1000ml。水杨酸内标液 取水杨酸750mg，用甲醇5ml溶解，用pH7.0缓冲液稀释至1000ml。溶液取样品50mg，用pH7.0缓冲液溶解并稀释至50ml；取此溶液5.0ml，加水杨酸内标液5.0ml，用pH7.0缓冲液稀释至100ml。（h）取供试品50mg，用（g）中的pH7.0缓冲液溶解并稀释至50ml；取此溶液4.0ml，加（g）中水杨酸内标液5.0ml，用（g）中的pH7.0缓冲液稀释至200ml。（i）三乙胺醋酸缓冲液 取三乙胺
29、14ml和冰醋酸5.7ml，用水稀释至100ml。（j）pH7.0磷酸缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钠液39.0ml与0.2mol/L磷酸氢二钠液61.0ml，混匀。乙酰苯胺内标液 取乙酰苯胺50mg，用流动相溶解并稀释至100ml。溶液 样品用pH7.0磷酸缓冲液35ml溶解，用流动相稀释至50ml。取此溶液10ml，用流动相稀释至25ml。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （k）磷酸缓冲液 取磷酸二氛钾60mg和磷酸氢二钠1.2g，用水溶解并稀释至1000ml。（l）溶液 将样品用甲醇10ml和乙腈10ml溶解，用水稀释至200ml。（m）溶液（pH7.0缓冲液）取磷酸二氢钾1.0g和
30、磷酸氢二钠1.8g，用水溶解并稀释至1000ml，用磷酸或10mol/L氢氧化钠调节pH7.00.1。（n）pH7磷酸缓冲液 取无水磷酸氢二钠42.59g和磷酸二氢钾27.22g用水溶解并稀释至1000ml。（o）溶液 样品用（n）中约pH7磷酸缓冲液2.5ml溶解，用水稀释，使头孢他啶浓度为0.1mg/ml。（p）溶液 取样品115mg，用（n）中的pH7磷酸缓冲液10.0ml溶解，用水稀释至100ml；取此溶液5ml，用水稀释至50ml。（q）pH3.6缓冲液 取稀释水合枸椽酸1.42g和磷酸氢二钠1.73g，用水溶解并至1000ml。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 （r）pH7.0缓冲
31、液 取磷酸二氢钾3.63g和磷酸氢二钠10.73g，用水溶解并稀释至1000ml。水杨酸内标液 取水杨酸1.2g，用甲醇10ml溶解，用pH7.0缓冲液稀释至200ml。溶液 取样品用pH7.0缓冲液溶解并知释，配成头孢唑肟浓度为1mg/ml溶液；取此溶液2.0ml和内标液5.0ml，用pH7.0缓冲液稀释至100ml。（s）pH7.0缓冲液 取磷酸酸氢二钾13.6g和磷酸二氢钾4.0g，用水溶解并稀释至1000ml，用磷酸或10mol/L氢氧化钾调节pH7.00.1。（t）pH5.0缓冲液 取枸椽酸钠25.8g，用水溶解并稀释至1000ml，用20%枸椽酸液调节pH值为5.00.1。（u）p
32、H3.4醋酸缓冲液 取0.1mol/L醋酸钠液50ml，用0.1mol/L醋酸稀释至1000ml。（v）苔黑酚内标液 取苔黑酚0.15g，用水溶解并稀释至100ml。溶液样品用水溶解并稀释，使头孢呋新的浓度为1mg/ml；取此溶液5.0ml，加内标液20.0ml，用水稀释至100ml。（w）N-乙酰苯胺内标液 取N-乙酰苯胺500mg，用二甲基甲酰胺5.0ml溶解，用流动相稀释至200ml。溶液取样品21mg和内标液5.0ml，用流动相溶解并稀释至100ml。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 二、葡萄酒中有机酸的定性、定量分析1.标准溶液的配制 根据参考数据，葡萄酒中含：酒石酸510g/L、L
33、-苹果酸24g/L、L-乳酸02.5g/L、琥珀酸0.51.5g/L、柠檬酸1g/L左右、乙酸1g/L。配置以下浓度（见下表8-3）的混合标准酸液,定容至10ml，作为寻找标准酸的色谱分离条件使用。酒石酸L-苹果酸L-乳酸琥珀酸柠檬酸乙酸浓度552121表 8-3标准混合酸液的配制 （g/L）高效液相色谱分析高效液相色谱分析 2.流动相的配制 配置pH=2.5高氯酸液作为流动相。3色谱系统配有210nm波长紫外检测器；色谱柱为SCR-101H（300mm7.9mm）；流速为 0.6ml/min；柱温 55；分别进样量10l。4测定（1）定性用各种有机酸标准液分别进样,记录保留时间。（2）定量用
34、峰面积外标法，将不同浓度酸液从低浓度到高浓度依次进样，计算各自的峰面积（每个样平行进3次），作各种有机酸的标准曲线（峰面积-浓度）。高效液相色谱分析高效液相色谱分析 组分保留时间（min）回归方程R2柠檬酸8.743Y=0.0005x+0.24740.9944酒石酸9.235Y=0.0004x+0.30110.9920L-苹果酸10.425Y=0.0007x+0.20110.9982L-乳酸12.794Y=0.0001x+0.20110.9876琥珀酸13.722Y=0.0008x+0.24600.9988乙酸16.049Y=0.0009x+0.46390.9708表8-4为各种有机酸的保留时间与线性回归方程 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 测定次数柠檬酸酒石酸L-苹果酸琥珀酸10.50403.74992.90020.623120.52683.83252.90380.561830.53063.69752.81250.644940.49383.90032.98900.582450.48023.83822.78350.6169平均值0.507083.80012.87820.60582相对标准偏差（%）3.41.82.24.5表8-5方法的重现性实验结果 高效液相色谱分析高效液相色谱分析
