1、1.3蛋白质工程蛋白质工程 活动活动 1. 描述基因工程的操作步骤描述基因工程的操作步骤。 目的基因的获取目的基因的获取 基因表达载体的构建基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 2. 讨论基因工程产生的蛋白质的特点讨论基因工程产生的蛋白质的特点。 基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 活动活动 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起 天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成 的的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需它们的结构和功能符合特定物种生
2、存的需 要要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 例如：例如： 改造改造 干扰素干扰素（半胱氨酸半胱氨酸） 体外很难保存体外很难保存 干扰素干扰素（丝氨酸丝氨酸） 体外可以保存半年体外可以保存半年 玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶 （352352位的苏氨酸）位的苏氨酸） 二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶 （104104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺） 改造改造 改造改造 天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（异亮氨酸异亮氨酸） 二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶 （异亮氨酸）（异亮氨酸） 玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米
3、中赖氨酸含量可提高数倍 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关 系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋 白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类 对生产和生活的需求。对生产和生活的需求。 前提：前提： 原理：原理： 目的：目的： 了解蛋白质的结构和功能了解蛋白质的结构和功能 改造基因改造基因( (基因修饰或基因合成基因修饰或基因合成) ) 定向改造或制造蛋白质定向改造或制造蛋白质 一一、蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念 蛋白质工程蛋白质工程是指通过物理化学
4、与生物化学等技术是指通过物理化学与生物化学等技术 了解蛋白质的结构和功能，并借助计算机辅助设了解蛋白质的结构和功能，并借助计算机辅助设 计、基因定点诱变和重组计、基因定点诱变和重组DNADNA技术改造基因，以定技术改造基因，以定 向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋 白质的技术。白质的技术。 实施蛋白质工程的前提条件 了解蛋白质的结构和功能的关系 X射线衍射仪 核磁共振仪器核磁共振仪器 蛋白质结构 天然蛋白质的合成途径：天然蛋白质的合成途径： 基因基因 表达表达（转录和翻译转录和翻译） 形成氨基酸序列的多肽形成氨基酸序列的多肽 链链 形成具有高级
5、结构的蛋白质形成具有高级结构的蛋白质 行使生物功能行使生物功能 预期的蛋白质功能出发预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构 推测推测 应有的氨基酸序列应有的氨基酸序列 找到相应的脱氧核苷酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列 蛋白质工程的途径：蛋白质工程的途径： 氨氨 基基 酸酸 序序 列列 多多 肽肽 链链 蛋白蛋白 质三质三 维维 结构结构 预预 期期 功功 能能 基基 因因 D N A DNA 合成合成 分子分子 设计设计 折叠折叠 翻译翻译 二二、蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的基本原理 转转 录录 mRNA 生生 物物 功功 能能 表表 现现 （1 1）从生物体中分离
6、纯化目的蛋白；从生物体中分离纯化目的蛋白； （2 2）测定其氨基酸序列；测定其氨基酸序列； （3 3）借助核磁共振和借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段射线晶体衍射等手段，尽可能尽可能 地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构; ; （4 4）设计各种处理条件设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化了解蛋白质的结构变化， 包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响； （5 5）设计编码该蛋白的基因改造方案设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；如点突变； （6 6）分离分离、纯化新蛋白纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用功能检测
7、后投入实际使用。 三、蛋白质工程的三、蛋白质工程的主要步骤主要步骤 已知已知：某多肽链的一段氨基酸序列某多肽链的一段氨基酸序列 -丙氨酸丙氨酸-色氨酸色氨酸-赖氨酸赖氨酸-甲硫氨酸甲硫氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸- 各氨基酸的可能的密码子各氨基酸的可能的密码子 丙氨酸：丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：色氨酸：UGG 赖氨酸：赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸：苯丙氨酸：UUU、UUC 讨论：讨论： 1. 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来请把相应的碱基序列写出来。 首先应该根据首先应该根据
8、三联密码子三联密码子推出推出mRNA序列为：序列为： GCU（或或C或或A或或G）UGGAAA（或或G）AUGUUU （或或C） 再根据再根据 碱基互补配对规律碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序推出脱氧核苷酸序 列：列：CGA（或或G或或T或或C）ACCTTT（或或C） TACAAA（或或G）。 2. 确定目的基因的碱基序列后确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目怎样才能合成或改造目 的基因的基因（DNA）？ 根据人类的需要改造它根据人类的需要改造它，通过人工合成的方通过人工合成的方 法或从基因库中获取法或从基因库中获取。 蛋白质工程的实质蛋白质工程的实质 对编码蛋白质的基因进行改造对编
9、码蛋白质的基因进行改造 对蛋白质进行改造 大改 中改 小改 设计设计、制造出自然界不存在的制造出自然界不存在的 全新蛋白质全新蛋白质 替代某一个肽段或一个替代某一个肽段或一个 特定的结构域特定的结构域 改造某个活性单位的一个或几改造某个活性单位的一个或几 个氨基酸残基个氨基酸残基（定点诱变技术定点诱变技术） 核心技术 基因定点诱变技术的示意图基因定点诱变技术的示意图 基因定点诱变技术的理解基因定点诱变技术的理解 项目项目 内容内容 条条 件件 原料原料 酶酶 引物引物 能量能量 操作方法操作方法 法法 结果结果 适应范围适应范围 后代中半数为诱变的分子后代中半数为诱变的分子 脱氧核苷酸脱氧核苷
10、酸 聚合酶和连接酶聚合酶和连接酶 含突变顺序的分子片段含突变顺序的分子片段 空间结构完全清楚的蛋白质空间结构完全清楚的蛋白质 思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较 比较比较 基因定点诱变基因定点诱变 基因突变基因突变 相相 同同 点点 发生的发生的 过程过程 结果结果 不不 同同 点点 场所场所 手段手段 方向方向 DNADNA复制过程中复制过程中 产生新基因，从而产生新性状产生新基因，从而产生新性状 生物体外生物体外 生物体内生物体内 定向改造定向改造 不定向性不定向性 PCRPCR技术技术 物理化学方法物理化学方法 2 2、蛋白质工程操作程序的基本思
11、路与基因工程有什蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什 么不同么不同？ 活动活动 比较基因工程和蛋白质工程比较基因工程和蛋白质工程 基因工程基因工程 蛋白质工程蛋白质工程 相同点相同点 都要改造基因，都属于分子水平都要改造基因，都属于分子水平 产生新的产生新的 基因型，无新基因基因型，无新基因 基因（型）基因（型） 产生的蛋白质产生的蛋白质 原有的原有的 新的新的 联系联系 蛋白质工程以基因工程为基础，蛋白质工程以基因工程为基础， 是基因工程的应用和延伸是基因工程的应用和延伸 异亮氨酸异亮氨酸 苏氨酸苏氨酸 蛋白质工程的应用 天门冬酰胺天门冬酰胺 天门冬酰胺天门冬酰胺 酵母菌 丙糖磷酸异构
12、酶 热稳定性 提高50 工业生产上工业生产上 鼠抗体鼠抗体 人抗体人抗体 恒定区恒定区 恒定区恒定区 可变区 可变区可变区 嵌合抗体嵌合抗体 对人体的不良反应减少对人体的不良反应减少 制药领域上制药领域上 蛋白质工程的进展与前景蛋白质工程的进展与前景 蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要主要 是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间 结构结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构 了解很少了解很少。 蛋白质改造工程举例蛋白质改造工程举例 1水蛭素改造水蛭素改造 水蛭素是水蛭
13、唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有它有 多种变异体多种变异体，由由65或或66个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成。水蛭素在临水蛭素在临 床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素为提高水蛭素 活性活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭 素主要变异体素主要变异体HV2的设计方案的设计方案，将将47位的位的Asn（天冬酰天冬酰 胺胺）变成变成Lys（赖氨酸赖氨酸），使其与分子内第使其与分子内第4或第或第5位位 Thr（苏氨酸苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素间形成氢键来帮助
14、水蛭素N端肽段的正端肽段的正 确取向确取向，从而提高凝血效率从而提高凝血效率，试管试验活性提高试管试验活性提高4倍倍， 在动物模型上检验抗血栓形成的效果在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高提高20倍倍。 2生长激素改造生长激素改造 生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生 长发育长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合还可以结合 许多种不同类型细胞的催乳激素受体许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程引发其他生理过程。 在治疗过程中为减少副作用在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激
15、素只与需使人的重组生长激素只与 生长激素受体结合生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合尽可能减少与其他激素受体的结合。 经研究发现经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全但并不完全 相同相同，有可能通过改造加以区别有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催由于人的生长激素和催 乳激素受体结合需要锌离子参与作用乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受而它与生长激素受 体结合则无需锌离子参与体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基于是考虑取代充当锌离子配基 的氨基酸侧链的氨基酸侧链，如第如第18和第和第21位位His（组氨酸组氨酸
16、）和第和第17位位 Glu（谷氨酸谷氨酸）。实验结果与预先设想一致实验结果与预先设想一致，但要开发作但要开发作 为临床用药还有大量的工作要做为临床用药还有大量的工作要做。 3胰岛素改造胰岛素改造 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体， 延缓胰岛素从注射部位进入血液延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血从而延缓了其降血 糖作用糖作用，也增加了抗原性也增加了抗原性，这是胰岛素这是胰岛素B23-B28氨基氨基 酸残基结构所致酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基利用蛋白质工程技术改变这些残基， 则可降低其聚合作用则可降低其聚合作用，使胰
17、岛素快速起作用使胰岛素快速起作用。该速效该速效 胰岛素已通过临床实验胰岛素已通过临床实验。 4治癌酶的改造治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性特异性 地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害， 可以提高化学治疗的剂量可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 （TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱 基基3-OH缺乏缺乏,从而阻断从而阻断DNA的合成的合成，杀死癌
18、细胞杀死癌细胞。HSVTK催催 化能力可以通过基因突变来提高化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选从大量的随机突变中进行筛选 出一种酶出一种酶,在酶活性部位附近有在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换个氨基酸被替换，催化能力催化能力20倍倍 以上以上。 蛋白质工程的发展很快蛋白质工程的发展很快，研究工作很多研究工作很多，以上仅介绍了几个例以上仅介绍了几个例 子子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质 外外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在它在 解决
19、生物理论方面所起的作用解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法可以和任何重大的生物研究方法 相提并论相提并论。 1. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（ ） A. 氨基酸结构氨基酸结构 B. 蛋白质空间结构蛋白质空间结构 C. 肽链结构肽链结构 D. 基因结构基因结构 练习：练习： D 2. 下列关于蛋白质工程的说法错误的是（下列关于蛋白质工程的说法错误的是（ ） A. 蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更 加符合人类的需要加符合人类的需要 B. 蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直
20、接进行蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行 操作，定向改变分子的结构操作，定向改变分子的结构 C. 蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋 白质分子白质分子 D. 蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代 基因工程基因工程 B 3. 蛋白质工程的基本流程正确的是蛋白质工程的基本流程正确的是（ ） 蛋白质分子结构设计蛋白质分子结构设计DNA合成合成 预期蛋白质功能预期蛋白质功能 根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列根据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列 A. B. C. D. C 4. 蛋白质工程是在
21、基因工程基础上蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来的第延伸出来的第 二代基因工程二代基因工程，其结果产生的蛋白质是其结果产生的蛋白质是（ ） A. 氨基酸种类增多氨基酸种类增多 B. 氨基酸种类减少氨基酸种类减少 C. 仍为天然存在蛋白质仍为天然存在蛋白质 D. 可合成天然不存在蛋白质可合成天然不存在蛋白质 D 1.你知道人类蛋白质组计划吗你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有它与蛋白质工程有 什么关系什么关系？我国科学家承担了什么任务我国科学家承担了什么任务？ 思考思考 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生生 命科学乃至自然领域一项重大的科学
22、命题命科学乃至自然领域一项重大的科学命题。 2001年年，国际人类蛋白质组组织宣告成立国际人类蛋白质组组织宣告成立。2003 年年，该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动：该组织正式提出启动了两项重大国际合作行动： 一项是由中国科学家牵头执行的一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组人类肝脏蛋白质组 计划计划”；另一项是以美国科学家牵头的；另一项是以美国科学家牵头的“人类血浆蛋人类血浆蛋 白质组计划白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。 2. 对天然蛋白质进行改造对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白你认为应该直接对蛋白 质分子进行操作质分
23、子进行操作，还是通过对基因的操作来实现还是通过对基因的操作来实现？ 答：答：毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋 白质改造白质改造，主要原因如下主要原因如下 （1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造改造 了基因即对蛋白质进行了改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白而且改造过的蛋白 质可以遗传下去质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造如果对蛋白质直接改造。即使改即使改 造成功造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。 （2）对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容对基因
24、进行改造比对蛋白质直接进行改造要容 易操作易操作，难度要小得多难度要小得多。 能不能根据人类需要的蛋白质的结构能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设设 计相应的基因计相应的基因，导入合适的细菌中导入合适的细菌中，让细菌生让细菌生 产人类所需要的蛋白质食品呢产人类所需要的蛋白质食品呢？ 异想天开异想天开 理论讲可以理论讲可以，但目前还没有真正成功的例子但目前还没有真正成功的例子。 一些报道利用细菌生产人类需要的蛋主要原因是一些报道利用细菌生产人类需要的蛋主要原因是 蛋白质的高级结构非常复杂蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结人类对蛋白质的高级结 构和在生物体内如何行使功能知之甚少构和在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出很难设计出 一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质一个崭新而又具有生命功能作用的蛋白质，而且一个而且一个 崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。
