1、分子医学实验全册分子医学实验全册 完整教学课件完整教学课件1 实验室规则实验室规则 （一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导（一）保持实验室安静，认真仔细地按实验指导 进行实验。进行实验。 （二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。（二）穿戴好实验服。保持实验台的清洁整齐。 （三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂，（三）爱护仪器，谨慎使用。节约使用药品试剂， 蒸馏水，自来水和电。蒸馏水，自来水和电。 （四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛（四）不得将高温、强酸强碱、有毒污垢物品抛 洒在实验台上。洒在实验台上。 （五）公用物品用毕放回原处，不得私自占有。（五）公用物品用毕放回原处，不得
2、私自占有。 （六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放（六）取完试剂应将瓶盖盖好，切勿错盖，用毕放 回原处。回原处。 （七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全（七）加热、用电，使用剧毒腐蚀试剂应注意安全 操作，避免事故。操作，避免事故。 （八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒（八）废弃液体除指定有专门容器收集者外，应倒 入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。入水池，并放水冲走，固体废物倒入废物缸内。 动物尸体应放入指定的容器中。动物尸体应放入指定的容器中。 （九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切（九）实验过程中自己不能解决或决定的问题，切 勿盲目处理，应及时向指导教师反映
3、取得帮助。勿盲目处理，应及时向指导教师反映取得帮助。 （十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用（十）实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用 物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教物品，将仪器洗净收起。檫净实验台，请指导教 师检查，允许后方可离开。师检查，允许后方可离开。 实验报告实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，按照下列 顺序写出实验报告：顺序写出实验报告： 实验报告首页：实验名称（实验报告首页：实验名称（The title of experiment ）；姓）；姓 名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日
4、期名；学号；班级；组别；同组同学；带教教师；实验日期 等。等。 正文：原理（正文：原理（Principle）；操作步骤（）；操作步骤（Operational procedure）；实验结果（）；实验结果（Results）：包括照片、原）：包括照片、原 始数据、计算过程及图表等；讨论（始数据、计算过程及图表等；讨论（Discussion）：对）：对 实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对 于实验设计的认识、体会和建议。于实验设计的认识、体会和建议。 成绩评分标准成绩评分标准 50% 实验实验 + 50%理论考试理论考试 实验课实验课8
5、次，实验报告，次，实验报告， 实验表现（包括迟到早退，着装规范，实验操作规范，实验表现（包括迟到早退，着装规范，实验操作规范， 实验室卫生值日等），实验室卫生值日等）， 8次实验总分最后按比例计入总成绩。次实验总分最后按比例计入总成绩。 实验报告存档，不归还。实验报告存档，不归还。 理论考试内容来自于讲义及平时教学。理论考试内容来自于讲义及平时教学。 第八次设计性实验课安排第八次设计性实验课安排 分组方案：分组方案：4人一组（无法组队同学加入其它组）人一组（无法组队同学加入其它组） 答辩答辩ppt内容：内容： 实验目的，意义，原理，实验方法选择，预计结果及数据表现形式，实验目的，意义，原理，实
6、验方法选择，预计结果及数据表现形式， 实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释实验难点及可能出现问题，可能出现的实验结果偏差及解释 答辩安排：答辩安排： 最后一周答辩，每组时间控制为最后一周答辩，每组时间控制为20分钟演讲，分钟演讲，10分钟提问。分钟提问。 设计性实验题设计性实验题 1 免疫球蛋白免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定。的分离纯化与鉴定。 2 人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。人血清白蛋白的提取纯化及分子量的测定。 3 蛋清中溶菌酶的分离鉴定。蛋清中溶菌酶的分离鉴定。 4 小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。小鼠肝脏过氧化氢酶的分离纯化及酶动力学研究。 5
7、如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？如何从动物心肌细胞中提取乳酸脱氢酶同工酶？ 6 如何提取真核细胞中的线粒体基因组如何提取真核细胞中的线粒体基因组DNA？ 7 请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴请设计实验从基因及蛋白表达角度讨论老年痴呆症模型小鼠与人类老年痴 呆症的可比较性呆症的可比较性 （即小鼠模型建立的可靠性）（即小鼠模型建立的可靠性） 8 请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化，请设计实验从基因及蛋白表达角度追踪老年痴呆模型小鼠发病期典型变化， 及给药治疗后效果评价及给药治疗后效果评价 9 蛋白质的表达具有一定的组织特异性，
8、请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设蛋白质的表达具有一定的组织特异性，请以实验小鼠胰腺和肝脏为材料设 计实验检测羧肽酶计实验检测羧肽酶A1酶原酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白和白蛋白(Albumin) 并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。并计算这两种蛋白质在胰腺和肝脏中的表达量。 10 细胞色素氧化酶（细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝脏中有三种亚型，即细）在肝脏中有三种亚型，即细 胞色素氧化酶胞色素氧化酶1，2和和3，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的，请以实验小鼠肝脏为材料设计实验检测这三种酶的 表达并计算它们的表达量。表达并计
9、算它们的表达量。 实验一、真核生物基因组实验一、真核生物基因组DNA DNA 的提取和含量测定的提取和含量测定 一、一、 实验背景实验背景 高等生物的基因组很大。比如人细高等生物的基因组很大。比如人细 胞基因组约含胞基因组约含3 3万个结构基因。基万个结构基因。基 因组包含了人生长，发育，繁殖等因组包含了人生长，发育，繁殖等 各项生理活动的几乎全部信息量。各项生理活动的几乎全部信息量。 研究的起点就是要获得研究的起点就是要获得高纯度高纯度基因基因 组组DNADNA不含蛋白质、糖类、酚、不含蛋白质、糖类、酚、 氯仿等污染；氯仿等污染；得率好得率好以便有足够以便有足够 量用于分析；基因组相对量用于
10、分析；基因组相对完整完整不不 断裂的基因组以便用于以后断裂的基因组以便用于以后PCR分分 析，析，RFLPRFLP分析，基因文库的构建，分析，基因文库的构建， 基因探测等的研究。基因探测等的研究。 人体一个细胞基因组人体一个细胞基因组DNA有多长度？有多长度？ 人基因组有多大？人基因组有多大？ 人体有多少细胞？人体有多少细胞？ 掌握小鼠肝脏基因组掌握小鼠肝脏基因组DNADNA的提取技术的提取技术 学习学习DNADNA定性定性、定量分析的原理和技术定量分析的原理和技术 第一部分第一部分 ：小鼠肝组织：小鼠肝组织DNADNA的提取的提取 第二部分第二部分: : 紫外分光光度法分析紫外分光光度法分析
11、DNADNA纯度纯度 第三部分：第三部分： 二苯胺法分析二苯胺法分析DNADNA含量和纯度含量和纯度 三、实验内容三、实验内容 四、主要试剂四、主要试剂 二、二、 实验目的实验目的 五、实验步骤五、实验步骤 一、核酸提取的主要步骤一、核酸提取的主要步骤 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: : 1) 1) 破碎细胞破碎细胞 2) 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子去除蛋白质，糖类等等生物大分子；由于真核细胞；由于真核细胞 基因组较大，在纯化出的基因组较大，在纯化出的DNADNA的操作中应注意动作轻柔，的操作中应注意动作轻柔， 且在低温下进行，以最
12、大限度地减少机械和化学作用且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用 对对DNADNA的剪切，从而获得相对完整的的剪切，从而获得相对完整的DNADNA 3) 3) 沉淀核酸沉淀核酸 乙醇沉淀 SDS裂解 蛋白酶K消化 二苯胺法 紫外分光光度法分析 DNA提取和分析步骤图解提取和分析步骤图解 酚氯仿抽提 作用：作用：a a. .阴离子型去污剂阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.b.使蛋白质变性使蛋白质变性 c.c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用 成分：成分：N: NaCl 150mMN: NaCl 150m
13、M E: EDTA.NaE: EDTA.Na2 2 25mM (PH:8.0)25mM (PH:8.0) 作用：作用：金属离子螯合剂，抑制金属离子螯合剂，抑制DNaseDNase的活性的活性 ( (螯合螯合DNaseDNase发挥活性所需的发挥活性所需的2 2价阳离子价阳离子) )。 二、各种试剂的作用二、各种试剂的作用 1 1、裂解液、裂解液： 2 2、SDS SDS ：十二烷基硫酸钠：十二烷基硫酸钠 终浓度终浓度0.5%0.5% 3 3、蛋白酶、蛋白酶K(K(或链霉蛋白酶或链霉蛋白酶) ) 作用：作用：广谱蛋白酶，能在广谱蛋白酶，能在SDSSDS和和EDTAEDTA的存在下保持很高的活的存
14、在下保持很高的活 性，性，降解蛋白质，将降解蛋白质，将DNADNA游离。游离。 重蒸酚重蒸酚: : 酚的作用是变性蛋白质酚的作用是变性蛋白质，而对而对DNADNA结构没有影响结构没有影响。 无色无色 酚的氧化产物酚的氧化产物( (如醌等如醌等, ,粉红色粉红色) ) 破坏磷酸二脂键。破坏磷酸二脂键。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。 TETE溶液溶液: : TrisTris- -HClHCl 1010mMmM (pH(pH: :8 8. .0 0) ) EDTAEDTA. .NaNa2 2 1 1mMmM (pH(pH: :8 8. .0 0) ) 作用：提
15、供略碱的作用：提供略碱的pHpH值值，保证保证DNADNA溶于水相溶于水相。 在酸性条件下在酸性条件下，DNADNA分配于有机相分配于有机相。 8 8- -羟基喹啉：羟基喹啉：0.1% 0.1% 黄色酚相指示剂黄色酚相指示剂 抗氧化剂抗氧化剂 作用：作用： 去除蛋白等杂质去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用酚对蛋白有强烈的变性作用，可可 使样品中的蛋白质变性使样品中的蛋白质变性，通过离心去除通过离心去除。为防止其对后续实为防止其对后续实 验的影响验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚一般再用氯仿抽提去除残留的酚。 4 4、苯酚：、苯酚： 成分：成分： 氯仿作用：氯仿作用： a. a. 氯仿
16、的变性作用不如酚好，氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同但与酚共同/ /交替使用可交替使用可增强去蛋白效果增强去蛋白效果； b. b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性； 5 5、酚、酚/ /氯仿氯仿 6 6、氯仿、氯仿/ /异戊醇异戊醇 ( 24 : 1)( 24 : 1) 氯仿的作用：氯仿的作用： 去除去除DNADNA水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：降低表面张力，减少操作过程中气泡的产生。异戊醇的作用：降低表面张力，减少操作过程中气泡的产生。 在单价阳离子存在的情
17、况下，乙醇可以使在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNADNA发生沉淀发生沉淀。 8 8、无水乙醇、无水乙醇 ： 作用：提供作用：提供单价阳离子单价阳离子，中和，中和DNADNA分子表面的负电荷，使分子表面的负电荷，使 得得DNADNA容易聚集容易聚集 7 7、醋酸钠：、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.23M NaAc pH: 5.2 核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子 形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会 被变性。被变性。 最常用沉淀剂为最常用沉淀剂为1 1价钠、钾
18、、胺和锂等离子的盐类，如醋价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋 酸钠、酸钠、NaClNaCl、氯化锂、氯化钾等、氯化锂、氯化钾等 常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等 注意事项：注意事项： 1 1） 本实验将用到的本实验将用到的TETE饱和重蒸苯酚、氯仿饱和重蒸苯酚、氯仿/ /异戊醇是有机试异戊醇是有机试 剂，比水的比重大，而剂，比水的比重大，而DNADNA溶解在水里，我们溶解在水里，我们总是取上清。总是取上清。 ； 2 2） 在在抽取完苯酚、氯仿等抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，有机试剂，不能将加样器平放或倒不能将加样器平放或倒 置置，以
19、防液体导流损坏加样器，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。加完样后立即弃掉加样器头。 。 3 3） 基因组基因组DNADNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此， 为了得到完整的基因组为了得到完整的基因组DNADNA，尽量不要多次进行物理性操作。，尽量不要多次进行物理性操作。 4 4）离心机使用注意平衡！离心机使用注意平衡！ 【操作步骤操作步骤】 基因组基因组DNA的提取的提取 1组织细胞的裂解组织细胞的裂解 （1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就 会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活
20、性，防止 基因组DNA被降解。 （2）碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操 作）。 （3）匀浆液转入2mL离心管，4 , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL 无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100g/ml的蛋白酶 K），慢慢颠倒混匀，50保温90分钟, 直到组织完全解体。 （4）加10mg/ml的RNase 16l (终浓度200g/ml)，37保温40min。 2裂解物中蛋白质的去除裂解物中蛋白质的去除 （1）加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置 5min。待分层后, 于4，12000rpm离心15min。离心后可见
21、分层， 上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。 （2）小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，重复上述操作以去除蛋 白质，直至界面不再出现明显的变性蛋白质为止。 （3）小心吸出上面的水层并转移到另一新的小离心管中，根据吸出的 量再加入等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀。4，12000rpm离心 15min。本步骤可去除微量的酚。 3DNA的沉淀的沉淀 1）上清加1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的无 水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10分钟，DNA沉淀形 成白色絮状物。100
22、00rpm离心10min，弃上清。 2）DNA沉淀溶解于3ml TE 中，进行260nm/280nm紫外检测。 核酸定性定量检测核酸定性定量检测 核酸的含量可以用定磷法、定糖法和紫外分光光度 法来测定。 定磷法是利用核酸分子中磷的含量相对恒定这一性 质来测定核酸的含量，该法测定的结果较准确 （RNA、DNA中磷的质量分数的平均值分别为 9.5%，9.9%）； 定糖法中的二苯胺法测定DNA的含量 紫外分光光度法测定核酸较为方便，但误差较大。 二苯胺显色法测定二苯胺显色法测定DNA含量含量 【基本原理基本原理】 DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性 环境中脱水生成-羟基-酮基戊
23、醛，后者与二苯胺试剂一 起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数 糖类，包括核糖在内，一般无此反应。 实验流程 DNA标准溶液 取取14支试管，分成支试管，分成7组，其中五组依次加入组，其中五组依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和和2.0 mL DNA标准溶液标准溶液 用于绘制用于绘制DNA标准曲线标准曲线 实验流程 DNA标准溶液 H2O 水 待测DNA溶液 另取2支试管，各加2 mL蒸馏水作为对照。 2支试管，加2ml待测DNA溶液 用于绘制用于绘制DNA标准曲线标准曲线 实验
24、流程 二苯胺 DNA标准溶液 H2O 水 待测DNA溶液 然后各加入4 mL二苯胺试剂，混匀 用于绘制用于绘制DNA标准曲线标准曲线 于100恒温水浴中保温20分钟，冷却后于595 nm处进行比色测定。 取两管平均值，以DNA含量为横坐标，光吸收 值为纵坐标，绘制标准曲线。 DNA含量的计算含量的计算 根据测得的光吸收值，绘制标准曲线，从标准曲线 上查出相当该光吸收值的DNA的含量。 紫外吸收法测定基因组紫外吸收法测定基因组DNA的含量的含量 及纯度及纯度 【基本原理基本原理】 1紫外分光光度法测定核酸含量： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此， 可以用260nm波长进行分光测定DN
25、A浓度， 吸光度A值为1相当于大约50g /ml双链 DNA。 2紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白 质在280nm处有最大的吸收峰。 DNA纯品的A260/ A280为1.8（1.71.9），故 根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残 余蛋白质存在。 【操作步骤操作步骤】 1用TE缓冲液稀释样品（520倍）， 2用TE缓冲液调零点，样品稀释液转入紫外分光 光度计的石英比色杯石英比色杯中，分别测定其在260nm和 280nm的吸光度。吸光度在0.21.2 OD范围内较 为理想。 3计算浓度：
26、双链DNA样品浓度(g/l) =A260核酸稀释倍数 50/1000 4计算A260/ A280比值，分析纯度。 移液器的使用及注意事项移液器的使用及注意事项 1 1、 用途用途 2 2、 使用使用 2.1 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。根据取样量，选择合适的加样器。 5ul5ul、50ul50ul、500ul500ul，应选择哪个加样器，应选择哪个加样器? ? 顶部标有加样器的顶部标有加样器的最大量程最大量程， 分别为：分别为： 20ul: 0.520ul: 0.5 20 20 l l 100/200ul: 20100/200ul: 20 100/200 100/200 l l 10
27、00ul: 200ul1000ul: 200ul 1000 1000 l l 练习：加样器读数为练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少，实际体积各为多少? 移液器的调节移液器的调节 ( (1 1) )首先观察目前读数首先观察目前读数, ,假设为假设为050050: : 1000 1000 l: 500 l: 500 l l 100 100 l: 50 l: 50 l l 20 20 l l： 5 5 l l (2)(2)顺时针调节顺时针调节- 读数变小读数变小 逆时针调节逆时针调节- 读数变大读数变大 ( (3 3) )注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小注意：调节前加样器读数正处
28、于最大量程或最小 量程时量程时，如果向错误方向调节如果向错误方向调节，马上会超出量程马上会超出量程，将将 会损害加样器的精度会损害加样器的精度。 移液器使用步骤移液器使用步骤 6 6）( (吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒 流损坏加样器！流损坏加样器！) ) 贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体匀速匀速打出，加样器推到打出，加样器推到 第二挡。第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内. . 5 5）抬起加样器）抬起加样器, ,估计体积是否正确估计体积是否正确, ,将外壁液
29、体用容器口引流回将外壁液体用容器口引流回 去去 4 4）缓慢松开缓慢松开拇指拇指, ,吸取液体。松开过快，液体上吸取液体。松开过快，液体上 冲会腐蚀加样器冲会腐蚀加样器; ;完全放开拇指后，完全放开拇指后，停留约半秒停留约半秒 钟钟, , 急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。 3 3）将吸头插入液面下适当）将吸头插入液面下适当深度深度，过深可能会腐，过深可能会腐 蚀加样器蚀加样器, , 过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。 2 2）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到第一挡。第一挡。 1 1）选择加样器）选择加样器, ,观察读数观察读数, ,调节读数，吸头的安调节读数
30、，吸头的安 装要装要紧密紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一 定要再固定一下 实验二、实验二、 动物细胞蛋白质的提取和动物细胞蛋白质的提取和 含量测定含量测定 2014.9.27 主要内容 概述概述 实验目的实验目的 实验内容实验内容 实验原理实验原理 试剂与器材试剂与器材 操作流程操作流程 概述 蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最 重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能重要的组成部分。因此，对蛋白质的结构与功能 研究，是生命科学的核心问题。研究，是生命科学的核心问题。 要研究蛋白质的结构与功能，往往从细胞中提取要研究蛋白质的结构与功能，
31、往往从细胞中提取 蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质蛋白质开始，而对蛋白质含量的测定则是蛋白质 相关研究中的必备技术。相关研究中的必备技术。 蛋白质的定性、定量分析是临床诊断疾病蛋白质的定性、定量分析是临床诊断疾病 的最重要技术手段：比如体检血清白蛋白，的最重要技术手段：比如体检血清白蛋白， 甲胎蛋白水平。生物制品、食品质量检测甲胎蛋白水平。生物制品、食品质量检测 的手段，比如牛奶中总蛋白含量。因此，的手段，比如牛奶中总蛋白含量。因此， 对蛋白样品进行准确可靠的定性定量分析，对蛋白样品进行准确可靠的定性定量分析， 是一项非常重要的工作。是一项非常重要的工作。 蛋白质定性分析蛋白质定性分
32、析 (qualitative analysis) 确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在 的是何种蛋白质的是何种蛋白质 蛋白质定量分析蛋白质定量分析 (quantitative analysis) 确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋 白成分的含量白成分的含量 实验目的实验目的 学习掌握从动物样品中提取细胞总蛋白的 基本方法 掌握三种常用的蛋白质定量分析方法，并 了解各自的优缺点 实验内容实验内容 小鼠肝脏细胞蛋白质的提取 三种蛋白质含量的测定方法 实验原理实验原理 （一）小鼠肝脏细胞蛋白的提取（一）小鼠肝脏细胞蛋白的提取
33、1. 材料的选择：动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实材料的选择：动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实 验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料。 2. 提取方法的选择：采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提提取方法的选择：采用匀浆法将其破碎，然后加入样品提 取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。收集 上清液后可进行蛋白质定量分析。上清液后可进行蛋白质定量分析。 3.3.如何提取高质量的蛋白如何提取高质量的蛋白 蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生蛋白质提取中最常见的问题是目的蛋白质发生变性变性和被和被 蛋白酶降解
34、蛋白酶降解。 基本的防范措施：尽可能基本的防范措施：尽可能缩短提取时间缩短提取时间和在尽可能和在尽可能低温低温下下 提取。提取。 为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入为了防止蛋白酶的破坏，可在提取液中加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂。 例如例如: :加入苯甲磺酰氟（加入苯甲磺酰氟（PMSFPMSF）可以抑制丝氨酸蛋白酶和）可以抑制丝氨酸蛋白酶和 某些半胱氨酸蛋白酶；某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂，可抑制酸性蛋白，可抑制酸性蛋白 酶；乙二胺四乙酸（酶；乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）可抑制金属蛋白酶。）可抑制金属蛋白酶。 防止蛋白变性：防止蛋白变性： 为了防止蛋白质的巯基发生氧
35、化，可加入一定量的还原为了防止蛋白质的巯基发生氧化，可加入一定量的还原 剂如剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇巯基乙醇、二硫苏糖醇。 考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可考虑到溶液中如存在重金属离子（如铝、铜、铁离子）可 能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度能会与蛋白质形成不溶复合物，可在溶液中加入一定浓度 的的EDTAEDTA。 （二）蛋白含量的测定方法（二）蛋白含量的测定方法 蛋白质含量的测定方法有很多种蛋白质含量的测定方法有很多种 物理性质：物理性质：紫外分光光度法紫外分光光度法 化学性质：目前蛋白质的含量测定常用的方法有定氮法、化学性质：目前蛋白质的含量测定常用的方法
36、有定氮法、 双缩尿法（双缩尿法（Biuret法）、法）、Folin酚试剂法（酚试剂法（Lowry法）法） 染色性质：染色性质：考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法（Bradford法）法） 其中其中Bradford法和法和Lowry法灵敏度较高，比紫外吸收法灵法灵敏度较高，比紫外吸收法灵 敏高敏高1020倍，比倍，比Biuret法灵敏法灵敏100倍。倍。 测定方法的选择：测定方法的选择： 上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形上述这些方法并不能在任何条件下适用于任何形 式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法 测定，有可能得出几种不同的结果。每种测定法测定，
37、有可能得出几种不同的结果。每种测定法 都不是完美无缺的，都有其优缺点。都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵 敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在 的干扰物质；测定所要花费的时间。的干扰物质；测定所要花费的时间。 1. Lowry法法 首先在碱性溶液中形成铜首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这蛋白复合物，然后这 一复合物还原磷钼酸一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂磷钨酸试剂(Folin-酚试剂酚试剂)， 产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种
38、深蓝色 的复合物在的复合物在745 750 nm处有最大的吸收峰，处有最大的吸收峰， 颜色的深浅颜色的深浅(吸收值吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根与蛋白质浓度成正比，可根 据据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量的光吸收值大小计算蛋白质的含量 所需时间所需时间 40 min 优优 点点 一种可靠的蛋白质定量方法一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小不同蛋白质之间差别很小 缺缺 点点 某些试剂不稳定某些试剂不稳定 灵灵 敏敏 度度 5 ug/ml100 ug/ml 干扰物质多：干扰物质多：K+, Na+等离子，蔗糖，等离子，蔗糖， 甘油，甘油，EDTA等都影响测定等都影响测定 反
39、应速度慢反应速度慢 使蛋白质发生不可逆变性使蛋白质发生不可逆变性 2. 考马斯亮兰法考马斯亮兰法 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质染料，在酸性溶液中与蛋白质 结合，使染料的最大吸收峰的位置由结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精 氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在一定范围 内，考马斯亮兰内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物在蛋白质复合物在595 nm下，下，
40、 吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋 白质含量的测定。白质含量的测定。 优优 点点 快速（反应时间仅需快速（反应时间仅需3 min） 敏感，几乎没有蛋白质损失敏感，几乎没有蛋白质损失 缺缺 点点 用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性 灵灵 敏敏 度度 1 ug/ml10 ug/ml 由于不同蛋白的精氨酸和芳香族氨基酸的含由于不同蛋白的精氨酸和芳香族氨基酸的含 量不同，所以该方法测定不同的蛋白质会有量不同，所以该方法测定不同的蛋白质会有 偏差偏差 一些化合物干扰反应，比如一些化合物干扰反应，比如Triton
41、X-100, SDS, 0.1N的的NaOH 3. 紫外分光光度法紫外分光光度法 蛋白质中普遍含有酪氨酸蛋白质中普遍含有酪氨酸 与色氨酸，由于这两种芳与色氨酸，由于这两种芳 香族氨基酸分子中含有大香族氨基酸分子中含有大 键，它们在键，它们在280 nm紫外紫外 光附近有光吸收。光附近有光吸收。 因而使蛋白质在上述紫外因而使蛋白质在上述紫外 波长附近产生较强的光吸波长附近产生较强的光吸 收，利用蛋白质的这一特收，利用蛋白质的这一特 性可对其进行含量测定。性可对其进行含量测定。 芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收 优优 点点 快速快速 缺缺 点点 核酸可引起强干扰作用核酸可引起强干扰作用
42、 灵灵 敏敏 度度 相对较低相对较低 对蛋白质无破坏性（蛋对蛋白质无破坏性（蛋 白纯化实时监测）白纯化实时监测） 不是严格的定量，适用于测定蛋不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液测定白质粗提液测定 所需时间所需时间 几分钟几分钟 操作步骤操作步骤 1用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，小心用颈椎脱臼法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，小心 去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干 净。净。 2取小鼠肝组织取小鼠肝组织0.5 g，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。，在滤纸上剪碎，放入玻璃匀浆管中。 3按按1：15的比例往
43、玻璃匀浆管中加入匀浆缓冲液（即每份样的比例往玻璃匀浆管中加入匀浆缓冲液（即每份样 品需加预冷的提取缓冲液品需加预冷的提取缓冲液7.3mL，蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂0.2 mL），）， 手动匀浆。注意用力均匀，以免损坏匀浆管。手动匀浆。注意用力均匀，以免损坏匀浆管。 4匀浆完成后，取两只匀浆完成后，取两只1.5 mL eppendorf管，各加入管，各加入1.2 mL 匀浆液后，置入冷冻离心机中。匀浆液后，置入冷冻离心机中。 5于于4，13000 rpm离心离心20分钟后，小心取出上清液至分钟后，小心取出上清液至1.5 mL eppendorf管中，上清液需低温保存，作为待测样品备管中，上清液
44、需低温保存，作为待测样品备 用。用。 Lowry法法 取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，放置在支，标明号码，放置在 试管架，在试管架，在16号试管内分别加入标准牛血清白号试管内分别加入标准牛血清白 蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5 mg/mL） 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用双蒸水补足，用双蒸水补足 至每管总体积至每管总体积0.5 mL，在，在7、8号试管内分别加入号试管内分别加入 待测样品待测样品25、50 L，并用双蒸水补足至，并用双蒸水补足至0.5 mL （即将待测样品稀释（即将待测样品稀释20或或10倍倍）
45、。）。916号重复号重复 18号。号。 各管加入各管加入2.5 mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，新配制的碱性铜溶液，立即摇匀， 在室温下放置在室温下放置10min。 各管加入各管加入0.5 mL Folin酚试剂应用液，边加入边酚试剂应用液，边加入边 立即充分混合（用震荡混合器），然后在室温下立即充分混合（用震荡混合器），然后在室温下 放置放置3060min（不要超过（不要超过60min）。）。 将标准样品及待测样品在可见光光度计上在将标准样品及待测样品在可见光光度计上在550 nm波长下比色。波长下比色。 根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲
46、 线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查 出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏 提取液的蛋白质含量。提取液的蛋白质含量。 考马斯亮兰法测定蛋白质浓度考马斯亮兰法测定蛋白质浓度 取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，放置在支，标明号码，放置在 试管架，在试管架，在16号试管内分别加入标准牛血清白号试管内分别加入标准牛血清白 蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5 mg/mL） 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用双蒸水，用双蒸水 补
47、足至每管总体积补足至每管总体积0.1 mL，在，在7、8号试管内分别号试管内分别 加入稀释加入稀释20、10倍的待测样品倍的待测样品0.1 mL。916号号 重复重复18号。号。 每管加入考马斯亮兰每管加入考马斯亮兰G250染料试剂染料试剂3 mL, 摇匀，摇匀， 室温静置室温静置3分钟。分钟。 分光光度计于波长分光光度计于波长595nm比色。比色。 根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲根据已知含量的标准样品测得的吸光度做标准曲 线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查 出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏出其蛋白质含量。根据稀释倍数计算出小鼠肝脏 提取液的蛋白质含量。提取液的蛋白质含量。 紫外吸收法测定蛋白质浓度紫外吸收法测定蛋白质浓度 取取16 mm*150 mm试管试管16支，标明号码，放
