1、第第2 2课时课时 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用 第第1010单元单元 2022 内 容 索 引 01 02 必备知识必备知识 固本夯基固本夯基 核心考点核心考点 能力提升能力提升 必备知识必备知识 固本夯基固本夯基 一、培养基 1.概念:人们按照微生物对 的不同需求,配制出供其 的 营养基质。 2.营养组成:一般都含有 和无机盐。此外,还需要满足微 生物生长对 、 以及氧气的要求。 营养物质 生长繁殖 水、碳源、氮源 pH 特殊营养物质 3.种类 按照物理性质可分为 培养基、固体培养基。 按照成分的来源可分为天然培养基和 培养基。 按照功能用途可分为选择培养基、 培养基等。
2、液体 合成 鉴别 二、无菌技术 1.含义:在培养微生物的操作中,所有防止 的方法。 2.常用方法 杂菌污染 化学药物消毒 干热灭菌 湿热灭菌 外来杂菌 三、酵母菌的纯培养 1.步骤:微生物的纯培养包括 、灭菌、倒平板、 、 和培养等步骤。 2.倒平板 (1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程: 。 (2)乙中的灭菌方法是 。 (3)丁中的操作需要在 后才能进行。 配制培养基 接种 分离 丙乙甲丁 灼烧灭菌 培养基冷却凝固 3.接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面 的操作,将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。经数次划线后培养,可以分离得到 。 连续划线 稀释分散 单菌落 平板划线操作流
3、程: 灼烧 冷却 打开一条缝隙 三至五 末端 第一次 4.培养酵母菌 完成平板划线后,待菌液被培养基吸收,将接种后的平板和一个 的 平板倒置,放入 左右的恒温培养箱中培养2448 h。 未接种 28 四、微生物的选择培养和计数 1.筛选目的菌株的思路 类型 自然界中目的菌株的筛选 实验室中目的菌株的筛选 原理 根据目的菌株对 的 要求,到相应的环境中去寻找 人为提供有利于目的菌株 的 条件(包括营养、温度、pH等),同 时 其他微生物生长 实例 从热泉中筛选水生栖热菌提 取出耐高温的DNA聚合酶 从土壤中筛选出能分解尿素的细菌 生存环境 生长 抑制或阻止 2.稀释涂布平板法 9 等比 0.1
4、冷却 3.统计菌落数目 (1)方法:统计样品中微生物数量的方法有 和 。常用来统计活菌数目的方法是 。 (2)统计依据:当样品的 足够高时,培养基表面生长的一个单菌落, 来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数,就能推 测出样品中大约含有多少活菌。 稀释涂布平板法 显微镜直接计数法 稀释涂布平板法 稀释度 活菌 (3)操作 设置重复组,增强实验的说服力与准确性。为保证结果准确,一般选择菌 落数在 的平板进行计数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。因此,统计结果一般用 数表示。 30300 少 菌落 概念检测 1.实验室培养微生物,一方面要制备合适的培养基,另一方面要确保无杂菌 感
5、染。基于培养基的制备和无菌技术的认识,判断下列表述是否正确。 (1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,有时还需要加入一些特殊 的物质。( ) (2)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物,又减少消毒剂对细胞的伤害。 ( ) (3) 培养基中的营养物质浓度越高,对微生物的生长越有利。( ) 答案 (1) (2) (3) 2.基于酵母菌的纯培养的流程及原理,判断下列表述是否正确。 (1)倒平板就是等待培养基冷却凝固后,将培养皿倒过来放置。( ) (2)倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上。( ) (3)为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。( ) (4)将接种后的
6、平板和一个未接种的平板都放入恒温箱的目的是鉴定平板 是否生有杂菌。( ) 答案 (1) (2) (3) (4) 3.利用选择培养基对微生物进行筛选,采用稀释涂布平板法可以进行计数。 判断下列关于微生物的选择与计数的表述是否正确。 (1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。( ) (2)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法,而不能用平板划线法。( ) (3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源。( ) (4)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸 碱度降低。( ) (5)用稀释涂布平板法纯化酵母菌时,只要稀释度足够高,就能在培养基表 面形成单个菌落。(
7、) 答案 (1) (2) (3) (4) (5) 教材拓展 (人教版选择性必修3 P20“拓展应用”第2题改编) 材料1 地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨,其中40%60%能被 土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微 生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精,用纤维素酶处理服装 面料等。 材料2 已知刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成 红色复合物,但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我 们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红与纤维素形成红色复合 物;而当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物就无法形成,培养基中会出 现以
8、这些菌为中心的透明圈。 请根据材料回答下列问题。 1.从什么环境中去寻找纤维素分解菌?为什么? 提示 要在富含纤维素的环境中寻找。由于生物与环境的相互依存关系, 在富含纤维素的环境中,纤维素分解菌的含量相对较高,因此从这种环境中 获得目的微生物的概率要高于普通环境。 2.要从土壤中分离纤维素分解菌,请你给出实验方案。 提示 土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解 菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。 3.在分离纤维素分解菌的实验过程中,需要染色环节。有人提出两种染色 法:第一种是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应;第二种是在倒平 板时就加入刚果红。经讨论后认为使用第二种方法有缺点
9、,你是否认同? 说出你的理由。 提示 认同。使用第二种方法有两个明显缺点,产生淀粉酶的微生物也 产生模糊透明圈,有些微生物能降解色素,形成明显的透明圈,所以根据 透明圈的情况获得的纤维素分解菌的纯度不是100%。 核心考点核心考点 能力提升能力提升 考点一考点一 微生物的纯培养技术微生物的纯培养技术 合作探究合作探究 探究1进行纯培养需要根据微生物对营养物质的不同需求配制培养基 已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解,会造成环境污染。某 小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。 号培养基:在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。 号培养基:氯化钠(5 g/L),硝
10、酸铵(3 g/L),其他无机盐(适量),X(15 g/L)。 号培养基:氯化钠(5 g/L),硝酸铵(3 g/L),其他无机盐(适量),X(45 g/L)。 回答下列问题。 (1)在号培养基中,哪些成分为微生物提供氮源?、号培养基中为微 生物提供碳源的有机物是什么? 提示 号培养基中提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨;、号培养基为微 生物提供碳源的有机物是X。 (2)从物理状态分析,上述三个培养基属于哪种类型?实验室中最常用的是 哪种类型? 提示 从物理状态分析,三个培养基不含凝固剂(如琼脂)、呈液体状态,所 以属于液体培养基。在液体培养基中加入琼脂后制成的琼脂固体培养基, 是实验室中最常用的培养基之
11、一。 (3)若将土壤悬浮液接种在号液体培养基中,培养一段时间后,不能降解X 的细菌比例有什么变化?从功能分析,、号培养基属于哪种类型的培 养基? 提示 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖,而能降解X的细菌能够增 殖,因此不能降解X的细菌比例下降;、号培养基属于选择培养基。 归纳总结选择培养基与鉴别培养基的比较 种类 原 理 用 途 选择培 养基 依据某些微生物对某些物质或环境 条件的嗜好、抗性而设计 从众多微生物中分离出 所需的微生物 鉴别培 养基 依据微生物产生的某种代谢产物与 培养基中的特定试剂或化学药品反 应,产生明显的特征变化而设计 鉴别不同种类的微生物 探究2防止杂菌污染是微生物纯培
12、养的关键 在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。消 毒和灭菌工作主要包括两个方面:对操作的空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒;将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 (1)消毒和灭菌的原理、实质相同吗? 提示 二者的原理相同,都是使微生物的蛋白质变性,借此杀死微生物;实 质不同,灭菌可以杀死物体内外的全部微生物(包括芽孢和孢子),而消毒仅 杀死部分微生物。 (2)湿热灭菌和干热灭菌相比哪种效果更好?尝试分析原因。 提示 湿热灭菌效果好。蛋白质是生命活动的主要承担者,要杀死微生物, 首先要破坏蛋白质;加热可使蛋白质变性凝固,蛋白质的含水量越大,加热 时就
13、越易凝固,因此湿热灭菌效果好。 (3)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法,与煮沸消毒法相比, 这两种方法有什么优点? 提示 在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少。 探究3平板划线法和稀释涂布平板法是微生物纯培养的重要方法 采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上, 之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。如 图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析下 列问题。 (1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么? 提示 获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得图B效果的接种 方法为平板划线法。 (2)某同学在纯化土壤中
14、的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可 能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象? 提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种 环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼 烧灭菌。 (3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行?图B所示操作过程中需要灼烧 接种环几次? 提示 火焰附近存在着无菌区域。需要灼烧6次。 归纳比较平板划线法和稀释涂布平板法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 关键 操作 接种环在固体培养基表面 连续划线 系列的梯度稀释;涂布平板法操 作 注意 事项 每次划线前后均需灼烧接 种环 稀释度要足够高,为确保实验成功可 以增
15、加稀释度的范围 菌体 获取 在具有显著的菌落特征的 区域菌落中挑取菌体 在适宜稀释度的平板上的菌落中挑 取菌体 优点 可以观察菌落特征,对混 合菌进行分离 可以计数,可以观察菌落特征,可以分 离混合菌 缺点 不能计数 操作较麻烦,平板不干燥效果不好 名师点睛运用平板划线法的注意事项 (1)接种环的灼烧:第一次划线前,避免接种环上可能存在的微生物污染 培养基;再次划线前,杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种,使再次 划线的菌种直接来源于上次划线的末端;划线结束后,杀死接种环上残留 的菌种,避免菌种污染环境和感染操作者。 (2)接种环灼烧后,要冷却后才能接触菌液,以免温度太高杀死菌种。 (3)在进
16、行第二次及以后的划线操作时,要从上一次划线的末端开始划线。 (4)划线时用力要大小适当,防止用力过大将培养基划破。 考向突破考向突破 考向1 培养基的制备方法和无菌技术 1.在生物技术上常利用大肠杆菌制成“工程菌”。某生物小组的同学,利用 实验室提供的大肠杆菌品系及其他必要材料,对该品系大肠杆菌进行了培 养。请分析回答下列问题。 (1)微生物在生长过程中对各种成分的需求量不同,故制备培养基时各成分 要有合适的 。培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分 别为微生物提供 。 (2)配制培养基时,各种成分在溶化后分装前必须调节 ,接种前要进 行 处理。 (3)对培养基进行灭菌,应该采用的方法是 。 (4)在
17、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时,平板冷凝后,应将平 板 放置,这样做的目的是防止皿盖上的水珠落入 而造成污染。 (5)甲同学采用平板划线法接种,获得单个菌落后继续筛选,在每次划线之 前都要灼烧 ,他这样做的目的是 。 在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗? ,为什么? 。 (6)实验结束时,使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉,这样做的目 的是 。 答案 (1)浓度和比例 氮源和碳源、碳源 (2)pH 灭菌 (3)高压蒸汽灭 菌 (4)倒过来 培养基 (5)接种环 杀死上次划线结束后接种环上残留 的菌种 需要 防止接种环上残留的菌种对环境造成污染或感染操作者 (6)防止污染环境
18、解析 (1)培养基中各成分要有合适的浓度和比例,保证微生物既有充足的 营养,又不会因外界营养物质浓度过大而失水。淀粉提供碳源,而蛋白胨含 C、N等元素,既能提供碳源,又能提供氮源。(2)各种成分溶化后分装前要 调节pH,接种前对培养基灭菌,防止杂菌污染。(3)培养基灭菌用高压蒸汽 灭菌法。(4)倒平板时,平板冷凝后应倒置,否则皿盖上的水珠会落入培养 基造成污染。(5)每次划线前都要灼烧接种环,将上次划线残留的菌种杀死, 使细菌尽快分散成单个。操作结束后灼烧接种环是为了防止残留的菌种 污染环境或感染操作者。(6)使用过的培养基要彻底灭菌后再倒掉,否则培 养基中的微生物会污染环境。 归纳总结几种典
19、型微生物的营养及能量来源 微生物类型 碳 源 氮 源 能源 大肠杆菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物 硝化细菌 CO2 NH3 NH3 根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物 固氮蓝细菌 CO2 N2 光能 考向2 酵母菌的纯培养 2.自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精,科学家欲从果园的葡萄上或 土壤中分离筛选出这种酵母菌。请回答下列相关问题。 (1)获得纯净培养物的关键是 。实验室筛选 微生物的原理是 。 制备的酵母菌培养基在进行倒平板操作时,为防止培养皿盖上的冷凝水落 入培养基造成污染,应 。 (2)用平板划线法纯化菌株时,划线的某个平板培养后,第一划线区域的第 一条线上都不间断地长
20、满了菌落,第二划线区域的第一条线上无菌落,其他 线上有菌落,造成这种现象的原因可能是 。 (3)若要统计土样中的酵母菌数量,应采用稀释涂布平板法。在接种前,随 机取若干灭菌后的空白平板培养基培养一段时间,这样做的目的 是 。 (4)关于实验室培养和纯化酵母菌过程中的部分操作,下列说法正确的是 ( ) A.配培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行 B.倒平板时,倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖 C.划线接种时,灼烧接种环后立即进行再次划线 D.划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养 答案 (1)防止外来杂菌污染 提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制 或阻止其他微生物生长 将平板倒
21、置 (2)接种环灼烧后未冷却或划线未 从第一区域末端开始 (3)检测培养基平板灭菌是否合格 (4)D 解析 (1)获得微生物纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染。实验室筛 选微生物的原理是提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑制或阻止其他 微生物生长。制备的酵母菌培养基在进行倒平板操作时,为防止培养皿盖 上的冷凝水落入培养基造成污染,应将平板倒置。(2)在第二次及以后划线 时,总是从上一次的末端开始划线,这样做的目的是将聚集的菌种逐步减少 以获得单个菌落。划线的某个平板培养后,第一划线区域的第一条划线上 都不间断地长满了菌落,第二划线区域的第一条线上无菌落,其他划线上有 菌落,造成划线无菌落可能的
22、操作失误是接种环灼烧后未冷却或划线未从 第一区域末端开始。(3)接种微生物常用平板划线法和稀释涂布平板法,其 中只有稀释涂布平板法可以对微生物进行计数。在接种前,随机取若干灭 菌后的空白平板培养基先行培养一段时间,这样做的目的是检测培养基平 板灭菌是否合格。(4)配培养基不需要在酒精灯火焰旁进行,A项错误。倒 平板时,应立即盖上培养皿的皿盖,B项错误。划线接种时,灼烧接种环冷却 后进行再次划线,C项错误。划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱 中培养,D项正确。 考点二考点二 微生物的选择培养与计数微生物的选择培养与计数 合作探究合作探究 探究可利用选择培养基筛选出能够分解尿素的细菌 幽门螺
23、杆菌感染是急慢性胃炎和消化道溃疡的主要致病因素,该菌的代谢 类型是异养厌氧型,能将尿素分解为氮,在细胞周围形成“氨云”以保护细胞 免受胃酸侵蚀。某研究小组在患者体内采集样本并制成菌液后,进行分离 培养。实验基本步骤如下: 配制培养基灭菌、倒平板接种培养观察 请讨论分析下列问题。 (1)培养病人体内采集的样本要用到选择培养基。利用选择培养基筛选幽 门螺杆菌的原理是什么?尿素能否为幽门螺杆菌提供碳源? 提示 分离分解尿素的细菌的培养基中以尿素为唯一氮源,只有能合成脲 酶的微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能 分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,从而受到抑制,所以用此培养基
24、 就能够选择出幽门螺杆菌。尿素被幽门螺杆菌分解成NH3和CO2,幽门螺 杆菌的代谢类型是异养型,CO2不能被利用,因此尿素不能为其提供碳源。 (2)请尝试结合生物、化学等方面的知识提出鉴定尿素分解菌的思路。 提示 尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨,氨使培养基的碱性增强。 因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养一段时间后,若 指示剂变红,可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 (3)显微镜直接计数法也是一种常用的快速直观的测定微生物数量的方法。 利用该方法获得的结果准确吗?联系所学知识尝试改进。 提示 利用该方法获得的结果往往偏高。该方法利用特定的细菌计数板 或血细胞计数板,在显微镜下
25、观察、计数,统计的结果一般是活菌数和死菌 数的总和。可以用台盼蓝或亚甲基蓝等染色剂处理,根据细胞膜的选择透 过性原理,只有死菌被染色,计数时只统计不被染色的细胞即可。 名师点睛分离尿素分解菌的操作要点 (1)在实验操作中,每个步骤都要注意无菌操作,以防培养基被污染,影响实 验效果。 (2)样品稀释液的最佳浓度为培养后每个平板上有30300个菌落的浓度。 细菌一般选104、105、106倍稀释液进行培养,放线菌一般选103、104、105 倍稀释液进行培养,真菌一般选102、103、104倍稀释液进行培养。 (3)为排除非测试因素(培养基)的干扰,实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进 行空白对照。 (
26、4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板,作为重复实验,求其平均值, 若其中有菌落数与其他平板相差很大的,需要对该平板重新制作。 考向突破考向突破 考向1 微生物的筛选 1.(2020山东莱州一中月考)物质W是一种含氮有机物,W在培养基中达到一 定量时培养基表现为不透明。某小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌, 结果如图。下列说法错误的是( ) A.透明圈的形成是因为W物质被分解 B.所用的选择培养基应该是以物质W为唯一氮源 C.甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源 D.乙菌落中的细菌都能降解W,不需要进一步纯化 答案 D 解析 W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明,因此透明圈的
27、形 成是因为W物质被分解,A项正确;要筛选出能降解W的细菌,所用的选择培 养基应该是以物质W为唯一氮源,B项正确;该培养基以W物质为唯一氮源, 而甲菌落周围未出现透明圈,因此甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮 气作为氮源,C项正确;乙菌落中的细菌不一定都能降解W,因此仍需要进一 步纯化,D项错误。 归纳总结选择培养基四种常见制备方法或实例 考向2 微生物的计数 2.(2020江苏)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌 株,科研人员开展了相关研究。请回答下列问题。 (1)常规微生物实验中,下列物品及其灭菌方法错误的是 (填编 号)。 编号 物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器 灭
28、菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧 (2)称取1.0 g某土壤样品,转入99 mL无菌水中,制备成菌悬液,经 后,获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1 mL菌悬液涂布在固体培养基 上,其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落,则该样本中每 克土壤约含酵母菌 个。 (3)为了进一步提高酵母菌产酶能力,对分离所得的菌株,采用射线辐照进 行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源 的固体培养基上,培养一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选择直径 的菌落,纯化后获得A、B两突变菌株。 (4)在处理含油废水的同时,可获得单细胞蛋白,实现污染物资源化。为评 价A、B两菌株的相关
29、性能,进行了培养研究,结果如上图。据图分析,应选 择菌株 进行后续相关研究,理由是 。 答案 (1) (2)梯度稀释 4.6105(或460 000) (3)诱变 脂肪(或油脂) 较大 (4)B 该菌株增殖速度快,单细胞蛋白产量高;降解脂肪能力强,净化 效果好 解析 (1)微生物的实验室培养中,培养基一般用高压蒸汽灭菌,接种环、接 种针和涂布器一般用灼烧灭菌,培养皿用干热灭菌。(2)经梯度稀释可获得 细胞密度不同的菌悬液。将1.0 g土壤转入99 mL无菌水中,制备成菌悬液, 此时稀释100倍;取经10倍稀释的0.1 mL菌悬液涂布培养后平均长出了46 个酵母菌,此时共稀释10 000倍,可得样本中每克土壤约含酵母菌数为 4610 000=4.6105(个)。(3)题述育种过程采用射线照射,则为诱变育种; 因要筛选产脂肪酶酵母菌株,因此可将辐照处理后的酵母菌涂布在以脂肪 为唯一碳源的固体培养基上,该培养基只有能分解、利用脂肪的酵母菌才 能生存;菌落直径越大,说明分解、利用脂肪的能力越强,因此要筛选菌落 直径较大的菌株。(4)题图中曲线表明,在培养相同时间时,菌株B的细胞密 度较大,培养基中的脂肪剩余较少,可推断菌株B增殖速度快,单细胞蛋白产 量高,降解脂肪能力强,因此应选择菌株B进行后续相关研究。
