1、第第2节节 动动物细胞工程物细胞工程二二 动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术与单克隆抗体一、动物细胞融合技术概述一、动物细胞融合技术概述1.概念：概念： 使使两个两个或或多个多个动物细胞结合形成动物细胞结合形成一个细胞一个细胞的技术。的技术。2.结果结果： 形成的形成的杂交细胞杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.原理原理： 细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性5.意义意义： 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能 4.诱导融合的常用方法：诱导融合的常用方法： PEGPEG融合法、融合法、 电融
2、合法电融合法、 灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法。6.应用：应用：（1 1）细胞融合技术已经成为研究细胞融合技术已经成为研究细胞遗传细胞遗传、细胞免疫细胞免疫、肿肿瘤瘤和和培育培育生物新品种生物新品种等的重要手段等的重要手段。（2 2）利用动物细胞融合技术发展起来的利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术杂交瘤技术，为，为制制造单克隆抗体造单克隆抗体开辟了新途径开辟了新途径。相关信息相关信息1.“1.“灭活病毒灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？中灭活的具体含义是什么？ 用用物理或化学物理或化学手段使病毒或细菌手段使病毒或细菌失去感染能力失去感染能力，但，但并并不破坏它们的抗原结构不破坏它们的抗原结
3、构2.2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？ 病毒表面含有的病毒表面含有的糖蛋白和一些酶糖蛋白和一些酶能够与能够与细胞膜上的糖细胞膜上的糖蛋白发生作用蛋白发生作用，使细胞，使细胞互相凝聚互相凝聚，细胞膜上的，细胞膜上的蛋白质分子蛋白质分子和脂质分子重新排布和脂质分子重新排布，细胞膜打开细胞膜打开，细胞发生融合，细胞发生融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理细胞融合前的细胞融合前的处理方法处理方法诱导细胞融合诱导细胞融合的方法的方法细胞融合成功细胞融合成功的标志的标志主要主要用途用途意义意义细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性、
4、植植物细胞的全能性物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散胞分散成单个细胞成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇电融合法、离心法；聚乙二醇（PEGPEG）融合法、高）融合法、高CaCa2+2+- -高高pHpH融合法融合法PEGPEG融合法、电融合法、灭活融合法、电融合法、灭活病毒诱导法病毒诱导法再生出细胞壁再生出细胞壁细胞核的融合细胞核的融合获得完整的杂种植株获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交打破生殖隔离，实现
5、远缘杂交育种，培育植物新品种育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能远缘杂交成为可能2022-1-11动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备1.1.早期早期获得抗体的方法获得抗体的方法向动物体内反复注射某种抗原从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差缺点：2.单克隆抗体单克隆抗体(1)(1)概念：概念：化学性质单一、特异性强的抗体(2)(2)制备：制备：理论基础： 每一个B细胞只分泌一种特异性抗体。B淋巴细胞不能无限增殖 克隆单一的B淋巴细胞，得到的细胞群就能分泌出化学性质
6、单一、特异性强的抗体制备思路：困难：米尔斯坦米尔斯坦科勒科勒 由于发明了单克隆抗体由于发明了单克隆抗体的制备技术，米尔斯坦和的制备技术，米尔斯坦和科勒于科勒于19841984年获得了年获得了诺贝诺贝尔生理学或医学奖尔生理学或医学奖大胆设想：B淋巴细胞骨髓瘤细胞（能产生抗体）（能产生抗体） （能大量增殖能大量增殖）融合细胞融合细胞（既能产生抗体，又能（既能产生抗体，又能大量增殖大量增殖）单克隆抗体制备的过程：2022-1-11注射特定的抗原注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞从脾中提取B B淋巴细胞淋巴细胞多种多种骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合将骨髓瘤细胞与将骨髓瘤细胞与B B淋巴细
7、胞融合淋巴细胞融合能产生抗体，但不能大量增殖不能产生抗体，但能大量增殖PEGPEG融合法、融合法、电融合法、灭电融合法、灭活病毒诱导法活病毒诱导法单克隆抗体制备的过程：多种杂交细胞：多种杂交细胞：未融合的细胞未融合的细胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次筛选：第一次筛选： 用特定的选择培养基用特定的选择培养基在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）第二次筛选：第二次筛选： 克隆化培养、抗体检测克隆化
8、培养、抗体检测（可进行多次）（可进行多次）抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）（分泌的抗体能与特定抗原结合）每一个孔中尽量每一个孔中尽量只接种一个杂交只接种一个杂交瘤细胞瘤细胞克隆化培养克隆化培养多孔细胞培养板单克隆抗体制备的过程：抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）（分泌的抗体能与特定抗原结合）注射到小鼠腹腔内注射到小鼠腹腔内体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体从细胞培养液中提取从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取从小鼠腹水中提取第一次筛选第一次筛选第二次筛选第二次筛选原因原因方法方法结果结果诱导融合后
9、得到的细胞中，诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞融合的具有同种核的细胞由于小鼠在生活中还受到其他由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞能产生其他抗体的细胞用特定的选择培用特定的选择培养基进行筛选养基进行筛选用用9696孔板培养，在每一个孔中孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）
10、体检测（进行多次筛选）筛选获得杂交瘤细胞筛选获得杂交瘤细胞获得足够数量的能分泌获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞所需抗体的杂交瘤细胞两次筛选的比较两次筛选的比较2022-1-112022-1-11应用到的技术：应用到的技术：原理：原理： 细胞膜具有一定细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖的流动性、细胞增殖多种杂交细胞及多种杂交细胞及未融合的细胞未融合的细胞诱导诱导 融合融合多种多种特定特定提取提取用特定的选择性培养基用特定的选择性培养基克隆化培养、抗体检测克隆化培养、抗体检测既能迅速大量增殖，又能产生抗体从腹腔液中提取从培养液中提取（可进行多次）（可进行多次）动物细胞融合、动物细胞融合、动物
11、细胞培养动物细胞培养单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用资料资料1 1 用抗人绒毛膜促性腺激用抗人绒毛膜促性腺激素单克素单克隆抗体做成的隆抗体做成的“早早孕诊早早孕诊断试剂盒断试剂盒”。在妊娠第。在妊娠第8 8天就可天就可以作出诊断，这比原来的诊断方以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了法提前了10d10d左右，可以避免孕左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在方法检测的准确率在90%90%以上。以上。资料资料2 2 使用高效的细胞毒素类使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤药物进行化
12、疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素细胞。但细胞毒素没有特异性，没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体它在临床上的应用。抗体- -药物药物偶联物偶联物（antibody-antibody-drugconjugates, ADCdrugconjugates, ADC）通过将通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADCADC通常由抗体、接头和药物通常由抗体、接头和药物( (如细胞
13、毒素如细胞毒素) )三部分组成，它三部分组成，它的作用机制如下图所示。的作用机制如下图所示。抗体抗体药物药物接头接头ADCADC被细胞吞噬被细胞吞噬释放释放药物药物溶酶体裂解溶酶体裂解细胞细胞凋亡凋亡1.1.ADCADC的抗体和药物各具有什么作用？的抗体和药物各具有什么作用？讨论讨论 抗体主要发挥抗体主要发挥靶向运输作用靶向运输作用，即通过，即通过特异性结合靶细胞表面特异性结合靶细胞表面的抗原的抗原，将连接的，将连接的药物输送到靶细胞药物输送到靶细胞； 药物发挥治疗效应药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞，如杀伤靶细胞2.2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可
14、以作为ADCADC偶联的药物？偶联的药物？3.3.单克隆抗体诊断试剂盒和单克隆抗体诊断试剂盒和ADCADC在临床应用上各具有什么优势在临床应用上各具有什么优势？可以用可以用放射性同位素放射性同位素标记单克隆抗体进行标记单克隆抗体进行靶向放疗靶向放疗；一些一些作用于细胞信号转导通路的药物作用于细胞信号转导通路的药物可以通过可以通过阻断肿瘤细胞的信号通阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应单克隆抗体只与特定的抗原反应，
15、因此，因此检检测的特异性和灵敏度大大提高测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有，有利于利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；ADCADC能够能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用杀伤作用，因此它在临床上具有，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小靶点清楚、毒副作用小等优点等优点4.4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然单克隆抗体在临床上还有哪些应
16、用？你可以课后搜集资料，然后以后以“单克隆抗体在临床上的应用单克隆抗体在临床上的应用”为主题，出一期黑板报或制为主题，出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。作电子板报宣传相关知识。 单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B B细胞淋巴瘤；曲妥细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面，单克隆抗体被在临床诊断方面，单
17、克隆抗体被广泛用于广泛用于- -些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例，用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体，可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复这些抗体来对体内的肿瘤进行定位，辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。发与转移等。 单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，与特定抗原发生特异性结合，并
18、且并且可以大量制备可以大量制备。 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病三、单克隆抗体的应用三、单克隆抗体的应用1.1.单克隆抗体的优点：单克隆抗体的优点：2.单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用（1）广泛）广泛用作诊断试剂用作诊断试剂实例：实例：（2）运载药物运载药物： 如如ADC。（3）直接用于直接用于治疗疾病治疗疾病。实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对实例：利妥昔单抗（美罗华）是一种针对CD20CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被抗体，是第一个被FDAFDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20CD20分分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。杀死淋巴瘤细胞。
