1、-1-二二微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数学习目标1.理解选择培养基的概念和设计原理。2.学习利用稀释涂布平板法进行微生物的选择培养。3.利用实验探究土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。一、选择培养基1.自然界中目的菌的筛选(1)实例:聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶,就是从热泉中筛选出来的水生栖热菌中提取出来的。(2)依据:水生栖热菌能在7080 的高温条件下生存,而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 2.实验室中目的菌的筛选(1)原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。(2)方法:利用选择培养基分离。选择
2、培养基:允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。实例:选择分解尿素的细菌的培养基,以尿素作为唯一氮源,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,在培养基上生长。二、微生物的选择培养1.取样铲取土样,将样品装入纸袋中。2.稀释涂布平板法(1)系列稀释操作将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中,依次等比稀释。(2)涂布平板操作 3.培养与观察待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入3037 的恒温培养箱中培养12 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。预习反馈1.判断正误。(1)选择培
3、养基筛选出的微生物只有一种。( )(2)土壤样品稀释时不同的微生物应该选择不同的稀释度。( )(3)选择培养基上的菌落数目明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目,说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落。( )2.在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称作()A.鉴别培养基 B.加富培养基C.选择培养基 D.基础培养基答案C3.用来判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置的对照是()A.未接种的选择培养基B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C.相同条件下接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D.相同条件下接种了的选择培养基答案C解析 将菌液稀释相同的倍数并接种,相同培养条
4、件下牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目,因此,应选择接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循单一变量原则,所以牛肉膏蛋白胨培养基要与选择培养基在相同条件下接种、培养。三、微生物的数量测定1.稀释涂布平板法(1)原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)计数原则:一般选择菌落数为30300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目,通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求出平均值。(3)注意
5、事项:统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。因此,统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。2.显微镜直接计数法一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量,统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.土壤取样从酸碱度接近中性的潮湿土壤取样。先铲去表层土,在距地表约38 cm的土壤层取样。2.样品的稀释(1)选用一定稀释范围的样品液进行培养,保证获得菌落数为30300的平板进行计数。(2)第一次做实验
6、时,可以将稀释度的范围放宽一点。3.微生物的培养与观察(1)培养:不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。(2)观察:每隔24 h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 4.操作提示(1)涂布器的使用:将涂布器从酒精中取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后再灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃酒精。(2)无菌操作:取土样的用具在使用前都需要灭菌。操作完成后,一定要洗手。(3)做好标记:本实验使用的平板和试管比较多,为避免混淆,最好使用前就做好标记。(4)制订计划:本实验耗时较长,需要事先规划时间,以便提高实验效率。预习反馈1.判断正误。(1)只要培
7、养基中有尿素即可筛选出分解尿素的细菌。( )(2)统计样品中的活菌数目一般使用平板划线法。( )(3)选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数为30300适于计数的平板。( )2.分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐A.B.C.D.答案C解析要分离土壤中分解尿素的细菌,培养基中尿素应是唯一的氮源,不能加硝酸盐;在固体培养基上形成菌落,要加琼脂作凝固剂;分解尿素的细菌是异养微生物,要加有机碳源(如葡萄糖)。3.某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234个,那么每毫升样品中菌落数是(涂布平
8、板时所用稀释液的体积为0.1 mL)()A.2.34108个B.2.34109个C.234个D.23.4个答案B解析平板上菌落数的平均值稀释倍数涂布液体积=每毫升样品中的菌落数,即2341060.1=2.34109(个)。探究点一探究点二选择培养基选择培养基情境导引什么样的培养基能把土壤中分解尿素的细菌筛选出来?要把某种微生物从众多微生物中筛选出来,就要利用其代谢特点选择合适的培养基。下面是分离土壤中分解尿素的细菌使用的选择培养基配方,请分析回答问题。KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后,用蒸
9、馏水定容到1 000 mL探究点一探究点二1.在该培养基的配方中,为微生物提供碳源的是,提供氮源的是。 答案葡萄糖尿素2.绝大多数微生物都能利用葡萄糖,但是,只有能合成脲酶的微生物才能利用。 答案尿素3.分析该培养基的配方,该培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有,又是如何进行选择的?答案具有。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离到能产生脲酶的微生物(即能分解尿素的微生物)。探究点一探究点二4.判断选择培养基是否具有筛选作用,还需同时接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行培养,观察同一稀释度的菌液接种的,进行对比得出结论。 答案两种培养基上菌落的数目(其他条件相同且适宜)探究点一探究点二归纳提升1.
10、选择培养基的选择作用(1)原理:根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。探究点一探究点二方法特点举例一利用营养缺陷进行的选择培养通过控制培养基的营养成分,使营养缺陷的微生物不能正常生长缺乏氮源时可以分离固氮微生物二利用某种化学物质进行的选择培养在完全培养基中加入某些化学物质,利用加入的化学物质对微生物产生的影响,抑制某些微生物,同时选择所需的微生物加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌三利用培养条件进行的选择培养改变微生物的培养条件将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物(2)三种方法的比较 探究点一探究点二特别提醒 能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目
11、的菌。原则上选择培养基只允许特定种类的微生物生长,但实际上,微生物的培养是一个非常复杂的问题,有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖,因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物,还需进一步的鉴定。2.尿素分解菌的鉴定在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成了NH3。NH3会使培养基的碱性增强,pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将变红,则可初步说明该种细菌能够分解尿素。探究点一探究点二典例剖析选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物,通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培
12、养基,可从土壤中分离出的微生物依次是()A.硝化细菌、放线菌、根瘤菌B.根瘤菌、青霉菌、固氮菌C.异养细菌、放线菌、硝化细菌D.自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌答案D解析不含有机物的培养基可以选择自养微生物,缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物,含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。探究点一探究点二活学活练分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是()注 “+”表示加入,“-”表示不加答案C解析分离土壤中分解尿素的细菌,培养基中要有碳源,且以尿素作为唯一的氮源,故不能添加硝酸盐。选项尿素琼脂葡萄糖硝酸盐A+B-C+-D+-+探究点一探究点二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土
13、壤中分解尿素的细菌的分离与计数情境导引给你一把无菌铁铲,到哪里去取土样能得到分解尿素的细菌?统计菌落数目时应注意什么?下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图,请结合教材提供的资料分析回答问题。探究点一探究点二样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图 探究点一探究点二1.请完善下列实验流程。取样:从肥沃、湿润的土壤中,用铁铲铲去表层土,迅速取土壤并装入纸袋密封 配制:制备以为唯一氮源的选择培养基 的稀释:在旁称取土壤10 g,放入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,振摇使土样与水充分混合,将菌分散。制成101倍土壤稀释液,从中吸取1 mL 土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中,吹吸三次,
14、充分混匀,制成102倍土壤稀释液,以此类推,制成103,104,105,106倍土壤稀释液 探究点一探究点二取样:取9个上述选择培养基分成组,并做好,然后分别从,倍的三种土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已做好标记的平板中,用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀 培养观察:将培养基平板倒置于的恒温培养箱中培养12 d,每隔24 h统计一次菌落数目,选取菌落数目时的记录作为结果 答案土壤无菌无菌培养基尿素样品火焰涂布3标记1041051063037 稳定探究点一探究点二2.请设计记录和计数的表格,以便进行结果统计。提示探究点一探究点二3.该实验是用法进行计数的。 (1)该方法在同一稀释度下,至
15、少涂布3个平板作为重复组。分析结果时,需考虑重复组的结果,如果结果差异太大,则意味着操作有误,需要重新实验。 (2)为了保证结果准确,一般选择菌落数为的平板进行计数。 答案稀释涂布平板是否一致303004.除上述方法外,细菌的计数还可用法等。 答案显微镜直接计数探究点一探究点二特别提醒 实验设计原则(1)设立重复组:统计某一稀释度下平板上的菌落数时,要至少涂布3个平板作重复组,以增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组:判断选择培养基中是否有杂菌污染,需同时将未接种的选择培养基进行培养;判断选择培养基是否具有筛选作用,需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落
16、数目,进行对比得出结论。探究点一探究点二归纳提升1.统计菌落数目的方法微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法,但是一般使用计数法,计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示。探究点一探究点二项目直接计数法间接计数法(稀释涂布平板法)原理利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察计数,计算一定体积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板培养基计数数据菌体本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌
17、缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂,有一定误差探究点一探究点二2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数结果分析与评价 内容现象结论有无污染的判断对照的培养基中无菌落生长 未被杂菌污染培养物中菌落数偏高培养物中混入其他氮源菌落形态多样,菌落数偏高被杂菌污染选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目为30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样,统计结果应接近探究点一探究点二3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较(1)单菌落的获得利用平板划线法接种时,单菌落从后划线的区域挑取;利用稀释涂布平板法接种时,只有
18、合适的稀释度才能得到单菌落。(2)两种接种方法的应用两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单菌落,达到分离纯化微生物的目的;稀释涂布平板法还能对微生物进行计数,而平板划线法不能用于微生物的计数。探究点一探究点二易错提醒稀释涂布平板法的注意事项(1)稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要,所出现的平均菌落数在50个左右的为最好。(2)在设计实验时,一定要涂布至少3个平板作为重复组。(3)在分析结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致,如果差别过大,则意味着操作有误,需要重新实验。探究点一探究点二典例剖析(多选)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错
19、误的是()A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管中的10倍B.5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7106个C.当样品稀释度足够高时,一般平板上一个单菌落来源于一个活菌D.某一稀释度下至少涂3个平板,该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目高探究点一探究点二答案BD解析4号试管中稀释液的稀释倍数比5号试管的低10倍,如果稀释倍数适当,平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍,A项正确;5号试管进行稀释涂布平板计数的结果表明,每克土壤中的菌株数为(168+175+167)31060.1=1.7109(个),B项错误;当样品稀释度足够高时,一般平板上一个单菌落来源于一个活菌,C项正确;稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞连在一起长成一个菌落的情况,所以该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低,D项错误。探究点一探究点二活学活练在做分离分解尿素的细菌实验时,从对应106培养基上A同学筛选出大约150个菌落,而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有()土样不同培养基被污染操作失误没有设置对照A.B.C.D.答案A解析土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果,对照的设置对实验结果没有影响。
