1、第第2节节 微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用二二 微生物的选择培养和计数微生物的选择培养和计数一、选择培养基一、选择培养基1.1.概念：概念： 在微生物学中，将在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长允许特定种类的微生物生长，同时，同时抑制抑制或阻止其他种类微生物生长或阻止其他种类微生物生长的培养基称为的培养基称为选择培养基选择培养基2 2. .原理：原理： 人为提供人为提供_的条件（包括的条件（包括_、_和和_等），同时等），同时_。有利于目的菌生长有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长抑制或阻止其他微生物的生长营养营养温度温度pHpH3 3. .举例：举例：（1 1）利用利
2、用改变培养条件改变培养条件进行选择培养。进行选择培养。70708080的高温的高温分离耐高温的水生栖热菌分离耐高温的水生栖热菌使用使用将将pHpH调至酸性调至酸性的培养基的培养基分离耐酸菌分离耐酸菌（2 2）利用利用营养条件营养条件进行选择培养进行选择培养不加碳源（含碳有机物不加碳源（含碳有机物）的培养基的培养基分离出自养型微生物分离出自养型微生物不加氮源的培养基不加氮源的培养基分离出固氮菌分离出固氮菌（3 3）利用利用添加某种化学物质添加某种化学物质进行选择培养进行选择培养加入青霉素加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计 尿素尿素CO(
3、NH2)2CO(NH2)2含氮量高，化学性质含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素尿素施入土壤后，会施入土壤后，会被土壤中被土壤中的的某些细菌分某些细菌分解成解成NH3NH3，再被转化为，再被转化为NO3-NO3-、NH4+NH4+等被植物吸等被植物吸收收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3NH3，NH3NH3可以作为细菌生长的氮源。可以作为细菌生长的氮源。讨论：讨论：1.1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿
4、素如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 在选择培养基中，在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖生长发育繁殖2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养1.1.方法：方法：稀释涂布平板法稀释涂布平板法2.2.操作
5、流程操作流程铲取土样，将铲取土样，将样品装入纸袋中样品装入纸袋中将将10g10g土样加入盛有土样加入盛有90mL90mL无菌水无菌水的锥形瓶中，充分的锥形瓶中，充分摇匀摇匀，制成，制成菌液菌液。取取1mL1mL上上清液加入盛有清液加入盛有9mL9mL无菌水无菌水的的试管中，试管中，依次等比稀释依次等比稀释。1101107 71101105 51101106 61101103 31101102 21101104 49mL9mL无菌水无菌水11011090mL90mL无菌水无菌水1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL取取0 0. .1mL1mL菌液，菌液，滴加到（
6、选择）滴加到（选择）培养基培养基表面表面。将涂布器将涂布器浸在浸在盛盛有有酒精酒精的烧杯中。的烧杯中。将涂布器放在将涂布器放在火焰上灼火焰上灼烧烧，待酒精，待酒精燃尽燃尽、涂布器、涂布器冷却冷却后，再进行涂布后，再进行涂布用用涂布器涂布器将菌液将菌液均匀均匀地地涂布涂布在培在培养基表面。涂布时养基表面。涂布时可转动培养皿可转动培养皿，使涂布均匀。使涂布均匀。注意事项：注意事项：10g10g土样土样加入盛加入盛有有90mL90mL无菌水中后，无菌水中后，已稀释已稀释1010倍倍，在计算，在计算时，不要忽略；时，不要忽略；由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌由于使用的是选择培养基，所
7、以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖来生长繁殖，所以还需要进一步验证；，所以还需要进一步验证；过程中所有操作都应在过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁进行；进行；将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。的烧杯中，以免引燃酒精。 待涂布的菌液被待涂布的菌液被_后，将平板后，将平板_，放入，放入_中培
8、养中培养_d_d，在涂布有，在涂布有_菌液的平板菌液的平板上就可以观察到分离的上就可以观察到分离的_；培养基吸收培养基吸收倒置倒置恒温培养箱恒温培养箱1-21-2合适浓度合适浓度单菌落单菌落 稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目；样品中活菌的数目；三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定间接计数法间接计数法1.1.稀释涂布平板法稀释涂布平板法（1 1）原理：原理： 当样品的稀释度足够当样品的稀释度足够_时，培养基表面生长的一个时，培养基表面生长的一个_，来，来源于源于_中的一个中的一个_；通过；通过计数平板上的计数平板上的
9、_数，就能推测出样数，就能推测出样品中大约含有多少品中大约含有多少_；高高菌落菌落样品稀释液样品稀释液活菌活菌菌落菌落活菌活菌（2 2）计数原则计数原则选择菌落数为选择菌落数为_的平板计数的平板计数30-30030-300同一同一稀释度下，应稀释度下，应至少至少对对_个平板进行重复计数，然后求个平板进行重复计数，然后求出出_；3 3平均值平均值样品的样品的_将直接影响平板上的菌落数目；将直接影响平板上的菌落数目；稀释度稀释度（3 3）结果分析结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目统计的菌落数往往比活菌的实际数目_； 原因：原因：_ _ _统计结果一般用统计结果一般用_而不是用活菌数来表示；
10、而不是用活菌数来表示；少少当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落只是一个菌落菌落数菌落数（4 4）计算公式：计算公式：每每g g样品中的菌落数样品中的菌落数(C(CV)V)M MC C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)(mL)M M代表稀释倍数代表稀释倍数2 2. .显微镜直接计数显微镜直接计数直接计数法直接计数法（1 1）方法方法： 利用特定的利用特定的_或或_在在_下下观察、计数，然后再计算观察、计数，然后再计算_
11、的样品中微生物的数量；的样品中微生物的数量；细菌计数板细菌计数板血细胞计数板血细胞计数板显微镜显微镜一定体积一定体积血细胞计数板常用于血细胞计数板常用于_等的计数等的计数相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子细菌计数板可对细菌计数板可对_进行观察和计数；进行观察和计数；细菌等较小的细胞细菌等较小的细胞（2 2）优点：）优点：快速直观快速直观（3 3）缺点：）缺点：统计统计的的结果一般是活菌数和死菌数的总和结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌不能区分死菌与活菌与活菌。个体小的细菌个体小的细菌在显微镜下在显微镜下难以观察难以观察。四、四、探究实践：探究实践：土壤中分解
12、尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.1.提出问题（提出问题（实验目的实验目的）（1 1）从土壤中）从土壤中分离分离出能够分解尿素的细菌出能够分解尿素的细菌。（2 2）统计每克土壤样品中究竟含有）统计每克土壤样品中究竟含有多少多少这样的细菌这样的细菌。2.2.实验原理实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成但是只有能合成_的微生物才能分的微生物才能分解尿素，利用解尿素，利用_的的_培养基，可以从土壤中分离出培养基，可以从土壤中分离出_的细菌。的细菌。组分组分含量含量KHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaNa2 2HPOH
13、PO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2g0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素1.0g1.0g琼脂琼脂15.0g15.0gH H2 2O O定容至定容至1000mL1000mL脲酶脲酶以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源选择选择分解尿素分解尿素CO(NHCO(NH2 2) )2 2+H+H2 2O O脲酶脲酶2 2NHNH3 3+CO+CO2 23.3.实验步骤实验步骤（1 1）土壤取样）土壤取样取样地点要求：取样地点要求： 酸碱度接近中性的潮湿土壤酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环细菌适宜在该环境中生长境中生长。取样过程：取样过程： 铲去铲
14、去表表层层土土（一般（一般3cm3cm左右）左右）。细菌绝大部分分细菌绝大部分分布在距地表布在距地表3 38cm8cm的土壤层的土壤层。注意事项：注意事项： 取土样时用的取土样时用的铁铲和取样袋铁铲和取样袋在使用前都在使用前都需要灭菌需要灭菌。操作完成后，操作完成后，一定要洗手一定要洗手。（2 2）制备培养基）制备培养基选择培养基：选择培养基：以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素1.0g1.0gKHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaNa2 2HPOHPO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O 0.2g0.2g琼脂琼脂15.
15、0g15.0g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用有选择作用（3 3）样品的稀释与涂布平板）样品的稀释与涂布平板 （稀释涂布平板法稀释涂布平板法） 测细菌时，一般选用测细菌时，一般选用10104 4、10105 5、10106 6倍稀释的稀释液进倍稀释的稀释液进行平板培养行平板培养 在初次实验中，对于稀在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，释的范围没有把握，应应选择选择一 个 比 较 宽 的 范 围 ， 将一 个 比 较 宽 的 范 围 ， 将1 110103 31 11010
16、7 7倍稀释倍稀释的稀的稀释液分别涂布到平板上培养，释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数以保证能从中选择出菌落数在在3030300300的平板进行计数的平板进行计数。每个浓度至少设置每个浓度至少设置4 4个平板，个平板，1 1、2 2、3 3平板是选择培养基（平板是选择培养基（实验组，三个重实验组，三个重复复），），4 4为牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏蛋白胨培养基 （用以判断选择培养基是否具有选择作用）（用以判断选择培养基是否具有选择作用）如何如何验证培养基中是否含有杂菌？验证培养基中是否含有杂菌？设置设置2 2个平板作为对照：个平板作为对照： 不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白
17、胨培养基不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基注意事项：注意事项： 本实验使用的平板和本实验使用的平板和试管较多，为了避免混试管较多，为了避免混淆，最好在使用前淆，最好在使用前做好做好标记标记。例如，在标记培。例如，在标记培养皿时应该注明养皿时应该注明组别组别、培养日期培养日期和平板上培养和平板上培养样品的样品的稀释度稀释度等。等。（4 4）微生物的培养与观察）微生物的培养与观察培养条件：培养条件： 不同种类不同种类的微生物，往往需要的微生物，往往需要不同不同的培养的培养温度温度和培养和培养时间时间。（细菌（细菌一般在一般在30-3730-37的温度下培养的温度下培养1-2d1-2d）观
18、察：观察： 每隔每隔24h24h统计一次菌落数目，选取菌落数目统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定稳定时的记录时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）（5 5）结果分析）结果分析现象现象分析分析未涂布培养基上无菌落生长未涂布培养基上无菌落生长未涂布培养基上有菌落生长未涂布培养基上有菌落生长牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目培养基未被杂菌污染培养基未被杂菌
19、污染培养基被杂菌污染培养基被杂菌污染选择培养基具有选择作用选择培养基具有选择作用2022-1-12结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。选出一些菌落。你是否获得了某一稀释度下菌落数为你是否获得了某一稀释度下菌落数为3030300300的平板的平板? ?在这一稀释度在这一稀释度下，是否至少有下，是否至少有2 2个平板的菌落数接近个平板的菌落数接近? ?你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少? ?与其他同学与其他同学统计的结果接近吗统计的结果接近吗?
20、 ?如果差异很大，可能是什么原因引起的如果差异很大，可能是什么原因引起的? ? 如果没有接种的培养基上如果没有接种的培养基上没有菌落生长没有菌落生长，说明说明培养基没有被杂菌污染培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于明显多于选择培养基上的菌落数，说选择培养基上的菌落数，说明明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。 如果得到了两个或多个菌落数为如果得到了两个或多个菌落数为3030300300的平板，说明稀释度合适，操的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。作比较成功，能够进行菌落的计数。 如果是
21、用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从要从操作是否规范、培养基配制是否合理操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。等方面查找原因。可以观察可以观察菌落周围是否出现红色环带，菌落周围是否出现红色环带，红色环带红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强强。（5 5）进一步探究进一步探究分解尿素细菌的进一步鉴定分解尿素细菌的进一步鉴定原理：原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解为细菌合成的脲酶将尿素分解为氨氨，氨会使培养基的，氨会使培养基的碱性碱性增强增强，pHpH升
22、高，因此可以通过升高，因此可以通过检测培养基检测培养基pHpH的变化的变化来判断是否来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。方法：方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂酚红指示剂，培养，培养某种细菌后，如果某种细菌后，如果pHpH升高升高，指示剂将，指示剂将变红变红：液体培养基：液体培养基：可以直接看液体的变色情况；可以直接看液体的变色情况；固体培养基：固体培养基：平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法纯化原理纯化原理接种工具接种工具单菌落的获得单菌落的获得用途用途接种效
23、果图接种效果图相同点相同点通过连续划线的操作，将通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落的表面，进行培养，以得到单菌落接种环接种环涂布器涂布器从最后划线的区域挑取从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落用于计数分离纯化菌种，获得单菌落用于计数都能分离纯化菌种；都是在固体培养基上进行的都能分离纯化菌种；都是在固体培养基上进行的2022-1-12两种纯培养方法的比较两种纯培养方法的比较
