1、3.2.2 DNA3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置PCR仪仪变性：变性：90909595复性：复性：55556060延伸：延伸：70707575变性变性复性复性延伸延伸探究-实践DNADNA片段的扩增及电泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定（一）基础知识-PCR变性变性 （90-9590-95）复性复性延伸延伸5 5 5 5 （55-6055-60）（70-7570-75）PCR PCR 的一轮扩增的一轮扩增动态动态1.1.变性：变性：目的基因目的基因DNADNA受热变性，解链为单链；受热变性，解链为单链；2.2.复性：复性：引物与单链互补结
2、合；引物与单链互补结合；3.3.延伸：延伸：合成链在合成链在DNADNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。1 1、DNADNA体外扩增的原理体外扩增的原理 PCR利用了利用了DNA热变性原理，热变性原理，DNA半保留复制原理，半保留复制原理，通过调通过调节温度来控制节温度来控制DNA双链的解聚与结合。双链的解聚与结合。（二）实验原理 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历一般要经历30次循环。次循环。2 2、DNADNA片段电泳鉴定的原理片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的分子具有可解离的基团
3、，在一定的PH下，这些基团可以下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳电泳。 PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 在凝胶中在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大分子的大小和构像等有关。凝胶中的小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。的紫外灯下被检测出来。2、DNA片
4、段电泳鉴定的原理的说明： 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负
5、电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。2、DNA片段电泳鉴定的原理的说明： 电泳缓冲液类似色素提取的层析液，点样孔通常位于电极的负极端，由于DNA分子在缓冲液中带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动，从而分离出大小不同的DNA片段。2、DNA片段电泳鉴定的原理的说明： 已知大小的正对已知大小的正对照照DNADNA 凝胶中的DNA分子通过染色，在波长为300nm的紫外灯下才能被检测出来。（三）目的要求1、了解PCR和电泳鉴定的基本原理2 2、尝试进行、尝试进行PCRPCR的基本操作并用电泳鉴定
6、的基本操作并用电泳鉴定PCRPCR的产物的产物（四）材料用具 PCRPCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头 电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 4 4种脱氧核苷酸的等量混合液、种脱氧核苷酸的等量混合液、2 2种引物种引物 TaqDNA TaqDNA聚合酶、模板聚合酶、模板DNADNA、扩增缓冲液、无菌水、扩增缓冲液、无菌水、 电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、 琼脂糖和核酸染料等琼脂糖和核酸染料等琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置PCR仪仪PCR反应体系的配方反应体系的配方10倍浓缩的扩增
7、缓冲液5ul20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l 的引物I2.5ul20umol/l 的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶1-2U模板DNA 5-10ul总体积50ul注：模板注：模板DNA的用量为的用量为1pg-1ug（五）方法步骤：1.1.用微量移液器按照用微量移液器按照PCRPCR反应体系配方或反应体系配方或PCRPCR试剂盒的试剂盒的 说明书，在微量移液管中依次加入各组分。说明书，在微量移液管中依次加入各组分。2待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量 离心管放入离
8、心机里，离心约离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在，使反应液集中在 离心管的底部离心管的底部3参照下表的参数，设置好参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装仪的循环程序。将装 有反应液的微量离心管放入有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。仪中进行反应。循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性940C，5min30 次次 940C, 30s550C, 30s720C，1min最后一次最后一次940C，1min550C, 30s720C，1min4根据待分离根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂 糖溶液，一般配制质量体积
9、比糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。的琼脂糖溶液。 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后， 加入适量的核酸染料混匀。加入适量的核酸染料混匀。5将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小 的梳子，以形成加样孔。的梳子，以形成加样孔。6待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入 电泳槽内。电泳槽内。说明：电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷， 梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极。7. 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓
10、冲液没过凝胶将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm 为宜。为宜。8. 将扩增得到的将扩增得到的PCR产物与产物与凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液（内含指示剂）（内含指示剂） 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔 内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。类似层析液10. 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。9. 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电 压，一般为压，一般为1-5V/cm。待指示
11、剂前沿迁移接近凝胶边缘时，。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时， 停止电泳。停止电泳。（六）注意1.为避免外源为避免外源DNA等因素的污染，等因素的污染，PCR实验中使用的微量离实验中使用的微量离 心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装 成小份，并在成小份，并在-200C储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出， 放在冰块上缓慢融化。放在冰块上缓慢融化。（速溶会破坏缓冲液成分）（速溶会破坏缓冲液成分）3在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器上的枪头都必须更换。移液器上的枪头都必须更换。4在进行操作时，一定要戴好一次性手套。在进行操作时，一定要戴好一次性手套。（七）结果分析与评价1你是否成功扩增出你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？片段？判断的依据是什么？2你进行电泳鉴定的结果是几条条带？你进行电泳鉴定的结果是几条条带？ 如果不止一条条带，请分析产生这个如果不止一条条带，请分析产生这个 结果的可能原因。结果的可能原因。
