1、定量检验的分析性能验证定量检验的分析性能验证 浙江省立同德医院王 伟引言 依据卫生部医疗机构临床实验室管理办法第三十条款 CNAS-CL02：2008医学实验室质量和能力认可准则（IOS15189:2007）第5.5条款 实验室应对方法学进行评价，以检查其分析性能和对预期用途的适用性。 CNAS-CL02：医学实验室质量和能力认可准则（IOS15189:2012,IDT）第5.5条款 检验程序的性能特征宜包括：测量正确度、测量准确度、测量精密度(含测量重复性和测量中间精密度)、测量不确定度、分析特异性（含干扰物）、分析灵敏度、检出限和定量限、测量区间、诊断特异性和诊断灵敏度why为什么要做性能
2、验证？ 性能验证是为了确保实验室开展的检验项目，所应用的检测系统的分析性能或检验项目的方法学(检验程序)能够满足检测及临床要求，从而保证患者标本检测结果准确可靠。进行性能验证的场所 按照实验室管理办法和认可准则的要求，医疗机构临床实验室应承担所开展检验项目的性能验证工作。 wherewhen何时需要做性能验证？ 以下情况应完成初次性能验证： 新安装的仪器拟开展的项目；新开展项目；同一项目的试剂变更厂家或检验方法发生变更时；仪器校准、发生故障维修后或更换主要的配件后，可能对结果产生较大的影响时，可选择其所开展的部分检验项目进行分析性能验证。 when 初次验证后，对精密度、正确度及可报告范围等性
3、能参数至少每12个月进行一次评估，可通过评估如CV、均值等室内质控数据的变化趋势（批间精密度）、室间质评项目的结果的可接受性（正确度）、临床医护人员对结果的反馈（可报告范围）、小样本的验证等多种方式进行。若评估的结果不可接受，则需重新进行性能验证。哪些人员可以进行性能验证试验? 性能验证试验应由实验室有资质的检验人员完成，必要时可由技术支持人员协助完成试验；而性能验证报告必须由资深的检验人员完成，并经科室主任审核后归档保存。who性能验证包括哪些方面 定量项目性能验证的内容包括但不限于：精密度（批内、批间）；正确度；检测低限（灵敏度）；携带污染率；线性范围；可报告范围；生物参考区间；检验结果量
4、值溯源；测量不确定度；等。 what如何实施性能验证？ 准备工作 范围、材料、方案：应确定定量检测的项目；所需的仪器、配套试剂、校准品、质控品等材料；制定完整的性能验证方案（尤其是各项性能参数的判断标准的制定及其依据）。 how 试验要求： 仪器应进行校准或保养；要尽可能在相同条件下进行各项试验；所有试验均需在室内质控结果在控的情况下方可进行。 性能验证试验 对于配套系统，一般验证以下内容 准确度-EP-15 精密度-EP-5 可报告范围-EP-6 参考区间-C28-A2 对于非配套系统，内容更多 一、精密度试验精密度试验 在规定条件下，多次重复测定同一量时各测定值之间彼此相符合的程度 包括：
5、重复性、再现性、中间精密度、实验室内精密度精密度试验 在规定条件下，多次重复测定同一量时各测定值之间彼此相符合的程度 包括： 重复性(repeatability) 中间精密度(intermediateprecision) 重现性(reproducibility) 实验室内精密度（within-labprecision) 中间精密度中间精密度: 简单地说中间精密度是处于重复性条件与再现性条件之间的条件下得到的精密度。 实验室内精密度：实验室内精密度： 同一实验室内，使用同样的设备，由不同操作者在不同时间内获得的精密度，以前曾被称为总精密度（不包括大的设备维护、仪器校准和更换试剂批号） 文件依据
6、CLSI （原NCCLS）颁布的EP5-A2文件定量测量方法的精密度性能评价-批准指南第二版 用于评估试验的样品 一般常采用临床实验室收集的稳定和冷冻贮存的血清(浆)库;当实验室收集的样品不稳定或不易得到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品，如厂家的校准品和质控品。一般采用日常工作中的室内质控品。 样品浓度 评估精密度时，建议评估高低二个浓度的精密度。当二个浓度的精密度有显著差异时，建议增加为三个 浓度。 所选浓度应为在测量范围内有医学意义的值，即至少有一 个浓度在医学决定水平(medical decision levels)左右。不要为了得到较小的精密度，都选用较高值的样品，甚至超出
7、 测量范围。也不应选用靠近最低检出限的样品，此时所得 的精密度往往偏大。 如没有医学决定水平，可在参考区间上限左右选一个浓度 。此外再根据检验项目的性质在线性区间内选择一个值。 试剂和校准品 评估批内精密度时，要求在整个评估阶段，尽可能使用相同条件，应使用同一种类同一批号的试剂和校准物,如有可能,只进行一次校准。使用不同批号试剂和多次校准都会增加检验结果的变异程度。测量重复性（批内精密度）测量重复性（批内精密度） 试验方法：连续重复测定20/21次； 结果计算：计算后20次检测结果的SD和CV； 判断标准：以能力验证/室间质评评价界限作为允许总误差（TEa），批内精密度1/4TEa；或者符合试
8、剂说明书的要求。 注意事项：若选择标本，则其浓度应尽可能接近质控品或试剂说明书中评价该性能所提供的标本浓度 测量再现性（批间精密度）测量再现性（批间精密度） 试验方法：每天1次测试，连续测试20天；或每天2次测试，连续测试10天；或每天4次测试，连续测定5天; 结果计算：剔除离群值后，计算20次检测结果的SD和CV； 判断标准：1/3TEa；或者符合试剂说明书的要求。 注意事项：若选择标本，首先应考虑检测物的稳定性，浓度要求同批内精密度；若检测物不稳定，则必须使用质控品进行该试验。 总误差（总误差（TEa） 从CLIA 88允许误差表中查阅评价的该项目的允许误差范围。 没有CLIA 88允许误
9、差范围的项目: EQA的允许误差 试剂说明书提供 二、正确度与准确度准确度(accuracy): 一次测量的结果与被测量真值的接近程度。 正确度(trueness): 真实度，大量测量的均值与真值的接近程度。 文件依据 CLSI 颁布的EP15-A文件用户对精密度和准确度性能的核实指南 实验方法 测定具有溯源性的标准物质物质 参加卫生部临床检验中心室间质评 样本室间比对：要求与使用相同检测方法的、质量保证措施较好的、或已获认可或的实验室，或与使用配套分析系统的实验室进行比对 对3个不同水平的质控品每个测定2次，测定均值与靶值的偏差小于卫生部临床检验中心室间质评的允许误差表示准确度可以接受三、可
10、报告范围验证 线性范围（Linear Range)是指系统最终的输出值（浓度或活性）与被分析物的浓度成正比的范围。 分析测量范围（Analytical Measurement Range）方法直接测量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或者其它预处理等过程下，测量结果总误差符合要求的分析物浓度的范围。 临床可报告范围（Clinically Reportable Range)是方法可采用对标本的稀释、浓缩或者其他预处理用于扩展直接分析测量下的分析物值的范围。 可报告范围（Reportable Range）：实验室可建立或验证仪器或检测系统测量相应的准确度实验结果值的范围。 文件依据 CLSI 颁布的E
11、P6-A文件定量测量方法的线性评价 仪器 应有较好的测定精密度及不存在明显的携带污染等。对仪器应进行定期维护及校准，保证其处于 正常状态。 试剂 应注意试剂有效期及批号，不可采用过期试剂或 不同批号的试剂。 校准品 可采用与评价试剂配套的校准品。校准品的使用应严格按照产品说明，仪器校准步骤与间隔应按 照本室的标准操作程序进行。 样品类型 为避免基质效应对结果的影响，选用的样品应与临床实验样品相似，但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用物质的样品，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样品。样品物浓度应包括试剂厂商提供的试剂所能达到的线性范围。 样品制备 收集临床检测过程中的高值样品（H）和低
12、值样品(L)，若收集不到低值样品，可用生理盐水或蒸馏水替代。将H和L样品按：1L、3L+1H、2L+2H、 1L+3H、1H关系各自配制(必要时可改变比例)混合，形成系列评价样品。 样品测定 在进行线性范围确立时，应进行7-11个浓度水平的样品测定，每个样品重复测定2-4次。进行可报告范围验证时，应进行5个浓度水平的样品测定，每个样品重复测定2次。如果测定方法本身存在明显的携带污染，应根据实际情况采取恰当措施尽量避免对测定结果的影响。 结果分析 1、以预期值为横坐标，以实测值为纵坐标进行线性回归，得到直线回归方程YaX+ b ， a在0.971.03范围内，r20.95 ； 2、偏倚在允许误差
13、范围之内。 可报告范围的高限=可接受最大稀释倍数线性范围（AMR）上限值； 可报告范围的低限：线性范围的检测低限或功能灵敏度为可报告范围的低限。四、参考区间的验证 验证已知参考区间在本实验室应用的可接受性。 实验方法 1、从健康人群中抽出20个参考个体（最好能够覆盖各个年龄段），依照实验室标准操作规程检测样本。 2、发现离群值应弃用，并新的参考个体代替，以确保测试结果不含离群值。 3、如果20例参考个体中不超过2例（10的结果）的检测值在参考区间外，则已知的参考区间可以接受。若3例以上超出界限，再选择20个参考个体进行验证，若少于或等于2个检测值超过已知参考限，则已知参考区间可以接受。若又有3
14、个以上超出参考限，则就应该重新检查所用的分析程序，考虑两个样本总体生物学特征上可能存在差异，并且考虑是否按照大规模研究指南建立自己的参考区间。 关键在于筛选“健康人群” 参考个体不应该是住院患者或者临床病人，除非绝对需要。诸如可能是必需的小儿科或老年人的研究。 需要排除 经常喝酒 近期患病 献血者 哺乳期 血压不正常 肥胖 吸毒 特殊职业 正在服用医生开方的药物 滥用维生素 口服避孕剂 正在服用自购药物 怀孕 某些环境因素 近期手术 禁食或者非禁食 吸烟 遗传易感因素 近期接受输血 正在住院治疗或最近住过院 结果分析 按照实验方法评估参考区间的可接受性。 五、携带污染的检测 为了监测生化分析仪
15、的技术性能，评价其携带污染率是否能达到有关标准。 携带污染率：指不同浓度样品间连续测定的相互影响，主要是高浓度样品对低浓度样品的污染。 实验方法 选择高值和低值两份血清，按3次高值-3次低值顺序测定，记录测定结果，计算出均值和携带污染率。 计算公式 携带污染率=(L1-L3)/(H3-L3)*100% 其中H3代表第三次高值，L1代表第一次低值，L3代表第三次低值 结论：平均携带污染率根据临床实验要求一般生化分析仪在2%范围内属于可接受. 六、测量不确定度评定第一步 规定被测量 说明正在测量什么，包含：系统（需要对存在时间和空间的说明），如血清；组分及分析物，如钙离子；量、质量、浓度、活性等，
16、如mmol/L 测量不确定度 CNAS-CL02：医学实验室质量和能力认可准则（IOS15189:2012,IDT）第5.5.1.4条款 实验室应为检验过程中用于报告患者样品被测量值的每个测量程序确定不确定度，实验室应规定每个测量程序的测量不确定度性能要求，并定期评审测量不确定度的评估结果。实验室在届时结果量值时应考虑测量不确定度。需要时，实验室应向用户提供测量不确定度评定结果测量不确定度评定方法 不确定度的评定方法有自上而下（Botton-up）和自上而下（Top-down） 医学实验室适用自上而下（基于正确度和精密度两个主要分量）不确定度评定过程 第一步 规定被测量 第二步 识别不确定度来
17、源 第三步 量化不确定度 第四步 计算合成不确定度第二步 识别不确定度来源样品（取样程序、样品代表性、存储条件）精密度（重复性、实验室内复现性）校准（溯源性、值得不确定度、校准方法）校准值正确性和测量不确定度、校准品与参考物质的互通性与样本相关的效应（基质、干扰物）试剂、校准品和参考物质的批间差不同的操作者器材的变异（天平、移液器、容量瓶等）环境的变化（温度、湿度、震动、电压等）第三步 量化不确定度1.实验室内测量复现性引入的测量不确定度评定（推荐的优先次序）：从实验室室内质控数据计算从实验室间比对（PT）数据计算从重复测量常规样本的合并标准偏差计算第三步 量化不确定度2.偏倚引入的测量不确定
18、度的评定（推荐的优先次序）使用有证参考物质（CRM），包括正确度质控品应用PT数据（无计量溯源性PT项目应慎用）与参考测量方法比较第四步 计算合成不确定度1.合成标准不确定度： 合成前，所有不确定度分量都必须以标准不确定度即标准偏差表示合成标准不确定度计算 UC=u2c(bias)+u2(Rw)+. uc(bias)为标准偏倚不确定度 u(Rw)为室内复现性不确定度第四步 计算合成不确定度2.合成相对不确定度： 合成前，所有不确定度分量都必须以相对标准不确定度表示合成相对不确定度计算 Ucrel=u2crel(bias)+u2rel(Rw)+. uc(bias)为相对偏倚不确定度 u(Rw)为
19、相对室内复现性不确定度第四步 计算合成不确定度 3.扩展不确定度 扩展不确定度需要给出一个区间，合理地赋予被测量值的数量分布大部分会落在此区间内 扩展不确定度计算 U=K *uc Urel=K*ucrel U为扩展不确定度，Urel为相对扩展不确定度 K为扩展因子。正态分布K=2时，包含概率P=95.43%, K=3时,包含概率P=99.73% 通常采用K=2测量不确定度的报告 1.血清葡萄糖 GLU=5.13mmol/L,U=0.18mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率 2. .血清葡萄糖 GLU=（5.130.18）mmol/L(K=2) 表示95%的包含概率测量不确定度的报告 报告的有效数字，在应用uc和U时大都采用两位有效数字。在最终报告结果时一般做法是降测量不确定度修约到小数后一位（特殊要求例外）小结 方法学的分析性能验证包涵许多的内容、技术要求较高，在实际工作中，应根据具体情况进行分析，在质量体系允许的范围内，选择合适的试验方法完成此项工作，保留原始数据，结合制定的判断标准，综合分析试验结果，以评价所选的检验程序能否满足临床实验的要求，从而保障检验结果的准确性。 Thanks for your attention 2016.9温州
