1、n 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作学习醋酸纤维薄膜电泳的操作n 了解电泳技术的一般原理了解电泳技术的一般原理二、实验原理二、实验原理 任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在电场中向一定的电极移动。在电场中向一定的电极移动。 如氨基酸、蛋白质、酶、核酸等及其衍生物如氨基酸、蛋白质、酶、核酸等及其衍生物质都具有许多可解离的酸性或碱性基团，它们在质都具有许多可解离的酸性或碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。溶液中会解离而带电。 一般在碱性溶液中（即溶液的一般在碱性溶液中（即溶液的p
2、HpH值大值大于等电点于等电点pIpI），分子带负电荷，在电场中），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。取决于带电的多少和分子的大小。泳动度泳动度 不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用泳动度或迁移率来表示。泳动度指泳动度或迁移率来表示。泳动度指带电质点在单位带电质点在单位电场强度下的泳动速度。电场强度下的泳动速度。 v d/t dl u = = = （ cm2.V-1.S-1) E V/l V
3、t 影响泳动度因素影响泳动度因素l带电质点的性质带电质点的性质 质点所带净电荷的量、质点的大小及质点质点所带净电荷的量、质点的大小及质点的形状。一般说来质点所带净电荷越多，质点的形状。一般说来质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速直径越小，越接近球形，则在电场中的泳动速度越快；反之则越慢。度越快；反之则越慢。v溶液的粘度溶液的粘度v电场强度电场强度v溶液的溶液的pHpH值值v溶液的离子强度溶液的离子强度v固体支持物的电渗现象固体支持物的电渗现象v本实验用醋酸纤维薄膜，是纤维素的羟基乙本实验用醋酸纤维薄膜，是纤维素的羟基乙酸化所形成的纤维纤维素醋酸酯。具有泡沫酸化所形成
4、的纤维纤维素醋酸酯。具有泡沫状的结构，厚度均为状的结构，厚度均为120um120um，有很强的渗透性，有很强的渗透性，对分子移动阻力很小。对分子移动阻力很小。三、器材与试剂三、器材与试剂v醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜 2*8cm v常压电泳仪常压电泳仪v点样器点样器：用盖玻片代替。用盖玻片代替。v培养皿培养皿v玻璃板玻璃板v粗滤纸粗滤纸v电泳槽电泳槽v巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液：pH8.6pH8.6，离子强度，离子强度0.070.07 巴比妥巴比妥2.76g,2.76g,巴比妥钠巴比妥钠15.45g15.45g，加水至，加水至1000ml1000ml。 每个大组每个大组500ml500ml v染色液
5、染色液 每个大组每个大组200ml200ml 氨基黑氨基黑10B0.25g,10B0.25g,甲醇甲醇50ml,50ml,冰醋酸冰醋酸10ml,10ml,水水40ml40ml（可重复使用）（可重复使用）v漂洗液漂洗液 每个组每个组100ml100ml 含甲醇或乙醇含甲醇或乙醇45ml45ml、冰醋酸、冰醋酸5ml5ml、水、水50ml50mlv透明液透明液 每个组每个组200ml200ml 含无水乙醇：冰醋酸含无水乙醇：冰醋酸7 7：3 3，本实验不做定，本实验不做定 量不用配。量不用配。四、操作方法四、操作方法v1 1、薄膜准备：、薄膜准备：用镊子取醋酸薄膜一张，放用镊子取醋酸薄膜一张，放在
6、绥冲液中浸泡在绥冲液中浸泡2020分钟。（识别光泽面与分钟。（识别光泽面与无光泽面，并在有光泽面一角做记号）无光泽面，并在有光泽面一角做记号）v2 2、制造滤纸桥：、制造滤纸桥：剪取双层合适尺寸滤纸桥剪取双层合适尺寸滤纸桥附在电泳槽支架上，使其一端与支架的前附在电泳槽支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中，沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中，用缓冲液润湿并驱赶气泡，使滤纸紧贴在用缓冲液润湿并驱赶气泡，使滤纸紧贴在支架上。如图支架上。如图v3 3、点样、点样：取出膜条，用双层滤纸吸干多：取出膜条，用双层滤纸吸干多余的液体，平铺在玻璃板上，无光泽面朝余的液体，平铺在玻璃板上，
7、无光泽面朝上，用点样器蘸取血清在膜条的一端上，用点样器蘸取血清在膜条的一端1.5cm1.5cm处，均匀划一条线。处，均匀划一条线。v4 4、电泳：、电泳：在两电极槽内加入等高的缓冲在两电极槽内加入等高的缓冲液，将膜条平悬于滤纸桥上（点样端靠近液，将膜条平悬于滤纸桥上（点样端靠近负极），盖严电泳室通电，电压负极），盖严电泳室通电，电压120V120V，电，电流流0.4-0.7mA/cm 0.4-0.7mA/cm 膜宽，电泳膜宽，电泳6060分钟。分钟。v5 5、染色：、染色：电泳完毕后，取膜条放在染色电泳完毕后，取膜条放在染色液中浸泡液中浸泡1010分钟左右。分钟左右。v6 6、漂洗：、漂洗：漂
8、洗数次至无蛋白区底色脱净漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的图谱。保存。为止，可得色带清晰的图谱。保存。v7 7、透明、透明：将干燥的电泳图谱放入透明液：将干燥的电泳图谱放入透明液中浸泡中浸泡2-32-3分钟后取出贴于洁净的玻璃板分钟后取出贴于洁净的玻璃板上，干后放在两层滤纸中保存。上，干后放在两层滤纸中保存。v8 8、计算、计算：计算出每条蛋白的泳动度。：计算出每条蛋白的泳动度。注意事项注意事项v手尽量不要接触膜条。手尽量不要接触膜条。v用点样器点样时不要点的太多，但也不用点样器点样时不要点的太多，但也不 能太少。线条均匀，用力水平。能太少。线条均匀，用力水平。v电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液。电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液。五、实验结果五、实验结果六、结论与分析六、结论与分析
