1、针对未折叠蛋白反应靶向治疗针对未折叠蛋白反应靶向治疗多发性骨髓瘤多发性骨髓瘤 内质网应激与未折叠蛋白反应内质网应激与未折叠蛋白反应n内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器。有很多物理、化学可导致内质网功能的内稳态失衡, 形成内质网应激(ER)n内质网应激表现为 腔内错误折叠与未 折叠蛋白聚集以及 Ca2+平衡紊乱。n而当错误折叠的蛋白质累积时,细胞通过多条信号转导途径,启动一系列基因的表达，对其进行适应性应答, 这些反应称为未折叠蛋白质反应(UPR)内质网应激，未折叠蛋白反应及细胞命运内质网应激，未折叠蛋白反应及细胞命运uCHOP通路：通路：是一个是一个TF，在，在ER应激的应激
2、的ATF6和和PERK通路中被通路中被诱导表达诱导表达uIRE1/TRAF2/ASK1/caspase12通路通路uCa2+通路通路From Allen Volchuks lab websiteMetazoan UPRnonconventional splicing未折叠蛋白反应包括增强蛋白质折叠能力、停滞大多数未折叠蛋白反应包括增强蛋白质折叠能力、停滞大多数蛋白质的翻译、加速蛋白质的降解等蛋白质的翻译、加速蛋白质的降解等.如果内质网功能紊如果内质网功能紊乱持续乱持续,细胞将最终启动凋亡程序细胞将最终启动凋亡程序. 未折叠蛋白反应通过四种机制缓解内质网应激未折叠蛋白反应通过四种机制缓解内质网应
3、激n减少蛋白合成，防止未折叠蛋白的积聚。减少蛋白合成，防止未折叠蛋白的积聚。(停产整顿停产整顿)n诱导内质网伴侣分子，增强蛋白质折叠能力。（弥补诱导内质网伴侣分子，增强蛋白质折叠能力。（弥补过失）过失）n诱导内质网相关的蛋白降解，加速错误折叠蛋白降解。诱导内质网相关的蛋白降解，加速错误折叠蛋白降解。（清除影响）（清除影响）n诱导凋亡，清除内质网应激中受损细胞（找替罪羊）诱导凋亡，清除内质网应激中受损细胞（找替罪羊）4细胞处理未折叠蛋白的途径细胞处理未折叠蛋白的途径E1:泛素激活酶泛素激活酶 E2:泛素结合酶泛素结合酶E3:泛素连接酶泛素连接酶Toru Hosoi and Koichiro Oz
4、awa / Clinical Science (2010) 118, 1929 6未折叠蛋白反应传感器及信号转导未折叠蛋白反应传感器及信号转导骨髓瘤细胞的软肋骨髓瘤细胞的软肋n骨髓瘤患者血清骨髓瘤患者血清M蛋白可以超过蛋白可以超过100g/L (甲胎蛋白是以甲胎蛋白是以g/L为单位的为单位的)n骨髓瘤细胞含有丰富的内质网，每分钟可以分泌骨髓瘤细胞含有丰富的内质网，每分钟可以分泌10000至至80000个个M蛋白分子蛋白分子n其中其中1/4至至1/3可能发生错误折叠可能发生错误折叠n未折叠或错误折叠的蛋白可以导致骨髓瘤细胞凋亡未折叠或错误折叠的蛋白可以导致骨髓瘤细胞凋亡n骨髓瘤细胞未折叠蛋白反应
5、处于激活状态骨髓瘤细胞未折叠蛋白反应处于激活状态未折叠蛋白反应：治疗多发性骨髓瘤未折叠蛋白反应：治疗多发性骨髓瘤的潜在靶点的潜在靶点n真核起始因子真核起始因子2 (eIF2)磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂Cancer Res. 2009;69(4):1545-52. n肌醇需求激酶肌醇需求激酶1(IRE1)抑制剂抑制剂Blood.2011;117(4):1311-4. n热休克蛋白热休克蛋白(HSP)抑制剂抑制剂SAHAn组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂抑制剂: vorinstat and Panobinostat (Phase III trial)n第二代蛋白酶体抑制剂第二代蛋白
6、酶体抑制剂:carfizomib and NPI-0052nPERK抑制剂和抑制剂和GRP-78抑制剂抑制剂n一石二鸟：联合治疗一石二鸟：联合治疗我们的初步探索我们的初步探索n2-甲氧基雌二醇甲氧基雌二醇n三氧化二砷三氧化二砷n衣霉素和二硫苏糖醇衣霉素和二硫苏糖醇 n过氧化物酶体增殖激活受体过氧化物酶体增殖激活受体 （PPRA）配体）配体2-甲氧基雌二醇（甲氧基雌二醇（2ME2）n雌二醇生理代谢产物，在孕妇尿液中大量存在雌二醇生理代谢产物，在孕妇尿液中大量存在n诱导包括骨髓瘤在内的多种肿瘤细胞凋亡诱导包括骨髓瘤在内的多种肿瘤细胞凋亡低剂量低剂量2ME2作用作用72H后后CZ-1细胞的细胞的形态
7、学改变（形态学改变（1000）abc对照组0.5m0.1m acbfedLP-1NCI-H929原代骨髓瘤细胞对照组0.5对照组36h72h 0.5mol/L 2ME2对对 XBP-1 m-RNA 表达的影响表达的影响CZ-1LP-1NCI-H9290h 36h 72h72h36h72h36h0h0hCZ-1LP-1NCI-H9290h 36h72h72h36h72h36h0h0h2-甲氧基雌二醇（甲氧基雌二醇（2ME2）n低剂量低剂量2ME2可以诱导骨髓瘤细胞分化可以诱导骨髓瘤细胞分化形态形态免疫表型免疫表型分泌功能分泌功能n其机制与其机制与B细胞生理性分化以及细胞生理性分化以及UPR的的共
8、同信号途径共同信号途径XBP-1有关有关XBP-1 转录因子转录因子 浆细胞成熟未折叠蛋白反应未折叠蛋白反应B细胞UPR诱导剂诱导剂调整调整UPR相关的基因相关的基因 死亡死亡 生存生存骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞分化分化 ?XBP-1: 未折叠蛋白反应浆细胞分化未折叠蛋白反应浆细胞分化的交汇点的交汇点衣霉素和二硫苏糖醇衣霉素和二硫苏糖醇 UPR诱导剂促进骨髓瘤细胞的分化UPR诱导剂对骨髓瘤细胞的分化诱导剂对骨髓瘤细胞的分化形态学改变形态学改变(400)Control Primary cellU266RPMI-8226 TM 0.4M 72h DTT 0.5mM 72hUPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面
9、诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e的表达的表达U266U266细胞对照细胞对照 U266U266细胞处理细胞处理48h48hU266U266细胞处理细胞处理72h72hRPMI-8226RPMI-8226 对照对照RPMI-8226RPMI-8226 48h 48hRPMI-8226RPMI-8226 72h 72hUPR诱导剂上调多发性骨髓瘤表面诱导剂上调多发性骨髓瘤表面CD49e表达表达衣霉素对骨髓瘤细胞衣霉素对骨髓瘤细胞CD49eCD49e表达上调表达上调二硫苏糖醇对骨髓瘤细胞二硫苏糖醇对骨髓瘤细胞CD49eCD49e表达上调表达上调衣霉素处理衣霉素处理二硫苏糖醇处理二硫苏糖醇处理UP
10、R诱导剂增加轻链蛋白浓度诱导剂增加轻链蛋白浓度原代细胞原代细胞轻链蛋白浓度轻链蛋白浓度(ng/ml)controlTMDTTP1221.6712.80997272.2624.68054300.246720.30067P2150.326710.07765183.013311.93228216.2521.43236P3309.006714.97354304.4417.1242353.9217.55123P4116.543314.92698168.00673.634871181.5713.88213P5228.1711.62626266.136711.31137252.976713.16729P61
11、32.773312.28007170.7412.30985145.076.704063P7104.70679.94438150.155.780035157.827.013905P895.025.056606130.87674.995053120.1110.84287UPR诱导剂增加轻链蛋白浓度诱导剂增加轻链蛋白浓度UPR诱导剂上调诱导剂上调GRP78,GRP94的表达的表达 GRP78 GRP94 UPR诱导剂上调诱导剂上调XBP-1u,下调下调XBP-1sXBP-1uXBP-1s Real time RT-PCR衣霉素处理后蛋白质印迹结果衣霉素处理后蛋白质印迹结果-actinXBP-1sXB
12、P-1u 对照 24h 48h 72h 对照 24h 48h 72h U266 RPMI-8266二硫苏糖醇处理后蛋白质印迹结果二硫苏糖醇处理后蛋白质印迹结果-actinXBP-1sXBP-1u 对照 24h 48h 72h 对照 24h 48h 72h U266 RPMI-8266小小 结结n小剂量的未折叠蛋白诱导剂对多发性骨髓瘤具有小剂量的未折叠蛋白诱导剂对多发性骨髓瘤具有促分化作用促分化作用 细胞形态上更接近成熟浆细胞细胞形态上更接近成熟浆细胞 分泌的轻链蛋白的量增加分泌的轻链蛋白的量增加 表面标记表面标记CD49e表达增加表达增加nGRP78,GRP94 发生了未折叠蛋白反应发生了未折
13、叠蛋白反应n在转录和翻译水平在转录和翻译水平XBP-1u, XBP-1s n证实，除了急性早幼粒细胞白血病（证实，除了急性早幼粒细胞白血病（APL）以外，）以外，多发性骨髓瘤也可以采用诱导分化的治疗策略多发性骨髓瘤也可以采用诱导分化的治疗策略n2-甲氧基雌二醇甲氧基雌二醇通过干扰诱导性聚集体通过干扰诱导性聚集体的形成而增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的的形成而增强硼替佐米对骨髓瘤细胞的凋亡效应。聚集体是一种特殊细胞器，凋亡效应。聚集体是一种特殊细胞器，可以将未折叠蛋白运输到溶酶体通过自可以将未折叠蛋白运输到溶酶体通过自噬途径降解。噬途径降解。n聚集体形成与微管聚集和解聚有关，受聚集体形成与微管聚集和解
14、聚有关，受到乙酰化和去乙酰化调控、修饰。到乙酰化和去乙酰化调控、修饰。2-甲氧基雌二醇甲氧基雌二醇E 电镜观察RPMI-8226及NCI-H929细胞中的聚集体，可见聚集体位于细胞质和胞核中F 免疫荧光可见免疫荧光可见NCI-H929细胞中的细胞中的aggresome位于胞核和胞质中位于胞核和胞质中破坏硼替佐米诱导生成的聚集体从而促进骨髓瘤细胞凋亡。基线基线硼替硼替佐米佐米硼替佐米硼替佐米 + 2-甲氧甲氧基雌二醇基雌二醇6.6 (U266)75.313.88.9 (8226)69.119.5聚集体阳性细胞 (%)PPAR配体配体n15-脱氧前列腺素J2 n曲格列酮多发性骨髓瘤治疗的新靶点多发
15、性骨髓瘤治疗的新靶点 应用配体激活应用配体激活 PPAR进而阻断进而阻断STAT3信信号靶向治疗号靶向治疗Wang LH, et al. Immunity, 2004; 29(2): 113116. 探索新靶点探索新靶点n在国际上首次报道应用配体激活在国际上首次报道应用配体激活PPARPPAR阻断阻断STAT3STAT3信号转导通路，诱导多发性骨髓瘤细胞信号转导通路，诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡凋亡。Weber SM, et al. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004 ; 287(6):E1171-7PPAR配体诱导内质网应激胰岛配体诱导内质网应激胰岛细胞以减细
16、胞以减弱细胞因子信号弱细胞因子信号 三氧化二砷三氧化二砷n三氧化二砷抑制组蛋白去乙酰化酶活性，促使微管蛋白及HSP90乙酰化, 以此干扰聚集体的形成及IB激酶的折叠 HDAC调节的蛋白调节的蛋白组蛋白去乙酰化酶调节的蛋白组蛋白去乙酰化酶调节的蛋白HistoneHDACsHDACs -tubulinHSP90HIF-1 HDACsHDACsHDACs抑癌基因活性抑癌基因活性抑癌功能丢失抑癌功能丢失微管解聚微管解聚/聚集体形聚集体形成成 血管内皮血管内皮生长因子生长因子 癌基因癌基因下游效应下游效应细胞周期停滞细胞周期停滞凋亡凋亡细胞运动，侵细胞运动，侵袭袭细胞增殖和存活细胞增殖和存活血管发生血管
17、发生肿瘤细胞的肿瘤细胞的反应反应p53组蛋白去乙酰化酶抑制剂（组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）治疗）治疗多发性骨髓瘤主要是通过调节两个蛋白来多发性骨髓瘤主要是通过调节两个蛋白来发挥作用发挥作用,分别是热休克蛋白分别是热休克蛋白90和和-微管微管蛋白。蛋白。 HDAC6结果结果n0.1mol/L的的As2O3处理组处理组HDAC酶的活性为对照组酶的活性为对照组的的83.5%，与对照组无明显，与对照组无明显差异（差异（P0.05）n0.5，1，2，4mol/L的的As2O3处理组处理组HDAC酶的活酶的活性较对照组下降性较对照组下降,分别为对分别为对照组的照组的76.8%，72.3%，69.1
18、%和和62.8%（P0.05）n2mol/L的的As2O3分别处理分别处理细胞细胞0h,24h,48h，24h组和组和48h组组HDAC酶的活性较对酶的活性较对照组下降照组下降,分别为对照组的分别为对照组的74.7%和和66.3%（P0.05）As2O3对对 -微管蛋白乙酰化的影响微管蛋白乙酰化的影响nNCI-H929细胞随着细胞随着处理浓度增加和处处理浓度增加和处理时间的延长，理时间的延长， - -微管蛋白的乙酰化微管蛋白的乙酰化水平增加水平增加上海长征医院As2O3对对HSP90乙酰化水平的影响乙酰化水平的影响n2.5mol/L和和5mol/L As2O3处理处理MM细胞株细胞株 NCI-
19、H929 48h后，与对后，与对照组相比，照组相比，HSP90的乙的乙酰化水平增加酰化水平增加02.55HSP90IP: HSP90Acetylated HSP90HSP90Cell lysate-actinAS2O3 (M)As2O3对对HSP90分子伴侣功能的影响分子伴侣功能的影响nIP检测内源性检测内源性HSP90与其客户蛋白与其客户蛋白IKK 结结合水平合水平n加入加入2.5mol/L As2O3处理处理48h后，与后，与IKK 的结合能力减弱，与的结合能力减弱，与HSP90结合的结合的IKK 减减少少三氧化二砷与多发性骨髓瘤三氧化二砷与多发性骨髓瘤三氧化二砷三氧化二砷下调下调HDAC
20、活性活性下调下调HDAC活性活性 -微管蛋白的微管蛋白的乙酰化水平增加乙酰化水平增加HSP90的的乙酰化水平增加乙酰化水平增加 IKK活性降低活性降低NF-kB活性下降？活性下降？聚集体功能受损？聚集体功能受损？细胞侵袭能力下降细胞侵袭能力下降02.55HSP90IP: HSP90Acetylated HSP90HSP90Cell lysate-actinAS2O3 (M)对未折叠蛋白反应和多发性骨髓瘤的展望对未折叠蛋白反应和多发性骨髓瘤的展望nUPR及其调控机制有待更深入彻及其调控机制有待更深入彻底的把握底的把握n研发更多靶点、更有效的化合物和研发更多靶点、更有效的化合物和制剂制剂n采用更釜底抽薪的治疗策略采用更釜底抽薪的治疗策略致谢致谢n易庆易庆n王利华王利华n屈晓燕屈晓燕n邹建峰邹建峰n傅卫军傅卫军n杜鹃杜鹃n姜华姜华n马仰丽马仰丽n熊红熊红n周霞周霞n李荣李荣n张文皓张文皓n袁振刚袁振刚NSFC （港澳合作重点项目（港澳合作重点项目, 批准号批准号0731160619 ） （批准号（批准号30670884）、（批准号）、（批准号30770924）、（海外）、（海外合作重点项目合作重点项目, 批准号批准号30828017 ）、）、 （批准号（批准号30270578）上海市优秀学科带头人基金、上海市领军人才计划上海市优秀学科带头人基金、上海市领军人才计划
