1、绪绪 论论 目的：发现、检出和鉴定有害目的：发现、检出和鉴定有害生物，作为出证或检疫处理的生物，作为出证或检疫处理的依据（食品安全，化妆品安全，依据（食品安全，化妆品安全，疾病控制）疾病控制） 方式：现场检查、实验室检验方式：现场检查、实验室检验一 检疫（QUARANTINE) 检疫Quarantine是拉丁语，原意是40。 14世纪，欧洲发生了一场非常大的鼠疫流行。当时整个欧洲流行鼠疫，死亡了2000万人，也就是当时欧洲1/4的人口因患鼠疫而死掉了。感染了鼠疫的病人先是淋巴结溃烂，接着是引起肺部的病变，到后期由于缺氧，整个皮肤变黑。到死的时候，整个人是黑的。 黑死病流行非常广泛，在欧洲的一些
2、港口城市，为防止疫病的侵入，对来往船只采取了限制措施。最早是在1377年的拉古萨共和国（相当于现在的克罗地亚）颁布了对海员的管理规则，规定来自疫区的人员必须在海港以外一定距离的小岛上停留30天，然后才能进港。后来意大利的威尼斯港规定，若有船队从疫区来，必须在小岛上停留40天。由此 拉丁语“40” “quarantine”一词就具有英语“检疫”的意思。 人类在社会实践中逐渐认识到防止外来的动植物有害生物传播和蔓延也可采取检疫的措施来达到目的。因此也就有了动植物检疫。 动植物检疫最初是单纯的隔离检疫，后来人类的认识不断提高，认识到在人类活动越来越频繁，地区间贸易越来越多的情况下，有害生物已不单单可
3、以通过植物或动物进行传播，动植物产品、运输工具和其他物品也可以是有害生物传播的媒介，单纯的隔离检疫已不能全面防止外来有害生物的传播和蔓延。动植物检疫才逐渐演变成现在的模式。并且检疫的内容还在不断地完善。 现行的动植物检疫就是通过对进出境货物、运输工具、邮寄物、人员携带物实施检疫，防止外来有害生物传入，保护农、林、牧、渔业生产和人体健康，促进对外经济贸易的发展。二、植物检疫的意义外来有害生物的危害 外来（有害）生物的传入对农林业生产和人民身体健康造成危害，还将造成生态系统多样性、物种多样性、生物遗传资源多样性的丧失和破坏。导致外来有害生物大爆发的因素 天敌：自然界存在着一个生物链。生物的生存和发
4、展在当地受到各方面因素的制约，处于一个相对平衡的状态，有害生物也不例外。但是，一旦有害生物传入到一个新的地区，没有了生物（天敌）的制约，将导致种群的大发展，大爆发； 环境：传入地区的环境如果适宜外来有害生物的生存和发展，将导致外来有害生物的大爆发和危害； 寄主：外来有害生物有了新的食物（寄主）或易感病寄主，导致大爆发； 人为因素：外来有害生物传入初期由于人们没有看到它的危害（危害有量变到质变的过程） ，没有引起人们的足够重视和防治，没有防微杜渐，最后导致大爆发；人们对外来有害生物危害性认识不足，缺乏对其生物学特性的了解，缺乏防治的经验和有效的方法和手段或没有及时采取防治措施，导致外来有害生物的
5、大爆发和危害。动植物检疫的目的 境外的植物病、虫、杂草，动物传染病和寄生虫病可能随着进境的货物（动植物、动植物产品和其他检疫物）、运输工具、旅客携带物、邮寄物传入，从而对我国境内的动植物、动植物产品，人体健康和环境造成威胁或潜在的威胁。为防止外来有害生物传入和危害，必须实施动植物检疫。三、重大历史事件及动植物检疫的起源马铃薯晚疫病 1845年，爱尔兰由于从美洲传入马铃薯晚疫病，导致病害大流行，使马铃薯造受了毁灭性灾害。当时，仅800万人口的爱尔兰岛死于饥荒者达20万人，外出逃荒者164万人。引起了全世界的震惊。这就是有名的“爱尔兰大饥荒”。葡萄根瘤蚜 1860年，法国从美国引进了葡萄苗，结果也
6、从美国传入了葡萄的害虫葡萄根瘤蚜，结果在25年内使250万英亩葡萄园毁灭，经济损失达200万法郎。地中海实蝇 地中海实蝇是一种能危害200多种水果和蔬菜的世界公认的头号害虫。 1980年美国本土从夏威夷传入地中海实蝇后，仅1981年就花费了十几个亿的美元来防治地中海实蝇。 当年有30多个国家和地区（包括中国）禁止从美国进口水果和蔬菜，给美国的水果生产商一个沉重的打击。广肩星天牛 光肩星天牛是一种破坏性极大的林木害虫，生长在中国、日本、朝鲜半岛等地区。 1996年以来，美国纽约、芝加哥等地发生光肩星天牛的危害。据美国有关方面统计，光肩星天牛一旦在美国传播开来，将对美国槭糖业、旅游业和生态环境造成
7、约1380亿美元的直接经济损失。 因此，美国将光肩星天牛的发生归咎于中国输美货物木质包装携带入境，并以此为由于1998年9月11日对中国所有输美货物木质包装采取了紧急检疫措施，要求所有货物木质包装在出口前必须经过熏蒸等除害处理，否则将被销毁或连同货物一并退回。 继美国之后，欧盟、加拿大等国家和地区也相继对我国出口木质包装提出了严格的检疫要求，严重阻碍了我国具木质包装货物的出口，一是大大增加了出口成本，二是延迟了出口的时间。无论在主观和客观上都起到了技术性贸易壁垒的作用。 一场世界性的蔓延大战就此拉开了序幕。松材线虫 松材线虫是一种能够导致针叶树致病和死亡的植物有害生物，原产于北美。 二战结束后
8、通过日本被美国占领，松材线虫也随着木质包装（包装军需品）等传到日本。 我国于1982 年首次在江苏南京中山陵发现了松材线虫病。当时发病死亡的松材线虫仅265株。 现在此病已在全国十二个省市、自治区、特别行政区迅速蔓延。发生面积已超过8万公顷，死亡的寄主树木2000万株以上，累计给中国造成直接经济损失近50亿元、对社会和生态等产生的间接损失上百亿元。在重点发生区，部分林地已退化为荒山，疫区相关农副产品和林产品的流通和出口也直接受到影响。 为防止松材线虫的传入，中国政府于2000年1月1日开始对美、日进口的货物木质包装实施检疫。 2001年10月1日起，欧盟因中国部分地区有松材线虫的危害，也针对中
9、国出口欧盟的货物木质包装采取了检疫措施。植物检疫的起源 据资料记载，法国里昂地区在1660年首先制定了铲除小蘖并禁止其传入，以防止小麦杆锈病的法令。 法国在从美国引进葡萄苗时导致葡萄根瘤蚜蔓延，约1/3（10万ha）的葡萄园绝收，造成重大损失。为此法国政府于1872年颁布了禁止从国外输入葡萄枝条的法令。 为避免引起国际贸易纠纷，防止此类事件的发生， 1881年在瑞士签约了葡萄根瘤蚜（芽）公约，这是世界上第一个防止植物危险性病虫害的国际条约。该公约在防止葡萄根瘤蚜的传播方面起到积极的作用。 美国的葡萄根瘤蚜传入法国并造成了严重灾害后，美国农业部于1912年颁布了国家植物检疫法令，以防止植物病虫害
10、在国际间的传播。 1912年，美国佛罗里达的柑橘溃疡病大发生，造成了严重的危害，美国花费了巨资进行防治，因此，美国植物检疫法 把柑橘溃疡病为主的柑橘病虫害列为严格禁止进境的对象。国际植物保护公约的产生 为了进一步发挥国际植物检疫的作用，在葡萄根瘤蚜（芽）公约的基础上，于 1929年在罗马将其修改为国际植物保护公约，并成立了国际植物保护公约组织（IPPC）。国际动物卫生组织的产生 国际动物卫生组织（OIE）成立于1924年。 国际动物卫生法典由 OIE在1961年制定并通过。 2001年4月 中国检验检疫的产生： 国家质量监督检验检疫总局 主权的体现 管理职能的体现四、进出口商品检验（食用性植物
11、产品）进出口商品检验（INSPECTION) 通过对进出口商品的检验，达到保护人类健康和安全、保护动物或植物的生命健康、保护环境、防止欺诈行为、维护国家安全的目的。 食用性植物产品检验 由于科学的发达和人类对健康的重视，发达国家和一些发展中国家不仅对致病微生物十分关注，而且越来越重视药物残留和重金属超标的问题，限量的要求也越来越高。已苛刻到无法接受的程度，这就是所谓的技术性贸易壁垒措施。 对食用性动植物产品实施检验就是要检验这些产品是否含有致人生病的微生物，农、兽药和重金属残留是否超标，以保证人类食用安全。 对进出口供人类食用的动植物产品实施检验就是要使进出口的产品符合我国或进口国的卫生要求，
12、符合食用标准，促进外贸的发展。致病微生物 动植物、动植物产品在养殖、生产、加工、储藏和运输过程中都有可能感染致人生病的微生物，人类接触或食用后将导致感病，危害健康，严重的将导致死亡。 高致病性禽流感H5N1： O157大肠感菌：日本（死亡7万） 李斯特菌：法国 金色葡萄球菌肠毒素：日本雪牌牛奶（死亡14500人）药物残留 动物、植物在饲养和种植过程由于生病、生虫或外部环境的影响，需要使用相应的农药、兽药或饲料添加剂等农药类化学品来进行预防和治疗。因此在动物、植物及其产品中有可能存在一定的药物残留。 动植物生长期间在吸取养分和水分的同时有可能吸取了污染于其中的重金属，导致体内重金属含量超标。 人
13、类食用农、兽残或重金属超标的食品后会受到危害。 以含抗生素的牛奶为例，人类食用含抗生素超标的牛奶后，不仅会增加人体内细菌的耐药性，一旦患病，很可能无药可治，而且会抑制和杀死人体内正常的寄生的菌落，破坏肠道内细菌的平衡，降低人体的免疫力，引起感染性疾病。长期饮用“有抗奶”相当于经常低剂量服用抗生素，会增加人体耐药性，对于过敏体质的消费者而言，还可能会引起皮疹、过敏性休克等反应。生鲜牛乳收购标准 国家标准委员会相关专家委员会已通过对生鲜牛乳收购标准的审核，有望在近期正式出台，届时“有抗奶”将被叫停。农作物农药残留 有机磷杀虫剂：甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺（2007年1月1日禁用），甲
14、拌磷、乙拌磷、甲基异硫磷、氧化乐果等； 有机氯杀虫剂：六六六、滴滴涕、硫丹、林丹和七氯等； 除虫菊酯 ：联苯菊酯、氯氰菊酯、氯氰菊脂、氰戊菊脂等； 杀菌剂：恶醚唑等。 可乐风波 可口可乐公司和百事可乐公司在印度12个邦生产的11种软饮料的57份样本中，林丹、毒死蜱和七氯等杀虫剂的平均含量为10亿分之1185，比印官方规定的10亿分之05高出20多倍。而在加尔各答销售的可口可乐中林丹含量是规定标准的140倍，而孟买附近生产的可口可乐中毒死蜱的含量是规定标准的200倍！ 印度的一个地方法院要求可口可乐和百事可乐公司公布可乐的配方。 可乐公司没有过滤地下水，所以认为水源污染是最大的可能。由于印度对农
15、药使用管理很不严格，滥用杀虫剂，结果使大部分地下水都受到了污染，可乐罐装厂抽取地下水制造可乐，自然也受到了污染。两大美国可乐巨头没有对取自印度的地下水做足够的过滤，没有应用有效的净化水源技术。 兽药残留 渔药残留 添加剂药残绿霉素 出口虾仁、小龙虾 出口蜂蜜 饲料添加剂硝基呋喃 硝基呋喃类（Nitrofurans）是一类合成的抗菌药物，它们作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用。 水生动物：出口活鳗、烤鳗、河豚和小龙虾； 牲畜：出口肠衣。盐酸克伦特罗 俗称瘦肉精 食用猪肉内脏后出现心慌、手脚不由自主抖动、头晕、乏力，心率加速、肌肉颤动、头痛、恶心、发热及寒战。
16、孔雀石绿 孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，其既是杀真菌剂，又是染料，长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿 。 孔雀石绿是一种具有高毒、高残留及“三致”（致畸、致癌、致突变）的杀菌剂。 出口日本的活鳗。硫丹 对人有致突变作用。对中枢神经系统有损害。主要损害中枢神经系统的运动中枢、小脑、脑干和肝、肾、生殖系统，为致肿瘤物。可引起惊厥。一般表现为头痛、痉挛、口吐泡沫，嗜睡，震颤。 硫丹是一种农药，用于防治螨等有害生物，一般用于农作物的防治 在出口日本的泥鳅，活鳗等检测残留超标。苏丹红1号 苏丹红1号是
17、一种红色染料。苏丹红1号具有致癌性，我国和欧盟都禁止其用于食品生产。 2005年2月18日，英国食品标准署就食用含有添加苏丹红色素的食品向消费者发出警告，并在其网站上公布了亨氏、联合利华等30家企业生产的可能含有苏丹红1号的产品清单。 由于发现含有苏丹红1号成分，全国所有肯德基餐厅停止售卖新奥尔良烤翅和新奥尔良烤鸡腿堡两种产品，同时销毁所有剩余调料。 重金属超标 动植物、动植物产品在饲养、种植和生产加工过程中会受到环境（土壤、水）的污染，造成重金属超标，人类食用后危害严重。 重金属：铬、镉、汞、砷、铅、氟等检疫对象检疫对象 出入境的植物，植物产品 交通运输工具 人员 携带物 快件第二章 植物检
18、疫程序 法定检验检疫 目录 列入目录内的商品通过评定程序：抽样，检验和检查，评估，验证和合格保证；注册认可和批准 另外一些必须进行检验的入境货物：废旧物品，出口纺织品 非必须检验检疫的进出口商品进行抽查检验，有关机构公布检验结果 检验合格加施检疫标志 进境，出境，过境的植物，植物产品和其他检疫物（腊肠非洲不容许进口） 装载动植物检疫物的装载容器，包装物，铺垫材料 来自植物疫区的运输工具（禽流感） 进境拆解的废旧船舶 法律法规国际条约的植物 退回或销毁处理：检疫监管；消毒处理入境植物检疫程序出境植物检疫程序 出入境集装箱检疫交通工具和人员检疫植物检疫工作流程 报检申报（报检员提交单证，资料）报检
19、申报（报检员提交单证，资料） 计收费计收费 抽样采样（形式实验，处理加工）抽样采样（形式实验，处理加工） 检验检疫检验检疫 卫生除害处理（木质包装）卫生除害处理（木质包装） 签证放行（检验检疫处理证，合格证书，通行证）签证放行（检验检疫处理证，合格证书，通行证）报检员自理报检单位代理报检单位报检员资格 考试合格人员取得报考员资格证，两年内未从事报检业务的，自动失效报检员资格对检疫检验技术的要求对检疫检验技术的要求准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物；准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物；快速、简单、方便易行；快速、简单、方便易行；有标准化的操作规程，检验结果重复性好有标准化的操作规程，检验
20、结果重复性好安全，不扩散有害生物。安全，不扩散有害生物。检验检疫的样品检验检疫的样品 同一国家和地区来源，同一运输工具，同一品名同一国家和地区来源，同一运输工具，同一品名（种苗则为同一品种）的货物统称为一（种苗则为同一品种）的货物统称为一批批，按批，按批进行检验、放行或处理。进行检验、放行或处理。 通常一批货物的数量很大，不可能全部检验，必通常一批货物的数量很大，不可能全部检验，必须按规定的方法从批的总体中抽取适当数量的代须按规定的方法从批的总体中抽取适当数量的代表性部分，称为表性部分，称为样品样品，用以检验。，用以检验。每份送检样品量的规定：谷物、棉籽、瓜子、饲料类为每份送检样品量的规定：谷
21、物、棉籽、瓜子、饲料类为1000g；大粒；大粒种子（玉米、蚕豆等）种子（玉米、蚕豆等）10001500g；小粒种子（芝麻）；小粒种子（芝麻）500g；蔬菜、；蔬菜、烟草：烟草：10100g；葱头、红枣、马铃薯等：；葱头、红枣、马铃薯等：20005000g。取样方法的依据取样方法的依据 有害生物的分布规律有害生物的分布规律 货物的数量货物的数量 装载方式等因素确定装载方式等因素确定样品数量（容量）大小依据样品数量（容量）大小依据 有害生物的带有率有害生物的带有率; 检验方法的灵敏度检验方法的灵敏度; 检验所要求的精度检验所要求的精度; 货物种类与特点货物种类与特点; 检验所允许的时间和花费等许多
22、因素确定。检验所允许的时间和花费等许多因素确定。 有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低，有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低，检验精度要求越高，所需样品数量就越多。检验精度要求越高，所需样品数量就越多。检验检疫的方法检验检疫的方法 真菌主要由培养方法检出，根据形态特征鉴定；真菌主要由培养方法检出，根据形态特征鉴定； 细菌、病毒及与之类似的有害生物则需应用多种细菌、病毒及与之类似的有害生物则需应用多种生物学的、生理生化的和免疫学的技术检验；生物学的、生理生化的和免疫学的技术检验； 线虫和杂草种子主要由直接检验和机械分离而检线虫和杂草种子主要由直接检验和机械分离而检出，根据形态特征鉴定
23、。出，根据形态特征鉴定。第一节第一节 植物病原真菌的检验检疫技术植物病原真菌的检验检疫技术 病原真菌的属、种主要依据其形态特征鉴定，有病原真菌的属、种主要依据其形态特征鉴定，有时形态相似的近似种类需接种寄主，测定其致病时形态相似的近似种类需接种寄主，测定其致病性。鉴定病原真菌专化型和小种，也需接种鉴别性。鉴定病原真菌专化型和小种，也需接种鉴别寄主。寄主。 除洗涤检验法的检验结果用单位重量种子的孢子除洗涤检验法的检验结果用单位重量种子的孢子负载量表示外，其它检验方法都能获得带菌百分负载量表示外，其它检验方法都能获得带菌百分率或发病百分率。率或发病百分率。一、直接检验一、直接检验 是用于检验检疫具
24、有明显症状是用于检验检疫具有明显症状的植物材料，可作初步的诊断的植物材料，可作初步的诊断 现场快速检查现场快速检查 肉眼，放大镜或实体显微镜。肉眼，放大镜或实体显微镜。 二、过筛检验二、过筛检验 检验粮谷、种子、油料、干果和生药材，检验病检验粮谷、种子、油料、干果和生药材，检验病粒，菌婴、菌核、病残体等粒，菌婴、菌核、病残体等 种子过筛后可检出夹杂的菌瘿、菌核、病株残屑种子过筛后可检出夹杂的菌瘿、菌核、病株残屑和土壤，都需仔细鉴别。和土壤，都需仔细鉴别。 小麦矮腥黑穗病的菌婴小麦矮腥黑穗病的菌婴三、比重检验法三、比重检验法 原理：菌婴、菌核和病秕籽粒原理：菌婴、菌核和病秕籽粒都要比健康的籽粒轻
25、。都要比健康的籽粒轻。 用于种子、粮谷、豆类中的菌用于种子、粮谷、豆类中的菌婴、菌核和病秕籽粒。婴、菌核和病秕籽粒。 四、染色检验法四、染色检验法 某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原菌本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上菌本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有颜色，利于检出和区分病虫种类特有颜色，利于检出和区分病虫种类 洗涤检验法洗涤检验法 用于检测种子表面附着的真菌孢子，包括黑粉菌用于检测种子表面附着的真菌孢子，包括黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以及多种半知菌的分生孢子等。及
26、多种半知菌的分生孢子等。洗涤检验的操作程序洗涤检验的操作程序一定数量的种子样品放入容器并加入定量蒸馏水或其它洗一定数量的种子样品放入容器并加入定量蒸馏水或其它洗涤液，振荡涤液，振荡5-10 min5-10 min，使孢子脱离种子，转移到洗涤液中。，使孢子脱离种子，转移到洗涤液中。洗脱孢子洗脱孢子将孢子洗涤液移入离心管，低速离心（将孢子洗涤液移入离心管，低速离心（2500-3000r2500-3000rminmin）10-15min10-15min，使孢子沉集在离心管底部。，使孢子沉集在离心管底部。离心富集离心富集弃去离心管内的上清液，加入一定量蒸馏水或其它浮载液，弃去离心管内的上清液，加入一定
27、量蒸馏水或其它浮载液，重新悬浮沉集在离心管底部孢子，取悬浮液。滴加在血球重新悬浮沉集在离心管底部孢子，取悬浮液。滴加在血球计数板上，用高倍显微镜检查孢子种类并计数，据此可计计数板上，用高倍显微镜检查孢子种类并计数，据此可计算出种子的带菌量。算出种子的带菌量。镜检计数镜检计数用常规孢子萌发测定法、分离培养法或红四氯唑（用常规孢子萌发测定法、分离培养法或红四氯唑（TTCTTC）染色法判定孢子死活。染色法判定孢子死活。孢子生活孢子生活力测定力测定影响洗涤检验的因素影响洗涤检验的因素 种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来一定能完全洗涤下
28、来; 离心管内容已形成一层极难沉降的孢子薄膜。管离心管内容已形成一层极难沉降的孢子薄膜。管壁也可能黏附孢子壁也可能黏附孢子; 视野内孢子分布不均匀视野内孢子分布不均匀; 操作不规范，不严格操作不规范，不严格 。 保湿萌芽检验法保湿萌芽检验法 适用于病菌随种子萌发或幼苗生长阶段就开始侵适用于病菌随种子萌发或幼苗生长阶段就开始侵然危害，并表现症状的病原菌。然危害，并表现症状的病原菌。 优点优点：容易检查根部和绿色部分，也可避免相互：容易检查根部和绿色部分，也可避免相互传染。传染。 缺点缺点：腐生菌干扰；病菌之间干扰：腐生菌干扰；病菌之间干扰。 沙内萌芽检验沙内萌芽检验 主要用于植物繁殖材料的入境后
29、隔主要用于植物繁殖材料的入境后隔离检疫。供试材料种植在经过高压蒸汽灭菌处理或干热灭离检疫。供试材料种植在经过高压蒸汽灭菌处理或干热灭菌的沙砾、石英砂中，在隔离场所和适宜条件下栽培，根菌的沙砾、石英砂中，在隔离场所和适宜条件下栽培，根据幼苗和成株的症状鉴定。据幼苗和成株的症状鉴定。 土内萌芽检验土内萌芽检验 试管幼苗症状测定试管幼苗症状测定 在试管中水琼脂培养基斜面在试管中水琼脂培养基斜面上播种种子，在适宜条件下培养，根据幼苗症状、结合病上播种种子，在适宜条件下培养，根据幼苗症状、结合病原菌检查，确定种传真菌种类。生长检验花费时间长，使原菌检查，确定种传真菌种类。生长检验花费时间长，使其应用受到
30、限制。其应用受到限制。 保湿培养检验保湿培养检验 优点设备简单、操作方便、花费少、快速准确优点设备简单、操作方便、花费少、快速准确; ; 缺点某些菌丝生长不旺盛和产孢少，杂菌已影响缺点某些菌丝生长不旺盛和产孢少，杂菌已影响 有利于病原菌形成孢子，同时又避免因种子有利于病原菌形成孢子，同时又避免因种子萌芽伸长过快造成相互覆盖，便于检查萌芽伸长过快造成相互覆盖，便于检查冰冻吸水法：冰冻吸水法：含水量均匀一致，有利于病菌生长，皿内含水量均匀一致，有利于病菌生长，皿内洁净，杂菌少。洁净，杂菌少。 琼脂平皿法：琼脂平皿法： 吸水纸法吸水纸法： 培养皿 培养皿培养皿 吸水纸吸水纸 培养皿 蒸馏水蒸馏水种种
31、子子 培养皿 日光或日光或紫外灯紫外灯 20-257-10d 实体显微镜下实体显微镜下逐粒种子检查逐粒种子检查 特别注意观察种子上菌丝体的颜特别注意观察种子上菌丝体的颜色、疏密程度和生长特点、真菌色、疏密程度和生长特点、真菌繁殖结构的类型和特征。繁殖结构的类型和特征。 培养皿培养皿吸水纸培养检验法实例吸水纸培养检验法实例种子种子 1-2次氯酸钠溶液和抗菌次氯酸钠溶液和抗菌素表面消毒素表面消毒5-10 min植床于培养基平板上，在适宜植床于培养基平板上，在适宜温度和光照下培养温度和光照下培养7-10d手持放大镜从培养皿两面观察，依手持放大镜从培养皿两面观察，依据菌落形态、色泽来鉴别真菌种类据菌落
32、形态、色泽来鉴别真菌种类必要时挑取培养物制片，用必要时挑取培养物制片，用高倍显微镜检查高倍显微镜检查琼脂培养基培养检验琼脂培养基培养检验七、分离培养检验七、分离培养检验 主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他之物产主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他之物产品内部，不易发现和鉴定的病原菌；品内部，不易发现和鉴定的病原菌； 当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无特殊的病原菌可供鉴定的场合。特殊的病原菌可供鉴定的场合。 根据不同的目的分为根据不同的目的分为5种：种：种子表面或深层的病菌种子表面或深层的病菌检测病菌的潜伏部位检测病菌的潜伏部位了解种子外部附着
33、的病菌种群了解种子外部附着的病菌种群检验病菌种类、菌落类型和萌发率检验病菌种类、菌落类型和萌发率分离块茎、块根和苗木、接穗等繁殖材料所带分离块茎、块根和苗木、接穗等繁殖材料所带的病菌的病菌分离培养检验步骤分离培养检验步骤 研究方法研究方法 进境美国小麦中黑麦草腥黑穗病菌的检测和鉴定进境美国小麦中黑麦草腥黑穗病菌的检测和鉴定（洗涤检测和荧光（洗涤检测和荧光PCRPCR） 水稻腥黑粉病菌的单孢检测（分离培养）水稻腥黑粉病菌的单孢检测（分离培养） 大豆疫病的田间鉴定与防治大豆疫病的田间鉴定与防治第二节第二节 病原细菌的检疫检验技术病原细菌的检疫检验技术 植物细菌病害有软腐、环腐、萎蔫、溃疡、疮痂、植
34、物细菌病害有软腐、环腐、萎蔫、溃疡、疮痂、枝枯、叶斑、组织增生（瘿瘤、发根）等多种症枝枯、叶斑、组织增生（瘿瘤、发根）等多种症状。叶片上病斑常呈水渍状，上有细菌溢脓。病状。叶片上病斑常呈水渍状，上有细菌溢脓。病部切片镜检可见细菌溢。部切片镜检可见细菌溢。 田间诊断田间诊断了解病害和寄主的群体特征，即病了解病害和寄主的群体特征，即病害在田间发生的情况，以及当地的作物栽培及耕害在田间发生的情况，以及当地的作物栽培及耕作情况作情况 。 初步诊断初步诊断通过肉眼观察植株的症状、病原分通过肉眼观察植株的症状、病原分泌物以及镜检观察。泌物以及镜检观察。 例如例如 水稻细菌性条斑病取一小块病叶组织，低水稻细
35、菌性条斑病取一小块病叶组织，低倍镜下观察，微管束有喷菌现象。倍镜下观察，微管束有喷菌现象。 分离培养：选择新鲜的病斑或病键组织交界分离培养：选择新鲜的病斑或病键组织交界处处表面消毒表面消毒清水洗净清水洗净碾碎稀释碾碎稀释划线培养划线培养观察观察提取液系列稀释提取液系列稀释在金氏在金氏B（KB）培养基平板上涂布）培养基平板上涂布在在25和无光照条件下培养和无光照条件下培养3d后后紫外光或近紫外光照射下有蓝色荧光的紫外光或近紫外光照射下有蓝色荧光的菌落，为假单胞杆菌，可能是晕蔫病菌菌落，为假单胞杆菌，可能是晕蔫病菌选择典型菌落作进一步的鉴定选择典型菌落作进一步的鉴定菜豆种传晕蔫病菌的分离致病性测定
36、：目的是区分致病性细菌和腐生菌。致病性测定：目的是区分致病性细菌和腐生菌。 过敏性反应过敏性反应(Hypersensitive reaction, HR)是指病是指病原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐生性细菌则不表现典型的枯斑。生性细菌则不表现典型的枯斑。大部分病原细菌，特别是 Pseudomonas属的病原细菌注射到烟草叶片上，能在24小时内产生枯斑反应。 按照柯赫氏法则，从发病植物上得到的分离物，按照柯赫氏法则，从发病植物上得到的分离物，在健康的寄主植物上接种发病并与先前症状一致，在健康的寄主植物上接种发病并与先前症状一致，然后再次从发病部
37、位分离到与先前相同的分离物，然后再次从发病部位分离到与先前相同的分离物，才能证明该分离物是引致这种病害的病原物。常才能证明该分离物是引致这种病害的病原物。常用的接种方法有喷雾、注射、针刺和浸泡等。用的接种方法有喷雾、注射、针刺和浸泡等。 操作：细菌溢脓或分离纯化细菌操作：细菌溢脓或分离纯化细菌自然自然或人工接种或人工接种观察观察针刺接种法接种甘蓝叶片中肋针刺接种法接种甘蓝叶片中肋如确系该菌，则接种部如确系该菌，则接种部位软腐、维管束褐变位软腐、维管束褐变切片置于切片置于1.5水琼脂平板上，水琼脂平板上，在在28和黑暗条件下培养和黑暗条件下培养3d生化测定试剂盒：鉴定某一类细菌的关键碳源、生化测
38、定试剂盒：鉴定某一类细菌的关键碳源、氮源、特殊酶和有机酸等并附有比较和检索用氮源、特殊酶和有机酸等并附有比较和检索用的计算机数据库。的计算机数据库。Biolog 测定：美国测定：美国Biolog 公司研制的专门鉴定公司研制的专门鉴定细菌的专家系统。将大量的细菌生理生化测定细菌的专家系统。将大量的细菌生理生化测定参数与先进的计算机技术有机的结合起来。参数与先进的计算机技术有机的结合起来。 噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄噬菌体是感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在液体培养时，生繁殖，破坏和裂解寄主细胞，在液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培
39、使混浊的细菌悬浮液变得澄清，在固体平板上培养时，则出现许多边缘整齐，透明光亮的圆形无养时，则出现许多边缘整齐，透明光亮的圆形无菌空斑，称为菌空斑，称为“噬菌斑噬菌斑”，肉眼即可分辩，肉眼即可分辩。 噬菌体法的主要优点是简噬菌体法的主要优点是简便、快速，能直接用种子便、快速，能直接用种子提取液测定。提取液测定。 缺点是非目标菌多量存在缺点是非目标菌多量存在时敏感性较差，噬菌体的时敏感性较差，噬菌体的寄生专化性和细菌对噬菌寄生专化性和细菌对噬菌体的抵抗性都可能影响检体的抵抗性都可能影响检验的准确性。验的准确性。 取取10g10g稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎，稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎，放入已灭菌处理
40、的烧杯中放入已灭菌处理的烧杯中取取10g10g稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎，稻种，脱下谷壳，剪碎或磨碎，放入已灭菌处理的烧杯中放入已灭菌处理的烧杯中混匀后加入混匀后加入10ml10ml融化的肉汁胨琼脂融化的肉汁胨琼脂培养基，摇匀凝成平板培养基，摇匀凝成平板在在25-2825-28温箱中，培养温箱中，培养10-12h10-12h记载各培养皿中的噬菌斑数，然后再记载各培养皿中的噬菌斑数，然后再换算成每克种子的噬菌斑数换算成每克种子的噬菌斑数细菌的专化性噬菌体测定酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术(ELISA)- 酶联免疫吸酶联免疫吸附测定附测定(Enzyme linked immunology ass
41、ay, ELISA)是把抗原、抗是把抗原、抗体的免疫反应和酶的体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结高效催化反应有机结合而发展起来的一种合而发展起来的一种综合技术。综合技术。 ELISA的测定方法的测定方法:直接法、间接直接法、间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、双抗体夹心法等双抗体夹心法等6种。种。 ELISA的特征的特征:灵敏度高，特异性灵敏度高，特异性强，安全、快速并易观察。它可进强，安全、快速并易观察。它可进行定性定量测定，适于大批量样品行定性定量测定，适于大批量样品的检查、可用于病害普查，口岸检的检查、可用于病害普查，口岸检疫和产地检疫等。疫和产地检疫等
42、。 原理原理-将荧光物与微生物抗体结合得到荧光抗体，将荧光物与微生物抗体结合得到荧光抗体，荧光抗体与相应的抗原结合，在荧光显微镜下发荧光抗体与相应的抗原结合，在荧光显微镜下发生荧光，以此来检测抗原。生荧光，以此来检测抗原。 免疫荧光技术有直接法和间接法两种，在实践中免疫荧光技术有直接法和间接法两种，在实践中常用间接法，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，常用间接法，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，通过免疫荧光显微镜来检测所发出的荧光。通过免疫荧光显微镜来检测所发出的荧光。PCR检测技术是利检测技术是利用相应的引物，在用相应的引物，在DNA聚合酶催化下聚合酶催化下对目标对目标DNA进行体进行体外扩增
43、，根据预期外扩增，根据预期DNA条带的有无来条带的有无来判断检测的结果。判断检测的结果。 其特异性取决于引物和扩增反应条件其特异性取决于引物和扩增反应条件; 灵敏度取决于每次分析样品中目标病原菌的最低剂灵敏度取决于每次分析样品中目标病原菌的最低剂量，以及样品制备方法对量，以及样品制备方法对PCR反应的影响。反应的影响。 PCR的快速检测，引物尤其重要，通常有下列特异的快速检测，引物尤其重要，通常有下列特异性基因和性基因和DNA序列供设计序列供设计PCR引物用于检测和鉴引物用于检测和鉴定病原菌。定病原菌。 利用病原菌的致病基因利用病原菌的致病基因- 以病原菌的致病基因为以病原菌的致病基因为目标，
44、设计特异性引物，通过目标，设计特异性引物，通过PCR扩增进行病原扩增进行病原菌特异性检测菌特异性检测 例如土壤杆菌例如土壤杆菌Agrobacterium的菌株，所有致病菌的菌株，所有致病菌株都有介导株都有介导DNA在细菌和寄主间转导的毒性基因在细菌和寄主间转导的毒性基因(Vir基因基因)，详细了解致病机制后，可以设计出许，详细了解致病机制后，可以设计出许多针对该致病性基因序列的多针对该致病性基因序列的DNA引物。引物。 细菌核糖体细菌核糖体DNA的操纵子由的操纵子由3个有功能的保守序个有功能的保守序列列16SrDNA, 23SrDNA和和5SrDNA组成，由可变异组成，由可变异的转录间隔区的转
45、录间隔区(Internally Transcribed Spacer, ITS)分隔。扩增分隔。扩增DNA保守区域的引物通常称做通用引保守区域的引物通常称做通用引物，己经在广泛的系统进化变异细菌中应用，来物，己经在广泛的系统进化变异细菌中应用，来扩增核糖体基因片段。通过核糖体基因库扩增核糖体基因片段。通过核糖体基因库(ht tp : /www. cme. msu. edu/RDP/)和核糖体基因扩增产和核糖体基因扩增产物的序列分析，选择病菌专化序列，设计专化引物的序列分析，选择病菌专化序列，设计专化引物，可以用来专化检测病原细菌。物，可以用来专化检测病原细菌。 河北鸭梨黑斑病病原菌的鉴定河北鸭
46、梨黑斑病病原菌的鉴定 番茄上两种细菌性病害的诊断与防治番茄上两种细菌性病害的诊断与防治 梨火疫病菌噬菌体的初步研究梨火疫病菌噬菌体的初步研究 Biolog系统和系统和16SrDNA序列分析方法在植物病原序列分析方法在植物病原细菌鉴定中的应用细菌鉴定中的应用第三节第三节 植物病毒检验检疫技术植物病毒检验检疫技术 病毒病毒（virus）是一组（一种或一种以上）是一组（一种或一种以上）DNA或或RNA核酸分子，包围在蛋白或脂蛋白外壳内，在合核酸分子，包围在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量完成复制量完成复制 ，伴随核酸突
47、变发生变异。，伴随核酸突变发生变异。 主要特征主要特征：结构简单的（核酸结构简单的（核酸+蛋白或脂蛋白衣蛋白或脂蛋白衣壳）；壳）；严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统）；质合成系统）；非细胞生物（分子寄生物）。非细胞生物（分子寄生物）。非典型肺炎非典型肺炎”元凶冠状病元凶冠状病毒毒 鉴别寄主检测鉴别寄主检测-以鉴别寄主反应或指示植物为依以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法。据的方法。 曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少
48、。 目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定(ELISA) 快速免疫滤纸测定法快速免疫滤纸测定法(Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA) 免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 免疫印迹法免疫印迹法 -Western印迹印迹(Western blot)；斑点免疫结合；斑点免疫结合技术技术(Dot immunobinding assay, DIBA ) 组织
49、免疫印迹组织免疫印迹(Tissue-blot immunoassay, TBIA ) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应。其原理是快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应。其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上，通过大颗把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上，通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在，所不同的是粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在，所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶，从而使检测更加简单使用了一种红色乳胶，从而使检测更加简单和直观，和直观，RIPA测检测提纯测检测提纯TMV的灵敏度分别可的灵敏度分别可达达5ngPml/50ngPml)G G处为金标抗体处为金标抗体( (免疫金免疫金) )，T T处包
50、被抗体，处包被抗体，C C处包被抗金标抗体，处包被抗金标抗体，B B处为吸水纸。处为吸水纸。测试时测试时A A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B B端移动，流经端移动，流经G G处时处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体- -抗原复合物，抗原复合物，移至移至T T区时，形成金标抗体区时，形成金标抗体- -抗原抗原- -抗体复合物，金标抗体被固定下来，在抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T T区区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至显示红色线条，呈阳性反应，多余的金
