1、第七章 转基因植物目录 转基因技术现状及其应用 植物遗传转化技术 载体构建 遗传转化操作 转基因鉴定第一节植物遗传转化现状及其应用Nature has a rich source of variation转基因技术发展 1983年华盛顿大学成功将卡那霉素抗性基因导入烟草，同年4月美国威斯康星大学成功将大豆基因转入向日葵，标志着植物转基因技术的诞生。 1985年，第一批抗病毒、抗虫害和抗细菌病的转基因植物进入田间试验。 1986年，美国环保署允许世界第一例转基因作物抗除草剂烟草进行种植。 1994年，转基因延熟保鲜番茄“FlavrSavr”获得美国食品药品管理局的批准进入市场销售，成为世界上第一
2、个获许进行销售的转基因食品。转基因植物重要里程碑转基因植物重要里程碑 19831983年首例转基因植物培育成功年首例转基因植物培育成功 19861986年转基因植物获准进入田间试验年转基因植物获准进入田间试验 19941994年转基因番茄在美国批准上市年转基因番茄在美国批准上市 19961996年年GMOGMO面积面积170170万万haha 20122012年全球转基因作物种植面积年全球转基因作物种植面积170.3 million ha170.3 million ha2012年全球转基因作物种植按作物分-2012按性状分几种作物种植GMO比例全球种GMO国家分布转基因研究涉及的部分园艺作物
3、番木瓜 苹果 柿 荔枝 龙眼 红薯 草莓 梨 柑橘 桃n番茄n西瓜n葡萄nPepper n花菜n大白菜n李n马铃薯Production of transgenic plants resistant to diseasesApplication 1Diseases/viral diseases Limit production Affect quality Influence growthq利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶的部分基因或反义核糖核酸复制酶的部分基因或反义核糖核酸抑制病毒编码的加工酶，已获得抑制病毒编码的加工酶，已获得3030多种抗植物病毒的转基因植
4、物多种抗植物病毒的转基因植物研究成果Transgenic papaya resistant to PRSVFresh papaya productiona in state of Hawaii and in Puna districtYearTotalPuna(x1,000lb)(PRSVentersPuna)199255,80053,010199358,20055,290199456,20055,525199541,90039,215199637,80034,195199735,70027,810(transgenicseedsreleased)199835,60026,750199939,
5、40025,610The yield and quality of Rainbow was exceptional, amounting annually to 125,000 L/acre vs. 5,000 L/ acre of non transgenic ones Sweet orange overexpressing PR protein from tomato: resistant to phytophthoraApple fire blight fire blight:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 2000.Lytic
6、 protein (LP)：Royal Gala, Galaxy 和M26转avian LPs SB-37,T-4 lysozyme：Gala转harpin（来于Fire blight细菌）NPR1蛋白：过量表达Silencing the DIPM kinase which is related to the occurrence of the disease.Production of transgenic plants resistant to pests and insectsApplication 2Aftermath of farm chemical 我国化学杀虫剂约占农药总量的我国
7、化学杀虫剂约占农药总量的70%70%以以上，年产量上，年产量2222万吨左右，万吨左右，30%30%以上用于以上用于防治棉铃虫。防治棉铃虫。19921992年至年至19961996年，年， 2424万余人农药中毒。万余人农药中毒。19921992年中毒人数就高达年中毒人数就高达7 7万多人，直接经万多人，直接经济损失达济损失达100100多亿元。多亿元。 利用苏云金芽孢杆菌（利用苏云金芽孢杆菌（BtBt）杀虫蛋白基因杀虫蛋白基因CryICryI和和CryIIICryIII，分别获得抗鳞翅目和鞘翅分别获得抗鳞翅目和鞘翅目害虫的转基因植物（番茄、马铃薯、烟目害虫的转基因植物（番茄、马铃薯、烟草、杨
8、树、水稻和棉花等）草、杨树、水稻和棉花等）在美国，转在美国，转BtBt基因作物的推广减少了基因作物的推广减少了26.926.9亿美元的杀虫剂的使用亿美元的杀虫剂的使用1986-19981986-1998年转基因作物田间试验中，年转基因作物田间试验中，抗虫作物占抗虫作物占29%29%研究成果Bt-cotton China：19911991年单价抗虫棉，年单价抗虫棉，19931993年，开展年，开展双价抗虫棉的创新研究双价抗虫棉的创新研究 20052005年，国产抗虫棉已累计推广年，国产抗虫棉已累计推广90009000多万亩，多万亩，创造经济效益创造经济效益150150多亿元多亿元 ,200620
9、06年，种植年，种植20002000万亩万亩 India: Bt cotton covers 8.1 m acres in 2006 每亩可减少化学农药每亩可减少化学农药0.50.5公斤，每亩增加的收公斤，每亩增加的收益约为益约为140140元元 Non-Bt cottonBt cottonSource: CAASNumbers of pesticide applications in Bt and non-Bt cotton in Hebei and Shandong in 1999- reduced by 13 applications In 2000: by 12 application
10、s In 2001: by 14 applications Percentage (%) of poisonings reported as numbers of farmers interviewed in Henan in 2000Cabbage looper粉蚊夜蛾 test Diamondback moth小菜蛾 testProduction of transgenic plants resistant to herbicideApplication 3GMO by traits-2012Transgenic soybean 1994年年5月美国月美国Monsanto公司耐除草剂公司耐
11、除草剂“镇镇草宁草宁”大豆大豆Round up Ready（农达安）（农达安）。 Move to greener herbicide Benefits of Glyphosate 草甘磷草甘磷Tolerance in Crops Can use at any time - can wait until there is a problem Reduced herbicide use Very effective - Weeds very sensitive - GM crop very resistantGM canola surrounded by weeds- glyphosate+ gl
12、yphosateProduction of transgenic plants with altered development progressApplication 4延迟果实成熟延迟果实成熟q利用反义利用反义RNARNA技术抑制果实软化过程中的技术抑制果实软化过程中的关键酶（聚半乳糖醛酸酶或乙烯前体合成关键酶（聚半乳糖醛酸酶或乙烯前体合成酶），可使番茄果在储存期的软化延迟。酶），可使番茄果在储存期的软化延迟。q19931993年美国食品和药品管理局（年美国食品和药品管理局（FDAFDA）批准上批准上市的第一个转基因食品市的第一个转基因食品CalgeneCalgene公司的转公司的转基因延
13、熟番茄基因延熟番茄FlavrFlavr SavrSavr（保味）保味）q华中农业大学园艺系叶志彪教授获得转基因华中农业大学园艺系叶志彪教授获得转基因番茄番茄百日鲜（百日鲜（Bioscience)Bioscience)华番一号是我华番一号是我国第一个商品化生产的转基因产品国第一个商品化生产的转基因产品对照对照转基因苹果转基因苹果乙烯生成减少的苹果 转基因苹果：转基因苹果：乙烯生成减少乙烯生成减少70%需更长时间软化需更长时间软化硬度：高于硬度：高于CKSSC：高于高于CK比比CK耐贮藏耐贮藏3个月后不变褐的苹果Production of transgenic plants tolerant to
14、 abiotic stressesApplication 5 Approximately 70% of the genetic potential yield of major crops is lost by environmental factors. (Boyer, Science, 1982, 218: 443-448)Abiotic stressEnhanced growth in transgenic aspen耐盐番茄耐盐番茄 适宜保护地栽培的或适宜保护地栽培的或露地早春栽培；抗寒露地早春栽培；抗寒、抗盐、无限生长型、抗盐、无限生长型单株，果高桩型；每单株，果高桩型；每果序果序4
15、-8果、坐果率高果、坐果率高、单果重、单果重70-100g，糖糖度度5.0-6.0%，Vc含量含量为为41.4mg/100g鲜重鲜重；耐贮藏、利于通风；耐贮藏、利于通风透光，适于保护地栽透光，适于保护地栽培，产量可达培，产量可达50008000kg。 将先进的抗旱产品送入温室进行筛选；田间试验中领先的产品表现将先进的抗旱产品送入温室进行筛选；田间试验中领先的产品表现优异；优异；继续评估以评价抗旱性方面的表现。继续评估以评价抗旱性方面的表现。CONTROL对照组对照组WITH GENE 含基因含基因CONTROL对照组对照组WITH GENE 含基因含基因孟山都与巴斯夫合作孟山都与巴斯夫合作45
16、抗旱玉米抗旱玉米2008年农业进步展览会：年农业进步展览会：含抗旱基因含抗旱基因 对照组对照组 转基因转基因抗溃疡病的柑橘抗脱水的枳Production of transgenic plants with special value or traitsApplication 6Transgenic flowers with different flower colorq第一个转基因园艺植物是淡紫色的康乃馨第一个转基因园艺植物是淡紫色的康乃馨MoondustMoondust：把编码类黄酮羟化酶和二氢类黄：把编码类黄酮羟化酶和二氢类黄酮还原酶的基因转到白色康乃馨中，在转基酮还原酶的基因转到白色康乃
17、馨中，在转基因植物中积累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色因植物中积累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色， 改良作物营养品质植物类胡萝卜素代谢工程Shewmaker et al., Plant J, 1999; Lindgren et al., Plant Physiol, 2003; Paine et al., Nat Biotechnol, 2005; Rosati et al., Plant J, 2000; DAmbrosio et al., Plant Sci, 2004; Fujisawa et al., 2008; Zhu et al., PNAS, 2008; Apel and Bock, P
18、lant Physiol, 2009; Maass et al., Plos One, 2009 生产特殊类胡萝卜素植物类胡萝卜素代谢工程Mann et al., Nat Biothechnol. 2000; Morris et al., Metab Eng, 2006; Jayaraj, et al., Transgenic Res, 2007; Suzuki et al., Plant Cell Rep, 2007; Zhu et al., PNAS, 2008; Fujisawa et al., J Exp Bot, 2009Golden rice -Carotene Pathway i
19、n PlantsIPP异戊二烯焦磷酸异戊二烯焦磷酸GGPPPhytoeneLycopene -carotene(vitamin A precursor)Phytoene synthasePhytoene desaturaseLycopene-beta-cyclase-carotene desaturase Problem:Rice lacksthese enzymesNormalVitamin A“Deficient”RiceGA-20氧化酶部分正义抑制的苹果 R e d u c e d concentration o f G A 1 a n d GA20 in shoot tips and
20、young leaves. The dwarf type can be reversed by GA3. LFY encodes a plant specific transcription factor and is considered a master regulator of floral meristem development. AP1 is a member of the MADS-box gene family of transcription factors ,which play critical roles in development processes across
21、the plant, animal and fungal kingdoms. FLOWERING LOCUS T (FT) is one of the flowering-time genes in Arabidopsis genes and is characterized as a floral pathway integrator.Genes involved in floral developmentOverexpression of LEAFY in citrus transgenic plants.(A) Transgenic shoot grafted in vitro on a
22、 nontransgenic rootstock showing a precocious terminal flower five weeks after regeneration. (B) Transgenic plant showing a weeping growth habit. (C) Leaves from transgenic plants showing various degrees of curling (top) compared to leaves from nontransformed control plants (bottom). (D) Vegetative
23、shoot from a transgenic plant showing the reduction of thorns and small curled leaves (right) compared to a vegetative shoot from a nontransformed control plant of the same age (left). (E) Transgenic plant flowering 16 months after its transfer to the greenhouse. (F) Ripened fruit from a transgenic
24、plant grown in the greenhouse.不引起过敏的苹果第二节第二节 转基因转基因技术技术转基因技术（转基因技术（Transgenic technique） 运用分子生物学技术将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状、改造生物的技术。转基因技术的特点：转基因技术的特点：1）突破物种界限，从DNA分子水平上有目的地、有效地改造生物。2）按照人们的意志定向的改变生物的遗传性状。3）避免在自然情况下会限制不相关品种间DNA交换的障碍4）当转入的基因整合到染色体或基因组中后，这些基因会与寄主生物的遗
25、传物质一起向子代传递，并产生应有的生物学功能。基因工程基因工程 “Genetic engineering includes a range of techniques and methods used by scientists to control or modify genes, switch them off or move them between two unrelated species.”一般意义上的基因工程是指一般意义上的基因工程是指“重组重组DNADNA技术技术”或或“基因转移技术基因转移技术”。基因工程的四要素基因工程的四要素 目的基因目的基因 载体载体 转化方法转化方法
26、受体受体expressed sequenceregulatory sequencessuitable codon usage for the host or target organismprokaryote v eukaryotepost-transcriptional issuescell line v germ line transformation重组重组DNA筛选筛选分离外源基因分离外源基因载体载体重组重组转化子转化子整合整合基因工程图解：基因工程图解：转化或转化或转染转染受体细胞受体细胞植物基因工程植物基因工程 植物基因工程具有以下特点： 1）植物基因工程是在基因水平上改造植物的遗
27、传物质，更具有科学性和精确性，同时育种速度也大大加快。 2) 植物基因工程能定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性与可操作性。 3）植物基因工程大大地扩展了育种的范围，打破了物种之间的生殖隔离障碍，实现了基因在生物界的共用性，丰富了基因资源及植物品种。 植物转基因过程A.从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段。B.将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子。C.将重组DNA分子转到适当的植物受体细胞内。D.筛选获得了重组DNA的受体细胞，进行繁殖。E.基因的表达，产生人类所需要的物质。Plant Genetic Engineering Pr
28、ocessCellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cell 植物基因工程的目的基因 抗植物虫害基因（如bt基因） 抗植物病毒基因（如cp基因） 抗植物真菌病害基因（如几丁质酶基因） 抗植物细菌病害基因（如溶菌酶基因） 抗非生物胁迫基因（如耐除草剂基因） 提高作物产量改良作物品质的基因（如种子贮藏蛋白基因） 改良植物其他性状和雄性不育基因（如rol基因、barnase基因） 植物医药基因工程转化系统名称转化系统名称载载 体体转化原转化原理理转化方转化方法法受体细胞受体细胞植物基因
29、转化系统植物基因转化系统种质转化系统种质转化系统直接转化系统直接转化系统载体转化系统载体转化系统种质细胞种质细胞茎尖细胞茎尖细胞细胞转化法细胞转化法细细 胞胞生殖细胞生殖细胞花粉粒花粉粒卵细胞卵细胞花粉管通道法花粉管通道法浸浸 泡泡 法法化学原理化学原理物理原理物理原理病毒病毒农杆菌农杆菌PEG法法脂质体法脂质体法激光法激光法超声波法超声波法电泳法电泳法电激法电激法微注射法微注射法基因枪法基因枪法叶盘法叶盘法原生质体共培养法原生质体共培养法共感染法共感染法DNARNARi质粒质粒Ti质粒质粒各种受体各种受体原生质体原生质体植物遗传转化受体类型及特性植物遗传转化受体类型及特性受体受体转化方法转化
30、方法转化率转化率嵌合性嵌合性操作重复性操作重复性愈伤组织愈伤组织基因枪农基因枪农杆菌杆菌高高较多较多简单简单组织、器官组织、器官农杆菌农杆菌较低较低有有简单简单原生质体原生质体PEG/PEG/电击电击高高无无复杂复杂生殖细胞生殖细胞花粉管通道花粉管通道低低无无简单简单悬浮细胞悬浮细胞农杆菌农杆菌/电击电击较高较高时有时有较复杂较复杂（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性 愈伤组织是在受伤的外植体表面产生的脱分化的无序的分生组织。胚性愈伤组织则是经由一定的组织（花药、子叶、未发育的胚珠、下胚轴等）在合适的诱导培养
31、基上诱导分化而来，常用于根癌农杆菌介导的遗传转化，如香蕉、柑橘、葡萄、水稻、小麦、棉花等。特点:外植体试材广泛；扩繁量大,可获得较多的转化植株；通过体胚发生再生植株，嵌合体少；易于接受外源基因,转化率高；转化的外源基因遗传稳定性差；Fig. af Transformation of embryogenic calli of cotton and subsequent regeneration. a Embryogenic cotton calli used for transformation. b Enlarged view of embryogenic calli used for tra
32、nsformation. c Co-cultivated cotton calli on selection medium after 6 weeks showing a large number of globular embryo clusters. d Enlarged view of one of the globular embryo clusters from c. e Kanamycin (Km)-resistant transformed cotyledonary embryos on embryo maturation medium. f Km-resistant plant
33、s in soil pots in the greenhousePlant Cell Rep (2004) 22:465470愈伤组织的愈伤组织的分化分化 直接分化再生系统是指外植体细胞不经过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。 用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体,直接分化的研究已取得许多成功的实例。特点:操作简单,周期短;转化的外源基因能实现稳定的遗传;更适于无性繁殖的园艺植物，如果树、花卉及 一些木本植物;转化率低于愈伤组织再生系统;嵌合体较多。D. GUS-negative citrange shoot regenerating from a GUS-positive
34、callus.C. GFP-positive and negative shoots regenerating close from the same explants. Molecular Breeding 14: 171183, 2004.4C, Non-transformed explants regenerated with buds and shoots formed at both ends. Annals of Botany 84: 715723, 1999外植体的分化外植体的分化 原生质体是“裸露”的植物细胞,它同样具有全能性,能在适当的条件下诱导出再生植株。 从70年代初首次
35、从烟草原生质体成功的培养出再生植株以来,至今已有250多种高等植物的原生质体培养获得成功,其中包括一些重要的禾谷类粮食作物如水稻、小麦、玉米；果树类作物如柑橘、苹果等。特点:原生质体被除去了细胞壁，可直接高效的摄取外源DNA或遗传物质,甚至细胞核；嵌合体更少；易于在相对稳定和均匀的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；适用于各种转化系统；遗传稳定性更差；周期长、难度大、再生频率低。(A) Mesophyll protoplasts isolated from GFP transgenic Valencia plant; (B) hybrid colony expressing GFP after
36、 4 weeks culture; (C) hybrid embryoid expressing GFP after 5 weeks culture; (D) hybrid embryoid expressing GFP after 6 weeks culture. Guo WW & Grosser JW. Plant Science 168 (2005) 15411545 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经融合的情况下,模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。 经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。特点:转
37、化率和转化效率都很高；嵌合体少；胚状体具有两极性,可同时分化出芽和根；利用转基因的胚状体可生产人工种子；体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异、小胚的结构完整、成苗快、数量大等优点,有利于转基因植株的生产和推广。 Transgenic peach plants (Prunus persica L.) produced by genetic transformation of embryo sections using the green fluorescent protein(GFP) as an in vivo marker. a. Regenerating buds from call
38、i formed on an embryo section after 4 weeks in culture. b. In vitro rooted shoots. Molecular Breeding 14: 419427, 2004. 利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。 小孢子和卵细胞的单倍体培养 胚性细胞或愈伤组织细胞 单倍体植株 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。 采用2-3mm厚的组织薄层（茎段）进行培养，直接诱导芽的分化，获得再生植株。 在柑橘上已应用于成年态培养、遗传转化及植物激素与生长发育的关系
39、研究领域。特点：特点： 试验所需要的材料少； 外植体的生长与培养基的组成关系密切； 通过调节培养基组成，可以从薄层切片上直接诱导芽，勿需经过愈伤阶段，遗传变异相对较少； 周期短，繁殖系数大。柑橘薄细胞层柑橘薄细胞层培养培养图片引自Le Bui VanLe Bui Van等由Tran Thanh Van于1973年提出（Nature 246 (1973) 44-45）根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒转化基本程序质粒转化基本程序（1） Ti质粒转化载体的构建（2）受体系统的建立（3）目的基因的转化及转化子再生Ti plasmidAgrobacteriumGenomic DNAPlant cellGen
40、omic DNA (carries )+Ti plasmid with the gene of interestGene of interestEmpty plasmidRestriction enzyme Restriction enzyme AgrobacteriumTi plasmid with the new genePlant cellcells DNATransgenic plantCell divisionThe new gene+Transformation 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化 农杆菌属细菌为格兰氏阴性的土壤杆菌，植物遗传工程载体主要为根癌农杆菌(Agro
41、bacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogennesis)，分别通过其本身的Ti或Ri质粒完成携带基因从农杆菌到受体的转移。The Galls Can Be Huge Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有200kb组成。 Ti质粒根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同可分为：冠瘿碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。（1）T-DNA区：又称转移DNA，是农杆菌侵
42、染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。（2）Vir区：该区段的基因能激活T-DNA的转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。（3）Con区：该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，以此称之为接合转移编码区。（4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 Ti质粒结构示意图质粒结构示意图冠廮碱合成基因(tmt)生长素基因(tms)左边界细胞分裂素基因（tmr）右边界冠廮碱代谢基因Vir基因复制起始位点(ori) T-DNA区域 整合机理整合机理：T-DNA的边界序列对于信号分子的识别和T-DNA的转移是必
43、需的，左右边界25 bp的重复序列被位点特异性的VirD蛋白所识别，该蛋白具有核酸内切酶活性，酶切并释放T-DNA单链，实现DNA的转移。 毒性区基因毒性区基因：Vir区基因，其作用是诱导T-DNA构型的改变、转移、定位插入到核基因组中。 （1）农杆菌对受体的识别；）农杆菌对受体的识别； （2）农杆菌附着到植物受体细胞；）农杆菌附着到植物受体细胞； （3）诱导启动毒性区基因表达；）诱导启动毒性区基因表达； （4）类似接合孔复合体的合成和装配；）类似接合孔复合体的合成和装配； （5 5）T-DNA的加工和转运；的加工和转运； （6）T-DNA的整合。的整合。 农杆菌农杆菌Ti的的T-DNA导入植
44、物基因组整个过程包括：导入植物基因组整个过程包括：农杆菌介导转化的程序外植体的预培养农杆菌菌体的活化侵染共培养转化子的筛选培养转化植株的再生转化子的鉴定外植体预培养外植体预培养菌液制备菌液制备侵染侵染共培养共培养选择培养选择培养分子鉴定分子鉴定田间试验遗传分析性状鉴定田间试验遗传分析性状鉴定整合整合整合整合 外植体的预培养：外植体的预培养：一般以2-3天为宜。预培养有利于细胞分裂，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率；驯化作用；减少杂菌污染率；利于外植体与培养基的平整接触。 外植体的农杆菌接种：外植体的农杆菌接种：菌液浓度一般为OD600=0.5-0.7之间；浸泡后的外植体要在无菌滤纸上吸干，以
45、除去过量的菌体。 农杆菌与外植体共培养：农杆菌与外植体共培养：在固体培养基表面加一层滤纸，有利于控制外植体上农杆菌过度增殖。共培养时间必须长于16h，一般为2-3天。在共培养培养基中加入As(乙酰丁香酮，细胞创伤诱导分子)或采用tomato feeder plates均可提高转化率。 外植体脱菌及选择培养：外植体脱菌及选择培养：常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（carbenicillin）、头孢霉素（cefotaxine）及羧噻吩青霉素（timentin）。常用的选择抗生素如Km、HPT、bar等。 转化植株的再生 转化株的分子鉴定（PCR、Southern blot、Northern blot、
46、Western blot、实时定量PCR） 转化株的形态、性状观察（株形、分枝、开花结果习性等） 转化株后代遗传分析根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒转化的方法质粒转化的方法整体植株接种共感染法叶盘转化法原生质体共培养转化法农杆菌介导转化的优缺点农杆菌介导转化的优缺点 优点优点： 成功率高，效果好； 转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且多数符合孟德尔遗传规律； 费用低，方法简单易操作； 寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都可采用此法，尤其近年来在一些单子叶植物上也取得成功（已有7个科的20多种单子叶植物转化获得成功）。 不足之处不足之处： 农杆菌介导的转化主要应用
47、于双子叶植物，还有少数的单子叶植物；而大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用；另外，农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来烦恼。 PEG介导基因转化介导基因转化 PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立。 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸（pLO)、磷酸钙及高PH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。（1）Ti质粒DNA提取（2）原生质体分离（3）转化培养（4）转化培养同时加入运载DNA（即鲑鱼精DNA或小牛胸腺DNA）（5）离心收集原生质体或用钙离子溶液使PEG逐步稀释（6）
48、将原生质体培养于选择培养基上或不加选择压力按一般方法培养（7）当细胞团长到一定大小时将细胞团转移至含选择压力的培养基中筛选转化细胞避免嵌合转化体的产生；对细胞伤害少，而且转化顺利；其转化的原生质体易于选择转化体；原生质体转化是理论研究的极好的实验系统；受体植物不受种类的限制。 建立原生质体再生系统十分困难，从而阻碍了PEG法的应用；转化率低；从原生质体再生的无性系植株变异较大，因此通过PEG法转化后的转基因植株将产生更多的无性系变异。 电击法介导基因转化电击法介导基因转化 电击法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电击穿孔”（electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源D
49、NA的摄取。 此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化。 （1）分离原生质体加入电击缓冲液重悬，并离心3分钟去掉上清液，再加入适量的电击缓冲液，计数，将原生质体密度调节到1106 2106个/ml（2）加入10g/ml质粒DNA和50g/ml鲑鱼精子DNA，混合后分装于电击反应槽内（3）冰浴5min（4）选择不同参数电击（5）600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤（6）将原生质体包埋于固体培养基中，28黑暗条件下选择培养 电击法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率较高，特别适于瞬时表达的
50、研究。缺点是造成原生质体的损伤，使植板率降低，且仪器也较昂贵。 基因枪法介导基因转化基因枪法介导基因转化 基因枪法（particle gun)又称微弹轰击法（microprojectile or biolistic bombardment)。最早是由美国康奈尔（Cornell)大学的Sanford等（1987）研制出火药引爆的基因枪。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得以表达，从而实现基因转化。Biolistics Gun DNA coated golden particles
