1、亲子鉴定的基本原理和亲子鉴定的基本原理和方法方法荣荣 媛媛武汉大学中南医院武汉大学中南医院检验科检验科&法医司法鉴定所法医司法鉴定所.12亲子鉴定发展概况不科学.3亲子鉴定与遗传标记亲子鉴定与遗传标记n亲子鉴定：亲子鉴定：应用生物学技术方法来检测应用生物学技术方法来检测遗传标遗传标记记，并依据，并依据遗传学理论遗传学理论进行分析，从而对被检者进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定，之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定，实质是一种特殊的个体识别实质是一种特殊的个体识别血液细胞表面的标记血液细胞表面的标记血液蛋白质的标记血液蛋白质的标记蛋白质标记蛋白质标记 DNA标记标
2、记u 限制性酶切片段多态性限制性酶切片段多态性u DNA长度多态性（微卫星长度多态性（微卫星STR）u DNA序列多态性序列多态性.4 遗传标记分类.5蛋白质遗传标记（血型检查）n由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最由等位基因决定的红细胞表面抗原的差异，为最早用于亲子鉴定的遗传标记，有早用于亲子鉴定的遗传标记，有ABOABO、MNMN、P P、RhRh等等2121个血型系统。个血型系统。特点：特点：遗传性状简单，符合孟德尔遗传规律遗传性状简单，符合孟德尔遗传规律遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响遗传多态性，不易受年龄、性别、疾病影响操作简单、重复性好，结果明确操作简单、重复性好，结果
3、明确.6ABO血型检查 人的ABO血型是受A,B,O三个复等位基因控制的，O为隐性基因，A、B为显性基因。 决定ABO血型的基因型AO,AA,BO,BB,OO,AB等6种，表现型有4种：A型、B型、 AB型和O型；根据孟德尔遗传规律，即可计算出孩子的可能血型的概率。.7红细胞ABO血型检查 孩子的血型不是唯一确定的 除了A型血与B型血的人婚配外，其他血型组合都有概率为0的不可能事件 只能否定只能否定.8蛋白质遗传标记检测的局限性蛋白质遗传标记检测的局限性n对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而对检材需要量大，且对时限要求较高，蛋白质容易失活而得不到理想的结果，不适用于陈旧、微量检材
4、（得不到理想的结果，不适用于陈旧、微量检材（HLAHLA分型分型要求采血后要求采血后16-2416-24小时内必须检验）小时内必须检验） n多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除，多态性信息含量有限，鉴别能力有限，只能用于父权排除，准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定准确率较低，不宜用于父权肯定和同一认定n存在有生理或病理性变异（如：存在有生理或病理性变异（如：A A，O O型血的人受大肠杆菌型血的人受大肠杆菌感染后感染后B B抗原的检测可能呈阳性）抗原的检测可能呈阳性）.9DNADNA分子遗传标记的检测分子遗传标记的检测vDNADNA指纹技术（指纹技术（RFLPRFLP）：第一
5、代遗传标记：第一代遗传标记vPCRPCR分型技术分型技术：第二、三代遗传标记的检测：第二、三代遗传标记的检测( (微卫星微卫星STRSTR位点和单核苷酸多态性位点和单核苷酸多态性SNP)SNP)线粒体线粒体DNADNA SNPSNP 核核内染色体内染色体 STR STR .10n1985 英国 Jefferys Naturen人源小卫星 DNA 用作基因探针，同人体核 DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为 DNA指纹 n实验程序：基因组实验程序：基因组DNADNA的提取的提取 限制性内切酶消化酶切限制性内切酶消化酶
6、切 电泳分离电泳分离 印迹转移印迹转移 探针制备和标记探针制备和标记 分子杂交和自显影分子杂交和自显影 DNA指纹技术（RFLP）.11DNA指纹技术（RFLP）n实验结果（实验结果（DNADNA指纹图谱）：指纹图谱）：n优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传优点：群体多态性高，稳定遗传，孟德尔遗传n缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、缺点：操作繁琐、对检材的质、量要求较高、灵敏度低、没有种属特异性没有种属特异性.12PCR分型技术（现代DNA亲子鉴定方法）PCRPCR扩增序列多态性标记（扩增序列多态性标记（PCR-SNPPCR-SNP分析）分析）PCRPCR扩增长度多态性标记
7、（扩增长度多态性标记（PCR-STRPCR-STR分型）分型）优点：快速、简便、灵敏、特异，适用于优点：快速、简便、灵敏、特异，适用于微量陈旧的生物学检材微量陈旧的生物学检材.13 TAGATAGATAGA TAGA TAGATAGA 1 2 3 4 5 n微卫星DNA，简短串联重复（STR）n是一种广泛分布在人类基因组中具有长度多态性的DNA序列。由2-6bp的核心序列头尾相连串联重复构成，通常重复4-60次不等（串珠结构）PCRPCR扩增长度多态性标记扩增长度多态性标记.14n(TTTTA)4 76bpn(TTTTA)4 TTTTA 81bpn(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TT
8、TTA 91bpn(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 96bpn(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 101bpn(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 106bpn(TTTTA)4 TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA TTTTA 111bpApo(a)基因 .15STR的特点多态性（多态性（Polymorphism ）：）：主要由核心序列主要由核心序列拷拷贝数目即重复次数贝数目即重复次数的变化，产生长度多态性的变化，产生长度多态性目前国内
9、外最广泛应用的遗传标记目前国内外最广泛应用的遗传标记多态性信息含量大，准确率高达多态性信息含量大，准确率高达99.99999%，可，可用于个体识别用于个体识别扩增片段较短（扩增片段较短（100-300bp），易于检测，适用），易于检测，适用的生物检材类型广泛的生物检材类型广泛灵敏度高，灵敏度高，50pg，对于检材要求不高，对于检材要求不高.16.17DNA条带、重复次数与遗传的关系.18STR等位基因命名n等位基因通过PCR产物长度来区分和命名.19 样本收集样本收集DNA提取多重多重PCRABI3130毛细管电泳毛细管电泳结果分析结果分析签发报告签发报告亲子鉴定亲子鉴定（STR检测）检测）的
10、流程的流程.20检材的收集n血液血液n精液精液n颊粘膜颊粘膜n病理切片病理切片n头发头发n牙齿牙齿n骨骼骨骼n组织组织n石蜡包埋组织石蜡包埋组织血痕血痕Only a very small amount of blood is needed to obtain a DNA profile.21 样本收集样本收集DNA提取多重多重PCRABI3130毛细管电泳毛细管电泳结果分析结果分析签发报告签发报告STR检测的流程.22ORGANICFTA PaperCHELEXBlood stainPUNCHWASH Multiple Times with extraction bufferPERFORM P
11、CRPCR ReagentsSDS, DTT, EDTA and proteinase KINCUBATE (56 oC)Phenol,chloroform,isoamyl alcoholQUANTITATE DNAApply blood to paper and allow stain to dryBlood stainVORTEX(NO DNA QUANTITATION TYPICALLY PERFORMED WITH UNIFORM SAMPLES)WaterINCUBATE (ambient)5% ChelexINCUBATE (100 oC)REMOVE supernatantINC
12、UBATE (56 oC)QUANTITATE DNAPERFORM PCRPERFORM PCRCentrifugeCentrifugeCentrifugeCentrifugeREMOVE supernatantTRANSFER aqueous (upper) phase to new tubeCONCENTRATE sample (Centricon/Microcon-100 or ethanol precipitation)CentrifugeTE bufferFigure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition
13、2005 Elsevier Academic PressDNA的提取.23 样本收集样本收集DNA提取多重多重PCRABI3130毛细管电泳毛细管电泳结果分析结果分析签发报告签发报告STR检测的流程.24多重荧光PCR.25D3S1358TH01D21S11D18S51Penta ED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POPenta DAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex 16 kit (Promega Corporation)ILS600 CXR size standardCXR (Red)FL (Blue)JOE (Green)TMR (Ye
14、llow)PCR product size (bp)Figure 5.4, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic PressD3S1358TH01D21S11D18S51Penta ED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POPenta DAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex 16 kit (Promega Corporation)ILS600 CXR size standardCXR (Red)FL (Blue)JOE (Green)T
15、MR (Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51Penta ED5S818D13S317D7S820D16S539CSF1POAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex 16 kit (Promega Corporation)ILS600 CXR size standardCXR (Red)FL (Blue)JOE (Green)TMR (Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51Penta EAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex 16 kit (Promega Corporation)ILS600 CXR siz
16、e standardCXR (Red)FL (Blue)JOE (Green)TMR (Yellow)D3S1358TH01D21S11D18S51Penta EAMELVWAD8S1179TPOXFGAPowerPlex 16 kit (Promega Corporation)ILS600 CXR size standardCXR (Red)FL (Blue)JOE (Green)TMR (Yellow)AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems)6-FAM (Blue)VIC (Green)NED (Yellow)PET (Red)D8S117
17、9D21S11D7S820CSF1POD3S1358TH01D13S317D16S539D2S1338D19S433D18S51TPOXVWAAMELD5S818FGAGS500 LIZ size standardLIZ (Orange)AmpFlSTR Identifiler kit (Applied Biosystems)6-FAM (Blue)VIC (Green)NED (Yellow)PET (Red)AMELD5S818FGAGS500 LIZ size standardLIZ (Orange).26 样本收集样本收集DNA提取多重多重PCRABI3130毛细管电泳毛细管电泳结果分
18、析结果分析签发报告签发报告STR检测的流程.27LaserInletBuffer Capillary filled with polymer solution5-20 kV-+OutletBuffer Sample trayDetection window(cathode)(anode)Data AcquisitionSample tray moves automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in successionFigure 12.3, J.M. Butler (2005)
19、 Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press扩增产物电泳和检测在ABI基因分析仪上完成.28ABI遗传分析仪家族.293130遗传分析仪的正面结构.30n技术核心（电泳与检测同时进行） 毛细管电泳技术：PCR产物片段越长，迁移越慢，到达荧光检测窗口所需要的时间越长 荧光检测技术：CCD（将收集到的荧光信号转换为电信号传输入电脑）遗传分析仪的基本原理.31355075100139160200250300340350400450490500150DNA fragment peaks in sampleDNA SizeD
20、ata Point147.32 bp165.05 bp100139150160200250DNA fragment peaks are sized based on the sizing curve produced from the points on the internal size standard(a)(b).32Autosampler TrayPump BlockcapillaryDetection windowSyringe filled with POP-4 polymerInjection electrodeHeated plate for temperature contr
21、olBuffer(inlet)Buffer(outlet)Mechanical stepper motorDeionized watersample tubes.33步骤1 毛细管灌胶n每次电泳前毛细管都会灌胶，替换已经用过的旧胶，不会污染新的样品.34步骤2 样品盘移动n样品盘X、Y、Z三维移动n支持96孔或384孔样品盘n有专门的盛放缓冲液、水及废液的4个槽.35步骤3 自动电进样和电泳n毛细管和电极进入样品溶液n仪器开始加电压n荷负电的DNA分子进入毛细管，并在电场的作用下向阳极泳动.36步骤4 荧光激发及检测分析n五色荧光标记的DNA片段按大小依次通过激光检测区，小片段在前，大片段在后
22、n激光激发荧光分子，产生荧光信号n发射的荧光信号被CCD收集n数据收集软件自动将光学信号转换成电泳图谱中的有色峰，并通过自动分析软件进行分析.37.38.39 样本收集样本收集DNA提取多重多重PCRABI3130毛细管电泳毛细管电泳结果分析结果分析签发报告签发报告亲子鉴定的流程.40肯定案例.41排除案例排除案例.42结果的判定结果的判定n每个位点都符合遗传规律，则肯定n大于三个位点不符合，则排除n小于三个位点不符合，则考虑是遗传变异.43位点父親小孩母親血型 (ABO)AAAD16S53911, 1112, 1112, 12D7S82011, 1011, 1112, 11D13S31712
23、, 912, 913, 9CSF1PO12, 912, 1213, 12TPOX11, 811, 1111, 9TH019, 89, 99, 9F13A016, 3.23.2, 3.26, 3.2FES/FPS11, 1111, 1111, 11vWFA31/A 17, 1617, 1618, 17HPRTB13, 1314, 1314, 13F13B10, 1010, 1010, 10FABP10, 910, 1011, 10LPL12, 1010, 1012, 10CYAR0411, 77, 711, 7CD47, 77, 712, 7GPP3A096, 66, 66, 6D8S11791
24、1, 1016, 1016, 12肯定案例肯定案例.44排除案例排除案例STR位点拟父小孩母親血型 (ABO)BOBD16S53911, 1013, 913, 13D7S82012, 1110, 911, 10D13S31713, 1212, 1011, 10CSF1PO10, 1011, 1011, 11TPOX10, 98, 811, 8TH0110, 99, 99, 9F13A013.2, 3.26, 44, 3.2FES/FPS12, 1111, 1111, 10vWFA31/A 19, 1818, 1616, 16HPRTB14, 1413, 1213, 13F13B9, 910,
25、1010, 9CYAR0411, 76.1, 6.111, 6.1CD47, 712, 1212, 7.45STR分型检测的应用n已婚夫妇，丈夫怀疑孩子非己所生n私生子n超生子女血缘鉴定n移民案件n怀疑育婴室调错婴儿n拐卖儿童，失散儿童nn大型灾难中受难者身份识别n无名尸体身份鉴定n移植鉴定n病理切片来源鉴定n刑事案件中犯罪现场生物检材来源鉴定n亲权鉴定亲权鉴定个体识别个体识别.46Y Y染色体染色体STRSTR在亲子鉴定中的应用在亲子鉴定中的应用.47.48n作为常规亲子鉴定的有力补充，用于父子单亲鉴定，叔侄，兄弟，祖孙亲缘关系的鉴定n性侵犯案件发生48小时后仍可以检出，男女混合斑的检查n个
26、体识别：刑侦过程中确定性别，提供线索，缩小侦查范围n人类迁移的研究：父系进化史.49Modern Use of Y-STR TestingCaptured December 13, 2003Is this man really Sadaam Hussein?Uday and Qusay Hussein Killed July 22, 2003Matching Y-STR Haplotype Used to Confirm Identity (along with allele sharing from autosomal STRs)Butler, J.M. (2005) Forensic DN
27、A Typing, 2nd Edition, Box 23.1, p. 534 .50DNA序列多态性标记.51线粒体线粒体DNADNA多态性在亲子鉴定中的应用多态性在亲子鉴定中的应用.52线粒体线粒体DNADNA特征特征.53Control region (D-loop)1/16,569cyt bND5ND6ND4ND4LND3COIIIATP6ATP8COII12S rRNA16S rRNAND1ND2COIOH9-bp deletionOLFVL1IQMWANCYS1DKGRHS2L2EPTHV1HV216024163657334016024576“16,569” bp122 tRNAs
28、2 rRNAs13 genesHeavy (H) strandLight (L) strandFigure 10.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic PressCoding Region.54线粒体DNA多态性分析nDNA提取n引物设计合成和HVI和HVII的PCR扩增nPCR产物测序n序列比对.55线粒体DNA序列分析结果解读n 若两份检材的若两份检材的DNADNA序列相同，则表明这有可能来自同序列相同，则表明这有可能来自同一个母系亲属一个母系亲属n 检材和嫌疑人检测结果有检材和嫌疑人检测结果有1-21-2个个bpbp不一致，而且碱基不一致，而且碱基的位置为异质性热点，则倾向于不排除的位置为异质性热点，则倾向于不排除n 3 3个碱基序列不同时，在排除污染、细胞核假基因扩个碱基序列不同时，在排除污染、细胞核假基因扩增产物的情况下，并按照国际法医遗传学会增产物的情况下，并按照国际法医遗传学会mtDNAmtDNA标准标准操作方法执行的，可以做出排除结论。操作方法执行的，可以做出排除结论。 .56n母子鉴定n同胞兄妹鉴定n母系血缘鉴定.57.
