1、微生物标本采集技术 临床微生物 环境微生物感染办 张瑞芳正确的微生物标本采集和运送，是准确的病原学诊断的前提基本原则1、及时采集微生物标本作病原学检查2、在抗菌药物使用前采集标本3、采样时严格执行无菌操作4、采样后立即送检5、棉拭子标本宜用运送培养基6、标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂7、送检标本时应注明来源和检验目的8、混有正常菌群的标本，不可置肉汤培养如何提高细菌阳性检出率、标本采集时机、标本采集方法、标本的质与量、标本的运送与保存、镜检筛选合格标本、高质量、多种分离培养基培养环境一、痰标本采集关于咳痰标本 在抗菌素应用前采集标本 标本采集后12h内必须立即进行实验室处 理 痰标本应用
2、最早且广泛，但也是最受争议的标本 采集标本过程中要有专业的医务人员指导使下呼吸道感染病原诊断成为难题 细菌（包括防线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌） 真菌（包括肺孢子菌） 病毒 支原体、衣原体与立克次体 原虫 寄生虫痰标本采集自然咳痰标本患者清晨起床后，用清水或冷开水反复漱口去除过量的口腔细菌，有假牙者应取下假牙先轻咳，咳出口腔中的痰液弃去，再用力深咳，从气管咳出呼吸道深部的痰，直接吐入清洁、无菌的容器中无痰可用3%-5%NaCI 5ml雾吸约5min导痰也可用物理疗法。体位引流等法取痰几种下呼吸道直接采集的标本 经气管穿刺吸引经胸壁针刺吸引经支气管镜采样 支气管肺泡灌洗 经支气管镜直接吸引开胸
3、肺活检经人工气道吸引分泌物 痰标本采集吸痰吸痰：无法咳痰或不合作者、人工气道者，戴好无菌手套，无菌集痰器分别连接吸引器和无菌吸痰管。按吸痰法将痰吸入无菌集痰器内，加盖送检经支气管镜直接吸引：注意严格无菌操作二、尿标本的正确采集清洁中段尿标本应保证尿液在膀胱内至少停留4h以上。最好留取早晨清洁中段尿标本方法：患者睡前少饮水，清晨起床后先用肥皂水清洗会阴部，女性应用手分开大阴唇，男性上翻包皮，仔细清洗，再用清水冲洗尿道口周围；开始排尿，将前段尿排出，弃去，不要停顿，直接将中段尿10-20ml直接排入专用的无菌容器中，立即送检。容器内是无菌的，所以打开容器盖后，应拿在手中，不要随意乱放。记录留取标本
4、的时间，保证在留取标本后1小时内送至检验科尿标本正确采集-留置导尿消毒导尿管外部（接头上端近会阴部），按无菌操作方法用注射器穿刺导尿管吸取尿液10ml，操作时注意防止混入消毒剂（推荐用三步消毒法：75%酒精-2%碘酒-75%酒精脱碘待干）注意不能从收集袋中采集尿液三、血培养标本采集1、手清洁：无明显污染使用速干手消毒液进行手卫生2、血培养瓶口消毒：75%酒精消毒一遍，待干60s3、静脉穿刺消毒：推荐用三步法用75%酒精消毒采集部位用2%碘酒从穿刺点向外画圆消毒，至消毒区域直径达5cm以上，涂擦穿刺皮肤2遍，待干75%酒精脱碘：用75%酒精由内向外涂抹去碘酒液，待酒精挥发干燥后采血操作注意事项：
5、从静脉采血，不建议从动脉采血用注射器无菌穿刺取血后，勿换针头（如果行第二次穿刺，应换针头）直接注入消毒后的血培养瓶血抽到培养瓶后，轻轻颠倒混匀以防血液凝固，立即送检，切勿冷藏！多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛污染的可能。除非无法作静脉穿刺取血，否则不应从留置导管内取血。抽血前应将标签贴于血培养瓶颈上，标签内容包括病人基本信息、采血时间、采血部位。注意不要把标签贴在培养瓶条形码上，否则仪器无法识别。血培养次数和采血时间采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，在患者发热期间越早越好，以发热高峰前1h内或病人寒战和发热开始时采集为宜。在10分钟内与不同部位采集外周血23份培养（有助于判断
6、是污染还是感染，提高检出阳性率）注意报阳时间，阳性瓶数。在采取血培养后的2-5天内，不需要再重复采取血培养，因为进行治疗后的2-5天血液中的感染细菌不会马上消失。 四、对可疑中心静脉导管相关血流感染1、保留导管2、外周静脉血一份，中心静脉导管血1分，不用弃去导管起始部分的血液。 3、拔除导管：4、2个外周静脉血、导管尖端5cm(在进行中心静脉导管血和周围静脉血培养时应记录报阳时间）血管内导管尖段标本的采集、送检程序用75%酒精清洁导管周围皮肤无菌操作移动导管，剪取尖端末端5cm,直接置入无菌试管内或直接置入血平板内。立即送检（不超过15min),防止干燥如因怀疑CRBSI移除皮下埋置式静脉输液
7、港，港内容物及导管尖端作定量培养。血培养常见错误 培养瓶放冰箱 瓶橡胶塞上小盖未打开直接穿刺 抽血后未及时混匀血液凝固五、如何正确运送标本1、运送培养基温度应适当 2、原则：保持细菌活力 3、血培养、脑脊液标本：应及时送检；不能及时送检的标本应置温箱或室温中，切不能放入冰箱中保存（除病毒、霉菌、分支杆菌培养样本置4) 4、痰、尿等标本：如不能及时送检可置冰箱，以抑制细菌生长，但时间不能超过6h. 六、各种标本储存的环境 标本采取后应该立即送检，如不能立即送检，储 存的环境要求： 储存环境标本来源4冰箱-痰、尿液、粪便、活检组织、气枪冲洗物、导尿管、心包积液、脓和伤口分泌物等 室温（25）-血液
8、培养、脑脊液、泌尿生殖道、眼、耳、鼻、喉、血管导管尖、体液、厌氧菌培养标本。美国的理念1970年以前，美国的医院定期对空气和环境表面（如地面、墙壁、台面）进行培养。到了1970年，CDC和美国医院协会（AHA）主张停止对环境的常规培养，因为医院感染发生率与空气或环境表面中总的微生物污染水平不相关。且环境表面或空气中微生物含量的允许水平也没有有意义的标准。1970-1975年，美国有25%的医院减少了这种常规的环境培养工作-一个已经持续的趋势。什么情况下要求进行环境采样四种状况下要求进行环境采样： 一、是当环境中的宿主或媒介物被认为在疾病传播中有流行病学意义时，提供疾病或感染爆发的依据 二、是在
9、研究过程中进行适当的环境采样 三、是为了监测潜在的危险环境条件，确认有害的化学或生物因素的存在，并验证危险因素的成功消除 四、是为了质量保证（QA）而采样，以评估改变感染控制措施取得的效果或是确保设施或系统按照规范或预期结果执行。一、物体表面采样 物体表面细菌总数的检测评价 被污染程度 主要依据 消毒效果物体表面采样-涂抹法涂抹法：将5cm5cm的标准灭菌规格板，放在被检测物品表面，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入盛有10ml生理盐水的试管中，充分振摇1min,作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上进行计数，然后根据平板上
10、菌落数得出物品表面每平方厘米的细菌数物体表面采样-斑贴法斑贴法：按无菌操作方法将5cm5cm的无菌滤纸用灭菌生理盐水浸湿，均匀贴附与物体表面，1min取下放入盛有25ml灭菌生理盐水试管中，充分振摇1min，作适量稀释后，接种于普通营养琼脂平板上作菌落计数，同样得出物品表面每平方厘米的细菌数二、消毒物品表面的监测：1、采样时间：消毒处理后4小时内进行采样2、采样面积：被采面积100平方厘米，取全部表面； 100平方厘米，取100平方厘米。 3、采样方法： 用5cm*5cm的标准灭菌规格板放在被检消毒物品表面，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次并随之转动采
11、样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子投入王景洗脱液中，立即送检。 小型物体表面的结果计算用cfu/件表示。物表监测结果范围1、类、类环境：5cfu/cm22、类、类环境：10cfu/cm2 GB15982-2012 医院消毒卫生标准 4.1.1三、手消毒效果监测1、采样时间：在接触病人和从事医疗活动前进行采样或消毒后立即采样2、采样面积及方法（棉拭方法） 被检人五指并拢，用含相应中和剂无菌洗脱液（5ml)的棉拭子在双手指手监测标准范围1、外科手消毒：5cfu/cm22、卫生手消毒：10cfu/cm2 GB15982-2012医院消毒卫生标准4.2四、空气消毒效果监测 1、采样时间段：在消毒处理后
12、，操作前进行采样 2、采样方法：按面积定数、打开、盖搭皿体边缘 3、采样高度：距地面1.5米（80-150） 4、布点方法：室内面积30，设内、中、外对角线三点; 室内面积30设4角及中央5点均距墙壁1米 5、收取方法：由外往里逐一收取，避免穿过培养皿从里往 外收取1、监测时间：每季度一次2、类环境、监测标准：洁净手术部(室)和其他洁净场所，空气中的细菌菌落总数要求应遵循G B50333-2013医院洁净手术部建筑技术规医院洁净手术部建筑技术规范范3.0.2-2 3、类环境监、测标准：非洁净手术部(室)、产房、重症监护病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(15min直径9cm平皿) 4、 类环境
13、、监测标准：儿科病房、母婴同室、妇产科检查室、人流室、治疗室、换药室、消毒供应中心、血液透析中心(室)、急诊室、化验室、各类普通病房、感染疾病科门诊及其病房，空气中的细菌菌落总数4CFU(5min直径9cm平皿)G B50333-2013医院洁净手术部建筑技术规范医院洁净手术部建筑技术规范3.0.2-2 类环境：洁净手术室、 级：级 手术区0.2cfu/30min. 90皿 周边区0.4cfu/30min. 90皿（100级）6号手术间级 手术区0.75cfu/30min. 90皿 周边区1.5cfu/30min. 90皿级 手术区2cfu/30min. 90皿 周边区4cfu/30min.
14、90皿（10000级）5号手术间级6cfu/30min. 90皿五、消毒液监测1、采样方法：用无菌注射器按无菌操作方法:10ml培养基培养基吸取1ml被检消毒液；5ml培养基吸取0.5ml被检消毒液，加入培养剂中混匀。2、消毒液标准：使用中灭菌用消毒液：无菌生长使用中皮肤黏膜消毒液染菌量：10cfuml其他使用中消毒液染菌量：100cfuml消毒液监测标准范围1、使用中灭菌剂：无菌生长2、使用中皮肤黏膜消毒液：10cfu/ml3、其他使用中消毒液：100cfu/ml六、紫外线强调监测方法1、日常记录：使用后进行消毒时间累积，使用超过1000小时的应加强监测或更换建立紫外线消毒使用登记本，每周用
15、75%酒精擦拭灯管并记录2、照射强调：普通30W直管型紫外线灯，新灯管的辐照强度90Wcm2为合格符合GB19258要求;使用中紫外线灯照射强度70Wcm2为合格； 3、强调监测：每半年一次监测前用75%酒精酒精清洁灯管表面，开灯，待其稳定5分钟后，放置强度监测卡于灯管下垂直1米处，正面朝上，照射1分钟，取卡，读数。4、注意事项：做好自身防护尤其是眼睛；检测卡要闭光保存。七、高度危险性医疗器械手术器械、穿刺针等：无菌生长GB15982-2012医院消毒卫生标准4.3 不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查八、中度危险性医疗器械：呼吸机管路、口表等：20 cfu/件， 不得检出致病性微生物 每季度
16、监测九、低度危险性医疗器械听诊器、血压计袖带等：20 cfu/件， 不得检出致病性微生物 每季度监测十、消毒内镜胃镜、肠镜等：20 cfu/件WS507-2016软式内镜清洗消毒技术规范7.3 每季度监测十一、透析用水细菌：100cfu/ml 每月监测内毒素：0.25EU/ml 每季度监测 YY0572-2015血液透析及相关治疗用水4.1十二、透析液细菌：100cfu/ml 每月监测内毒素：0.5EU/ml 每季度监测YY0598-2015血液透析及相关治疗用水53.54每季度卫生学监测培养基统计表 十三、环境管理净化系统进行：每天洁净手术室的净化系统应在术前30min开启，术后30min关
17、闭。净化系统应连续运行至清洁消毒工作完成连台手术的最短自净时间要求：I级：15minII级：25minIII级：30minIV级：40min 环境管理 压差控制洁净手术室在手术中应保持正压装态，洁净区对非洁净区的静压差为10pa.高洁净室对低洁净室应保持正压不同时开启洁净手术室（包括缓冲间）的两道门手术过程中，应保证门关闭：以避免频繁的开关门时空气流动污染，通向外走廊的门，术中禁止打开，按专科相对固定手术间，所有物品应定位放置，减少进出手术间的次数清洁、无尘、无污染维持无关物品不得进入手术室，洁净区的物品需经清洁消毒处理方可进入洁净区物品如被服、床垫、清洁消毒工具等材质选择应遵循产尘少的原则手
18、术室墙、地光滑、无裂隙手术用房各种物体表面在每日术前和术后湿式擦拭清洁、消毒；手术过程中严格控制血迹、体液污染扩散（医疗废物密闭收集和转运），一旦污染立即消毒和局部清理，采用覆盖消毒方法：蘸有消毒剂（不流淌为宜）的布类或多层纸巾覆盖污物，或采用蘸有消毒剂（不流淌为宜）的布类或纸巾由污染物外四周2米处擦抹，消毒时间30min后，将布类或纸巾包裹污物丢弃不同区域及不同手术间清洁、消毒工具分开使用医院空气净化管理规范空气洁净技术维护与保养要求空气处理机组、新风机组应定期检查，保持清洁。新风机组粗效滤网宜每2天清洁一次；粗效过滤器宜1月2月更换1次；中效过滤器宜每周检查，3个月更换1次；亚高过滤器宜每
19、年更换。发现污染和堵塞及时更换末端高效过滤器宜每年检查一次，当阻力超过设计初阻力160pa或已经使用3年以上时宜更换排风机组中的中效过滤器宜每年更换，发现污染和堵塞及时更换定期检查回风口过滤网，宜每周清洁一次，每年更换一次，如遇特殊污染，及时更换，并用消毒剂擦拭回风口内表面设专门维护管理人员，遵循设备的使用说明进行维护保养；并制定运行手册，有检查和记录做好洁污控制无菌手术与污染手术必须分室，如果不得不同室进行，应先行无菌术，后做污染手术接台手术人员在2台之间需严格进行洗手，消毒手臂及更换无菌手术衣、手套两台手术之间，应尽量做好环境净化和药液湿式消毒，包括湿式地面落实责任制各手术间定人负责，物品等进入洁净手术室前，必须拆除外装，设备应安装完毕，擦拭干净方可进入。手术人员隔离鞋每日用消毒液浸泡消毒1次每月对室内空气、物体表面、手术人员的手进行细菌培养，以检测净化效果，并分析不合格原因，制定有效整改措施基础环节质量管理外科手消毒是控制感染的有效措施术中严格遵守无菌操作原则骨科手术后不应在洁净区打石膏，以避免石膏粉尘污染室内空气，引发院内感染事件或需要使用高成本的高分子石膏如需要打石膏者要求术后将病人移到清洁区的麻醉恢复室进行
