1、医学资源1医学资源2医学资源3（一）几种常用提取方法（一）几种常用提取方法 1酸、碱、盐水溶液提取方法 2表面活性剂提取方法与反胶束提取方法 3有机溶剂提取 4. 双水相萃取法 5超临界萃取法医学资源4医学资源5 1.浓缩方法： 盐析； 有机溶剂沉淀； 高分子脱水 超滤； 真空浓缩或薄膜浓缩； （书P45页）医学资源6医学资源72.2.干燥：低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥干燥：低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥（书P47页）医学资源8医学资源9医学资源10(书P49页)医学资源11医学资源12医学资源13医学资源14医学资源15 第三第四轮同第二轮第三第四轮同第二轮医学资源16医学资源17医学
2、资源18医学资源19 发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。1液体培养深层发酵2固体培养浅盘培养发酵设备：空压机、种子罐、发酵罐，蒸汽发生器、空气过滤器、离心机及多种参数控制与检测设备，以L-Lys生产设备为例，见图1所示。医学资源20医学资源211基因工程操作过程：（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）工程菌的克隆与鉴定；（5）目的基因扩增与蛋白表达。医学资源22医学资源23医学资源24医学资源25医学资源26医学资源27（3 3）化学合成法）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合
3、成DNA。医学资源282 2DNADNA重组体的构建重组体的构建 根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli质粒非表达型 pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，噬菌体DNA作为载体，非表达型gt10，表达型gt11。（2）芽孢杆菌 pUB110 pE194和pC194（3）链霉菌 pIJ101 pSG5 cDNA与载体连接方法 同聚尾连接法 人工接头连接法医学资源293 3重组体的表达系统重组体的表达系统（1）原核表达系统 E.coli；芽孢杆菌Bacillus；链霉菌Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取
4、困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性医学资源30（2）真核表达系统 酵母表达 毕赤酵母（pichia psatoris）受甲醇诱导 优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。 动物细胞 哺乳动物细胞CHO（仓鼠细胞） 昆虫细胞家蚕细胞医学资源31包含体 inclusion bodies: 大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。医学资源32为防止或减少包含体的形成常用方法： （1）降低培养温度 从37降到30可显著降低包含
5、体形成率。 （2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。 硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。医学资源331、酶工程(enzyme engineering) 研究内容（1）酶的发现、分离纯化与生产应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）抗体酶、模拟酶 合成酶及酶的人工设计。（书P102）医学资源342、固定化酶(immobilized enzyme)（1）固定化稳定性提高（2
6、）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）便于产物的分离、纯化医学资源35共价键结合酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续医学资源363 3、制备方法：、制备方法：（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺（3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。（4）交联法：用双功能试剂 将酶与载体交联固定化 图: 酶固定化方法示意1. 离子结合 2.共价结合 3.交联4. 聚合物包埋 5. 疏水作用6. 脂质体包埋 7. 微胶囊医学资源3
7、71 1目的：目的：（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究；（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用。医学资源382 2规模：规模： 中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键医学资源393 3、中试放大时应具备的条件、中试放大时应具备的条件 （1）有稳定的工艺：收率，质量可靠 （2）操作条件基本确立 （3）已建立中间品和成品分析方法 （4）生物材料已鉴定 （5）物料平衡、三废处理已基本解决 （6）中试规模、产品产量，规模已确定 （7）安全生产已有方案医学资源404 4中试放大要解决的问题中试放大要解
8、决的问题（1）原辅材料规格 （2）设备选型与材质选用 （3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控标准与检定方法（5）下游工艺优化与稳定制造规程的制定医学资源411 1、放大方法、放大方法 （1）经验放大 （2）相似放大 （3）数学模型放大2 2、总结内容：、总结内容：（1）确定工艺路线，优化工艺条件，制定制造规程。（2）制定岗位操作、投产（3）进行材料衡算（4）安全生产与处理（5）原辅料及产品质控方法与标准测定。（6）产品规格标准制定（7）消耗定额，成本核算，工时，生产周期计算。医学资源421组合生物合成 组合生物合成(combinatorial biosynthesis)或组合生物学(com
9、binatorial biology)是指应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇,产生一些新的非天然的基因簇,从而合成许多新的非天然的化合物,为生物药物的筛选提供丰富的化合物资源医学资源43微生物药物通常是由非常简单的化学物质, 如小分子羧酸或某些氨基酸作为合成起始单位和延伸单位合成的, 参与合成的酶为一系列基因编码的多酶体系 (构成一个合成途径) 。研究表明, 参与这类小分子生物合成的基因通常是连锁或邻接而构成一个基因簇(cluster) , 这为基因的克隆和操作提供了方便, 同时由于参与次级代谢生物合成酶系对底物的特异性, 专一性要求不是很严格的, 对结构相类似的底物均可识别, 这一特
10、点为不同基因组合产生新的化合物创造了条件医学资源44酮基合成酶(KS)、酰基转移酶（AT）、脱氢酶（DH）、烯醇还原酶（ER）、酮基还原酶（KR）和酰基载体蛋白（ACP）等功能域医学资源45医学资源46酶酶1 基因基因酶酶2 基因基因酶酶3 基因基因质粒质粒医学资源472药物基因组学 是一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物的反应的一门科学。由对基因的研究发现带有某种特定基因的人，会对某种特定的药物成份，产生某种特定的反应。将这个基因、药物成份与服用后反应的一连串关联，运用在用药之上，就可以知道带有某特定基因之人，不适合服用含有某特定成份的药物，进而降低药物副作用产生的风险；反之，也可以知道
11、带有某特定基因之人，特别适合服用含有某特定成份的药物，进而提升治愈疾病的机率 3药物蛋白质组学 医学资源484蛋白质工程 5基因治疗与基因疫苗 6糖基化工程 7先导物高通量筛选与药物合理设计（rational drug design） 8核酶、抗体酶、干扰RNA 9药物生物信息学 10功能抗体与人工智能技术和虚拟人技术医学资源49医学资源502 2蛋白质工程研究基本程序蛋白质工程研究基本程序医学资源51医学资源52医学资源53医学资源543 3应用：应用：（1）鉴定与疾病相关的专一性蛋白（2）候选靶点的鉴定与确立（3）药物作用靶点与药物作用有效性和信号转导的分析（4）药物作用与蛋白质组的作用模式（5）研究药物代谢与不良反应、毒副作用的酶谱，提供病人分类，实现个性化用药医学资源55
