1、 一、基础知识一、基础知识 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过植物每年产生的纤维素超过7070亿吨，其中亿吨，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。不会大量积累。 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。能力。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡
2、萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消
3、失？甲试管的作用是：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？ 本实验的本实验的自变量是纤维素酶的有无自变量是纤维素酶的有无，自变量的操，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL1mL）的纤维素）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pHpH。实验分析：实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照的小实验是如何构成对照的？的？（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌
4、的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法能够通过。该方法能够通过_反应直接对微生物筛选。反应直接对微生物筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成、其原理是：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成_，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被_分解后，红色复合物就无法形成，出现以分解后，红色复合物就无法形成，出
5、现以_为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_ 来筛来筛选纤维素分解菌。选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌练一练：练一练：1.1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是下列关于纤维素酶的说法，错误的是A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖葡
6、萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是菌，下列说法错误的是A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌选出了纤维素分解菌二、实验设计二、实验设计土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上素分解菌的培
7、养基上挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落土壤取样土壤取样取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？ 选择富含纤维素的环境，如树林中多选择富含纤维素的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶等等。 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境境将滤纸埋在土壤中将滤纸埋在土壤中能使纤维素
8、分解菌相对集中，能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一。一般应将滤纸埋于深约般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右左右的土壤中。的土壤中。选择培养选择培养1、选择培养的目的：、选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物所需要的微生物培养基组成培养基组成纤维素粉纤维素粉 5gNaNO3 1gKCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g酵母膏酵母膏 0.5g水解酵素水解酵素 0.5
9、g溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL2、制备选择培养基、制备选择培养基a、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？b、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？如何进行选择的？ c、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（常用的是琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（常用的是琼脂）有选择作用，本配方中纤维素是主要碳源，所以能分有选择作用，本配方中纤维素是主要碳
10、源，所以能分解纤维素的解纤维素的 微生物可以大量繁殖微生物可以大量繁殖自变量为培养基的种类，即通用（基础）培养基和选择培自变量为培养基的种类，即通用（基础）培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素或者将纤维素改为葡萄糖。改为葡萄糖。3、操作方法：、操作方法： 将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变混浊。也可重复选择培养天，直至培养液变混浊。也可重复选择培养思考：思考：为什么选择培养能够为什么
11、选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到到“浓缩浓缩”的作用的作用1011021031041051061、制备培养基、制备培养基:参照旁栏中的比例参照旁栏中的比例2、涂布平板：将稀释度为、涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液的菌悬液各取各取0.1ml涂布在培养基上，涂布在培养基上，30倒置培养倒置培养将样品涂布到鉴别纤维素
12、分解菌的培养基上将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 参照课本参照课本刚果红染色法刚果红染色法，挑选产生透，挑选产生透明圈的菌落，明圈的菌落，挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落三、结果分析与评价三、结果分析与评价（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落否筛选出菌落（二）分离的结果是否一致（二）分离的结果是否一致 设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
13、落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。的分离结果。 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行要进行_实验，纤维素酶的发酵方法实验，纤维素酶的发酵方法有有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤维素酶测定方法，发酵。纤维素酶测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 四、课题延伸四、课题延伸
