1、抗生素类药物的质量分析方法抗生素类药物的质量分析方法（一）（一） 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素 概况概况l抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病抗生素是指在低浓度下即能杀灭或抑制其他病原微生物的药物，按其结构可以分为原微生物的药物，按其结构可以分为-内酰胺内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素。氨类、四环素类、氨基糖苷类及其他抗生素。氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而基糖苷类抗生素是由氨基环醇与氨基糖缩合而成的一类多羟基抗生素，是临床上常用的一类成的一类多羟基抗生素，是临床上常用的一类广谱抗生素。可通过微生物发酵或半合成而制广谱抗生素。可通过微生物发酵或半合成而制得。目前药典
2、收载的品种主要有：链霉素、卡得。目前药典收载的品种主要有：链霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依那霉素、阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、依替米星、庆大霉素、新霉素等替米星、庆大霉素、新霉素等结构结构庆大霉素庆大霉素OOHNHCH3OHCH3OOCNH2R1HNHONH2NH2OR2R3*1234561234561”2“ 3”4“5”* 绛红糖胺 2-脱氧链霉胺 加洛糖胺 purpurosamine deoxystreptosamine garosamine结构结构链霉素链霉素OOHCHOOCH2OHOHOHNH C NH2NHHOOOHNHCH3ONHCH3 OHNHCH2N1234
3、56 链霉胍 链霉糖 N-甲基-L-葡萄糖胺streptidine streptose N-methyl-L-glucosamine 链霉双糖胺stroptobiosamine 1232“3”5”6“41”4”*一、药典方法一、药典方法 中国药典中国药典(2000(2000年版年版) )，美国药典，美国药典(25(25版版) )、英国药典、英国药典(2000(2000年版年版) )对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微生物对氨基糖苷类抗生素的含量测定大多采用微生物法，有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高效液法，有关物质的检查大多采用薄层色谱法或反相高效液相色谱法。微生物法作为一种经典的方法
4、，仍被各国药相色谱法。微生物法作为一种经典的方法，仍被各国药典所采用。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作典所采用。本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供试品用，采用量反应平行线原理设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价。微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素效价。微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，操作费时复杂，操作费时 。以下介绍本组同学查阅的其他方法：。以下介绍本组同学查阅的其他方法：一、色谱分析法一、色谱分析法气相色谱法气相色谱法( (GC
5、)GC) 高效液相色谱法高效液相色谱法( (HPLC)HPLC) 离子交换色谱法（离子交换色谱法（IECIEC）薄层色谱法薄层色谱法( (TLC)TLC) 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法( (HPCE)HPCE)气相色谱法(GC) 氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。区无吸收，须先进行衍生化，使其适于分析。HoebusL等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素，用填充柱气相色谱法，氢火焰离子化检测器检测，在75一125的浓度范围内，呈良好的线性，杂质的定量限为0.1。PreuL等选择适当的衍生化试
6、剂，采用毛细管气相色谱。气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析氨基糖苷类抗生素也是应用比较广泛的一种联用技术。 高效液相色谱法(HPLC) HPLCHPLC测定此类药物含量大多采用反相色谱或离子对色谱测定此类药物含量大多采用反相色谱或离子对色谱系统，根据检测手段的不同可分为紫外检测、荧光检测、系统，根据检测手段的不同可分为紫外检测、荧光检测、电化学检测及质谱检测等。柱前衍生反相电化学检测及质谱检测等。柱前衍生反相HPLCHPLC是此类药是此类药物最为常用的一种测定方法。中国药典采用邻苯二甲醛物最为常用的一种测定方法。中国药典采用邻苯二甲醛(0PA)(0PA)柱前衍生化，紫外检测硫酸庆大霉素柱
7、前衍生化，紫外检测硫酸庆大霉素C C组份。同时，组份。同时，有报道用柱后衍生，荧光检测食品中的链霉素残留量。有报道用柱后衍生，荧光检测食品中的链霉素残留量。为了避免使用衍生化试剂，可以采用灵敏度较高的电化为了避免使用衍生化试剂，可以采用灵敏度较高的电化学检测器及采用学检测器及采用LC-MSLC-MS联用技术。联用技术。LC-MSLC-MS将将HPLCHPLC的高分离的高分离效能和质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相效能和质谱的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合，已成为重要的分离分析方法之一。结合，已成为重要的分离分析方法之一。离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC）l采用高效阴离子
8、交换色谱分离硫酸庆大霉素、采用高效阴离子交换色谱分离硫酸庆大霉素、硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采硫酸新霉素和硫酸奈替米星及其杂质，然后采用积分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生，用积分脉冲安培检测进行直接测定，不需衍生，简便快速。简便快速。l缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍缺点：检测器的灵敏度对药物中的微量杂质仍显不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重显不足，体系对有些组分的分离不尽理想，重现性较差现性较差l来源：仪器分析网来源：仪器分析网HPLC蒸发光散射检测法蒸发光散射检测法(HPLCELSD) l近年来出现的蒸发光散射检测器近年来出现的蒸发光散射检测器(ELSD)(EL
9、SD)由于其响应值不由于其响应值不依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样依赖被测物质的光学性质，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基品均能被检测，并且物理性质相似的物质其响应因子基本一致，灵敏度是示差折光检测器的本一致，灵敏度是示差折光检测器的2-102-10倍，现已逐渐倍，现已逐渐成为目前常用的通用型检测器。成为目前常用的通用型检测器。在用HPLC-ELSD法测定硫酸小诺霉素(C2b)注射液时发现有些样品含有庆大霉素C1a杂质；在分析庆大霉素C组分时发现有的样品在C2与C2a峰之间有小诺霉素(C2b)杂质峰。由此看出，蒸发光散射检测器的应用已为全
10、面分析无紫外吸收的氨基糖苷类抗生素的质量提供了一种新的手段。但本法也有一些不足之处，例如灵敏度比紫外检测的低(23个数量级)数据处理相对繁琐。薄层色谱法(TLC) lTLCTLC作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素作为一种定性的方法鉴别氨基糖苷类抗生素已被各国药典广泛采用。扫描密度计与已被各国药典广泛采用。扫描密度计与TLCTLC技术技术相结合产生的高效薄层色谱法相结合产生的高效薄层色谱法(HPTLC)(HPTLC)因其灵敏因其灵敏度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药度、分离度和准确度都有很大提高，已用于药物定量分析。物定量分析。 TLCTLC具有使用范围广，样品预处具有使用范围广，样品
11、预处理简单，优化展开剂的组成方便等优点，随着理简单，优化展开剂的组成方便等优点，随着吸附剂高效化，定量分析仪器化、自动化，吸附剂高效化，定量分析仪器化、自动化，TLCTLC仍然是不可替代的一种分析方法。仍然是不可替代的一种分析方法。高效毛细管电泳法(HPCE) HPCEHPCE是一类以毛细管为分离通道，以高压直流是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据电场为驱动力的新型液相色谱分离技术。根据分离模式的不同，又可分为毛细管区带电泳分离模式的不同，又可分为毛细管区带电泳(CZE)(CZE)、毛细管等电聚焦、毛细管等电聚焦(CIEF)(CIEF)、毛细管凝胶电、毛
12、细管凝胶电泳泳(CEC)(CEC)，胶束电动毛细管色谱，胶束电动毛细管色谱(MEKC)(MEKC)等。氨基等。氨基糖苷类抗生素的糖苷类抗生素的HPCEHPCE检测方法，最为常用的是检测方法，最为常用的是柱前及柱内衍生的柱前及柱内衍生的CZECZE技术，然后进行紫外检测。技术，然后进行紫外检测。二、免疫法二、免疫法(IA)lIA是近年发展起来的一种用于体内药物监测的是近年发展起来的一种用于体内药物监测的分析方法，将分析方法与免疫原理相结合，进分析方法，将分析方法与免疫原理相结合，进行超微量分析，具有灵敏度高、特异性强、用行超微量分析，具有灵敏度高、特异性强、用样少等优点。样少等优点。l根据对抗原
13、标记方法不同，根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫可分为放射免疫法法(RIA)，酶免疫法，酶免疫法(EIA)，荧光免疫法，荧光免疫法(FIA)，化学发光免疫法化学发光免疫法(CLIA)，毛细管电泳免疫分析毛细管电泳免疫分析法（法（CEIA)CEIA)和浊度免疫分析法。和浊度免疫分析法。三、三、流动注射法流动注射法(FIA) 流动注射法流动注射法(FIA)(FIA)是一种自动分析法，适用于医院制剂的是一种自动分析法，适用于医院制剂的快速检验及中间体质量控制。快速检验及中间体质量控制。 用恒流量泵使硫酸铁铵试剂和载液用恒流量泵使硫酸铁铵试剂和载液( (水水) )流过内径为流过内径为0.5l
14、0.5l mmmm的四氟乙烯泵管，与进样口注量的一定浓度硫酸链霉的四氟乙烯泵管，与进样口注量的一定浓度硫酸链霉素水溶液在反应圈中混合，反应呈包，于素水溶液在反应圈中混合，反应呈包，于520nm520nm处用处用721721分光光计测分光光计测A A，通过对数转换器，在记录仪上获得相应，通过对数转换器，在记录仪上获得相应的峰高。的峰高。 硫酸链霉素呈色原理：硫酸链霉素在硫酸链霉素呈色原理：硫酸链霉素在NaOHNaOH中水解成麦芽中水解成麦芽酚，与酚，与Fe3+Fe3+呈色，在呈色，在520nm520nm处有最大吸收峰。处有最大吸收峰。四、络合物光度法四、络合物光度法 l络合物光度法利用金属离子或
15、有机试剂与氨基络合物光度法利用金属离子或有机试剂与氨基糖苷类抗生素形成有色络合物，如依文思蓝、糖苷类抗生素形成有色络合物，如依文思蓝、曲利本红、曲利本蓝、滂胺天蓝等。应用的方曲利本红、曲利本蓝、滂胺天蓝等。应用的方法有法有显色法、褪色法和双波长叠加法对其进行显色法、褪色法和双波长叠加法对其进行含量测定。含量测定。如依文思蓝所例；如依文思蓝所例；l硫酸新霉素、卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素4种氨基糖苷类抗生素均为饱和烃的取代衍生物，分子结构中只含键和非键电子(n)，而一*，n一* 跃迁需要的能量较高，其吸收光谱带位于远紫外区。在200800nm波长范围几乎无吸收。依文思蓝(EB)系酸性双偶氮染料，
16、它具有大的共轭体系，在紫外可见光区产生强烈吸收，其最大吸收波长为609nm。当上述4种氨基糖昔类抗生素与EB染料反应形成络合物后，其最大吸收波峰视其抗生素不同而分别红移几或几十纳米，吸光度有不同程度的增大，但在染料最大吸收波长附近，即产生褪色反应 苯胺蓝苯胺蓝 在酸性条件下，苯胺蓝的多个磺酸基上的质子离解而以阴离子状态存在，此时卡那霉素则以阳离子形式存在，两者共存时，由于静电引力和电荷转移作用形成复合物使水溶苯胺蓝溶液褪色。五、五、脉冲极谱法脉冲极谱法 l原理原理 链毒素由链霉胍、链霉糖和链毒素由链霉胍、链霉糖和N N甲基甲基L L葡萄糖葡萄糖胺三部分以糖苷键彼此相连构。链霉胍结构中含有两胺三
17、部分以糖苷键彼此相连构。链霉胍结构中含有两个个C CNHNH，在滴汞电极上可以发生氧化还原反应产生，在滴汞电极上可以发生氧化还原反应产生阴极波。阴极波。l实验选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为实验选用滴汞电极为工作电极，滴汞间隔为1515秒钟，秒钟，Ag-AgClAg-AgCl电极为参比电极，内装电极为参比电极，内装1.01.0mol/Lmol/L的的KClKCl参比溶液。参比溶液。选用微铂电极为辅助电极，以稳定电极电压。药物浓度选用微铂电极为辅助电极，以稳定电极电压。药物浓度在在200700u/ml200700u/ml时，药物浓度与导数峰电流呈线性关系，时，药物浓度与导数峰电流呈线性关系，且
18、线性关系极为显著。且线性关系极为显著。 六、六、吸附伏安法吸附伏安法lB-R+(CH3)2CHCH0体系中，该类抗生素的吸附伏安行为认为其电极反应过程为化学反应(Schiff碱反应)吸附富集(在-1.35v左右)不可逆还原过程，测得参加反应的电子数为2，氢离子数为1，并导出了反应方程式。对不同醛作衍生化剂的情况作比较发现，在阴极扫描过程中，以异丁醛衍生化剂所得的还原峰，比相应的甲醛、乙醛衍生物的还原峰灵敏度高，峰形对称，重现性好。l傅晓航 张黎明 异丁醛存在下氨基糖苷类抗生素吸附伏安法研究 浙江树人大学学报 第3卷第2期2003年3月其他方法其他方法l 旋光法旋光法-旋光法快速测定硫酸卡那霉素
19、注射液旋光法快速测定硫酸卡那霉素注射液的含量的含量 黄而娟等黄而娟等 旋光法快速测定硫酸卡那雷素旋光法快速测定硫酸卡那雷素注射液的含量注射液的含量 吉林畜牧兽医吉林畜牧兽医 20042004年第年第4 4期期 l在氨基糖苷类抗生素的定性检测方面，核磁共在氨基糖苷类抗生素的定性检测方面，核磁共振波谱振波谱(NMR)(NMR)作为一种新型的技术已被用于此类作为一种新型的技术已被用于此类物质的构型研究。物质的构型研究。在该类抗生素的体内药物监测方面，自动的免疫试剂盒仍在该类抗生素的体内药物监测方面，自动的免疫试剂盒仍然是首选的方法。色谱技术和毛细管电泳技术以其专一性然是首选的方法。色谱技术和毛细管电泳技术以其专一性强、分辨率高，操作简便等特点，将逐步取代微生物法等强、分辨率高，操作简便等特点，将逐步取代微生物法等准确度低、精密度差的方法。随着准确度低、精密度差的方法。随着MSMS技术在定量方面的进技术在定量方面的进一步完善，和一步完善，和LCLC、GCGC联用，将成为此类药物分析中一种必联用，将成为此类药物分析中一种必不可少的检测手段，最具有前景的将是不可少的检测手段，最具有前景的将是CE-MSCE-MS联用技术。联用技术。Thats allThats all Thank you
