1、 酶免疫技术酶免疫技术标记免疫技术标记免疫技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：标记免疫技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+标记技术标记技术标记免标记免疫技术疫技术免疫测免疫测定技术定技术免疫组免疫组化技术化技术示踪物及示踪物及标记技术标记技术酶免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术放射免疫技术化学发光技术化学发光技术金免疫技术金免疫技术生物素生物素- -亲和素亲和素免疫放大技术免疫放大技术 酶免疫技术酶免疫技术 基本原理基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用利用酶催化底物反应的生物
2、放大作用, ,提提高特异性抗原高特异性抗原- -抗体免疫学反应的检测敏感性抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。的一种标记免疫技术。基本特点：基本特点： 标记后保留酶和抗原标记后保留酶和抗原( (抗体抗体) )的活性。的活性。 酶促反应专一性，保证特异性。酶促反应专一性，保证特异性。 底物反应放大作用，提高敏感性。底物反应放大作用，提高敏感性。 酶标试剂保存稳定。酶标试剂保存稳定。 操作简便，安全易行。操作简便，安全易行。 酶免疫组化酶免疫组化 用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体 酶免疫技术酶免疫技术 均相酶免疫测定均相酶免疫测定 酶免疫测
3、定酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 异相酶免疫测定异相酶免疫测定 （ELISAELISA） 液相酶免疫测定液相酶免疫测定酶的选择要求：活性高活性高专一性好专一性好易与抗原、抗体偶联易与抗原、抗体偶联底物易得、易保存无毒害底物易得、易保存无毒害产物易测量产物易测量酶与底物成本价廉酶与底物成本价廉优点优点( (与其他酶比较与其他酶比较) )分子量较小分子量较小标记方法简单标记方法简单较稳定较稳定溶解性好溶解性好价格较低价格较低底物种类多底物种类多HRPHRP催化反应：催化反应：DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2HD+2H2 2O O过氧化物过氧化物( (受氢体）受氢体）：H
4、H2 2O O2 2 供氢体：供氢体：OPDOPD、TMBTMB常用的酶及底物-辣根过氧化物酶(HRP)主酶是糖蛋白(275nm)，无活性，辅基亚铁血红素(403nm)，有活性纯度(RZ)=403nm/275nm 3.0酶活性单位：1min将1umol底物转化为产物所需的酶量HRP常用底物l邻苯二胺（邻苯二胺（OPDOPD）: :反应后显橙黄色，酸终止后反应后显橙黄色，酸终止后呈棕黄色呈棕黄色, ,最大吸收峰最大吸收峰275nm275nm。灵敏度高，比色。灵敏度高，比色方便。但配成应用液后稳定性差方便。但配成应用液后稳定性差, ,显色过程需避显色过程需避光，且有致变异性光，且有致变异性. .l
5、四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMBTMB）: :反应后显蓝色，目测鲜反应后显蓝色，目测鲜明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰明，酸终止后呈黄色，最大吸收峰450nm.450nm.稳定稳定性好，显色过程无需避光，无致变异性性好，显色过程无需避光，无致变异性. .碱性磷酸酶（AP）：是一种磷酸酯的水解：是一种磷酸酯的水解酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高，酶，不易透入细胞内，但因其敏感性高，空白值低，也较常用。底物常用的有对空白值低，也较常用。底物常用的有对- -硝硝基苯磷酸酯基苯磷酸酯(PNP)(PNP)，产物为黄色的硝基酚，产物为黄色的硝基酚，测定波长为测定波长为405nm405nm。-半乳糖苷酶（
6、 -Gal）：来源于大肠埃希来源于大肠埃希氏菌，不受内源性酶干扰，底物为氏菌，不受内源性酶干扰，底物为4-4-甲基甲基伞形酮伞形酮- - -D-D-半乳糖苷，产物为高强度荧光半乳糖苷，产物为高强度荧光物物4-4-甲基伞形酮，敏感性较甲基伞形酮，敏感性较HRPHRP者高者高30-5030-50倍，测量时需用荧光计。倍，测量时需用荧光计。酶标记物的制备一般要求技术方法简单、标记效率高、重复性好标记反应易控制，标记后不改变活性酶标记物较稳定，不聚合改良过碘酸钠标记法只适用于HRP过碘酸钠将HRP分子表面的多糖羟基氧化为醛基，醛基可与抗体蛋白的游离氨基结合形成HRP-CH2-NH-IgG复合物再用硼氢
7、化钠还原（终止反应）优点是产率高戊二醛交联标记法以双功能交联剂戊二醛(活性醛基)为桥 一步法：简便易行，交联时反应物分子间比例不易控制二步法：酶和抗体分步与戊二醛交联，先用过量的戊二醛与酶作用，使戊二醛上的活性醛基先与酶蛋白上的一个氨基结合，再加入抗体反应。酶标记物质量较均一，标记效率较高 酶联免疫吸附试验 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)( (一一) )基本原理：基本原理：v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）其免疫活性（固相抗原抗体的形成） v在测定时，把受
8、检标本（测定其中的抗体或抗原）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，
9、产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应（显色反应）（二）（二）ELISAELISA技术类型：技术类型： ELISAELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有在这种测定方法中有3 3种必要的试剂：种必要的试剂：v 固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体即即免疫吸附剂免疫吸附剂（immunosorbent）v 酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体称为称为“结合物结合物”（conjugate）v 酶作用的底物。酶作用的底物
10、。 酶 联 试 剂 阳 性 对 照 酶 标 记 物 显 色 液 A 终 止 液 反 应 板 显 色 液 B 浓 缩 洗 涤 液 加 样 枪 与 吸 头 阴 性 对 照 1 1双抗体夹心双抗体夹心法法固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法特点：双抗体夹心法特点：非竞争结合反应非竞争结合反应常用于抗原的检测常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗
11、原，而不能用于小分子半抗原的检测抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇抗原决定簇2 2间接间接法法酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体（抗再加入酶标记抗抗体（抗IgG），），则结合为抗原则结合为抗原-抗体抗体-酶标记抗抗体复酶标记抗抗体复合物。合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。间接法测抗体间接法测抗体 间接法的优点是只要变换包被抗原就间接
12、法的优点是只要变换包被抗原就可利用可利用同一酶标抗抗体同一酶标抗抗体(酶标抗人酶标抗人IgG)建立检测相应抗体的方法。易受血清建立检测相应抗体的方法。易受血清中高浓度非特异性中高浓度非特异性IgG的干扰，待测的干扰，待测标本需稀释后测定。标本需稀释后测定。 1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合为抗原如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。抗体复合物。 3.再加入酶标记抗原，则结合为抗原再加入酶标记抗原，则结合为抗原-抗体抗体-酶标记抗原复合物。酶标记抗原复合物。4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。酶抗原酶标记 抗原抗体抗原固相载体3.双抗原夹
13、心法测抗体双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。感度相对高于间接法。4.4.竞争竞争法法竞争法特点：竞争法特点：v 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。v 酶标酶标AgAg（AbAb）与样品或标准品中的非标记）与样品或标准品中的非标记AgAg（AbAb）具有相同）具有相同的与固相的与固相Ab(AgAb(Ag) )结合的能力。结合的能力。v 反应体系中，固相反应体系中，固
14、相AbAb（AgAg）和酶标）和酶标AgAg（AbAb）是固定限量的，）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记且前者的结合位点少于酶标记与非标记AgAg（AbAb）的分子数量）的分子数量和。和。v 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标AgAg（AbAb）的量（酶活性）与样品中非标记的量（酶活性）与样品中非标记AgAg（AbAb）的浓度成反比。）的浓度成反比。小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争法模式因此不能用双抗体夹心法进行测定
15、，可采用竞争法模式5.5.捕获法（反向间接法）捕获法（反向间接法）l主要用于血清中某种抗体亚型成分（如主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgMIgM）的测定。）的测定。（三）（三）ELISAELISA的试剂准备的试剂准备ELISAELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。物。（1 1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2 2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和
16、阳性对照品，参考标准品；（5 5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）酶反应终止液）酶反应终止液ELISAELISA的试剂准备的试剂准备A A 固相载体固相载体 结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。固化方法简便易行、快捷经济。 聚苯乙烯、聚氯乙烯聚苯乙烯、聚氯乙烯 良好的良好的ELISAELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，吸附性能好，空白值低，孔底透明度高孔底透明度高，各板
17、之间、同一板各孔之间、同一，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间板各孔之间性能相近。性能相近。包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)(coating)。 蛋白质蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质量、等电点、浓度等的影响
18、。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的通常含有更多的疏水基团疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。，故更易吸附到固相载体表面。当抗原表位存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的当抗原表位存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原表位不能充分暴露，在这种情况下，直接直接吸附可使抗原表位不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，包被效果不佳，可用间接可用间接捕获包被法，即先将针对该抗原的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。含杂质较多的抗原也可
19、采用捕获包被法。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。间接包被优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重间接包被优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三
20、大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。 包被用抗体包被用抗体IgGIgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在FcFc段上，抗段上，抗体结合点暴露于外。体结合
21、点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液. .须除去杂抗体后须除去杂抗体后才能用于才能用于ELISAELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。混合包被，可取得更好的效果。 包被的条件包被的条件pH9.6pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，3737中保温
22、中保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。 封闭封闭封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后续步骤中干扰物
23、质后续步骤中干扰物质的再吸附。的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用（比较价廉，可以高浓度使用（5%5%）。）。 洗涤液洗涤液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀释液为含中，常用的稀释液为含0.05%0.05%吐温吐温2020磷磷酸盐缓冲液。酸盐缓冲液。ELISA的试剂准备的试剂准备B 1.1.结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原），是即酶标记的抗体（或抗原），是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂制备结合物时所用抗
24、体一般为纯度较高的制备结合物时所用抗体一般为纯度较高的IgGIgG，以免在与，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab)2F(ab)2进行标进行标记，则更可避免标本中记，则更可避免标本中RFRF的干扰。在的干扰。在ELISAELISA中用酶标抗原中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。2.2.酶酶用于标
25、记酶的要求：用于标记酶的要求： 酶活性高酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害、酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害、价廉价廉 常用的酶：辣根过氧化物酶（常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（）、碱性磷酸酶（AP）、）、 -半乳糖苷半乳糖苷 酶酶 酶标记方法酶标记方法 1.交联法交联法 以双功能交联剂为以双功能交联剂为“桥桥”，分别与酶和抗体（抗
26、，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法（含两个醛基，原）连接形成结合物。如戊二醛交联法（含两个醛基，可分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合）。可分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合）。2.过碘酸钠过碘酸钠法法 用过碘酸钠活化酶蛋白分子（可将与酶活性无关用过碘酸钠活化酶蛋白分子（可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基）后，再与抗体（抗原）结合。的多糖羟基氧化为醛基）后，再与抗体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分子的酶（如仅适用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）标记物制备。）标记物制备。 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后中最后的酶活性测定。
27、但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。省。 结合物的保存结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为酶和抗体
28、均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRPHRP结合物加硫柳结合物加硫柳泵，泵，APAP结合物可加叠氮钠）。结合物可加叠氮钠）。 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋牛
29、血清白蛋白，白， 0.05%0.05%吐温吐温20 20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在工作液，使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个个月。月。试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物酶的底物酶的底物1.1.HRPHRP的底物的底物邻苯二胺（邻苯二胺（OPDOPD）：反应显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，）：反应显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，应避光，致癌性，应用液稳定性差。应避光，致癌性，应用液稳定性差。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2为供氧体，为供氧体， H2O2为受氢体。为受
30、氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。E四甲基联苯胺（四甲基联苯胺（TMBTMB）：反应后呈蓝色，加酸后变黄）：反应后呈蓝色，加酸后变黄色，成色稳定性好，无需避光，无致癌性，但水溶性色，成色稳定性好，无需避光，无致癌性，但水溶性差差l2 2） 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）l 常用底物为对硝基苯磷酸酯（常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPPp-NPP），产），产物为黄色。物为黄色。l 3 3）- -半乳糖苷半乳
31、糖苷 酶酶 l 常用底物常用底物4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半乳糖苷半乳糖苷（4MUG4MUG），酶作用后，生成高强度荧光物），酶作用后，生成高强度荧光物4-4-甲甲基伞形酮，敏感性较基伞形酮，敏感性较HRPHRP高高30-5030-50倍，但测量时倍，但测量时需用荧光计。需用荧光计。 酶反应终止液酶反应终止液常用的常用的HRPHRP反应终止液为反应终止液为2mol/L硫酸硫酸 4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative control)(negative contro
32、l)是检验试验有效性的控制品，同时是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。本物质的量。参考标准品参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考
33、标准品，应包括覆盖可检测范围的制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-54-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. . 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测的阴检测的阴性对照品中不可含性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。体或抗原成份。以血清标本为例：血
34、浆中除尚含有以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以化物酶活性的物质，以HRPHRP为标记的为标记的ELISAELISA测定中，可能测定中，可能会增加非特异性显色。会增加非特异性显色。加样加样: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在合物，加底物。加样时应将所加物加在LE
35、ISALEISA板孔的底板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。上发生。 温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度（冰箱温度）等。）等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗是实验室中常用的保温温度，也
36、是大多数抗原抗体结合的合适温度。原抗体结合的合适温度。保温方式：保温方式：ELISAELISA仪器附有特制的电热块，水浴。仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：若用保温箱：ELISAELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将，最后将ELISAELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指围内，标准室温温度是指20-2520-25，但具体操作时可根，但
37、具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。不宜多于两块板同时测定。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。着实验的成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰
38、物质。干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的
39、洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型非离子型洗涤剂洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是是疏水性疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。载体。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式
40、和浸泡式两种：手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性
41、，宜在规定的适当时间阅读结果。定的适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小时后即可完全消退小时后即可完全消退至无色。至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白过程的孔），以记录
42、本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。光度，然后进行计算。 结果以光密度（结果以光密度（oplicaloplical density density，ODOD），现按规定），现按规定用吸光度（用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于示方法是，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收的吸收波长为波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492492n
43、mnm或或ODOD492492nmnm。酶标比色仪酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到的酶标仪的读数一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复，重复性达性达0.5%0.5%。
44、 操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分分钟，测读结果更稳定。测读钟，测读结果更稳定。测读A A值时，要选用产物的敏感吸收值时，要选用产物的敏感吸收峰，如峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。波长。有的酶标仪可用双波长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书 6 6 结果判断结果判断 定性测定定性测定 定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，的回答，分别用分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这
45、种半定量测定中表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法在间接法和夹心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法孔。在竞争法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法
46、不同，分述于下。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。A.A.阳性判定值：阳性判定值： （cut-off valuecut-off value）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加上一个特定的常数值加上一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作为判断结果，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。阳性或阴性的标准。B.B.标本标本/ /阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（标本（S S）和阴性对照（）和阴性对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/
47、N值。值。间接法和夹心法间接法和夹心法 竞争法竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出，一般均用比色计测定，读出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。a. a. 阳性判定值法阳性判定值法 阴性判定值阴性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 阳性阳性 AA阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定值阳性判定值 b. b. 抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（% %）= = （阴性对照（阴性对照A A值值- -标本标本A A值）值）100%/100%/阴性对照阴性对照 阳性阳性 抑制率
48、抑制率50% 50% 阴性阴性 50%50% 定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。部分是最理想的检测区域。
