1、肿瘤生物治疗进展肿瘤生物治疗进展- -细胞治疗细胞治疗山东大学药学院 张建 一、肿瘤生物治疗概念的演变一、肿瘤生物治疗概念的演变 手术治疗、放射治疗（放疗）、化学治疗（化疗）是应用机械、物理和化学的原理来治疗肿瘤. 生物治疗生物治疗是应用生物大分子（细胞、核酸、蛋白质和肽）或调节生物反应的小分子化合物来治疗肿瘤。1894,William B.Coley,1894,William B.Coley,纽约外科医生纽约外科医生一位广泛扩散的肉瘤患者，其一位广泛扩散的肉瘤患者，其肿瘤部位发生链球菌感染肿瘤部位发生链球菌感染肿瘤完全消退肿瘤完全消退是否是由于链是否是由于链球菌感染而导球菌感染而导致肿瘤消退
2、呢？致肿瘤消退呢？January 12, 1862 April 16, 1936A storyColey Coley 采取了大胆的行动采取了大胆的行动! !注射活的链球菌注射活的链球菌治疗没有治愈希望的、不能手术的肉瘤患者治疗没有治愈希望的、不能手术的肉瘤患者肿瘤完全消退肿瘤完全消退! !灭活的链球菌和变形杆菌的混合物灭活的链球菌和变形杆菌的混合物（ColeyColey毒素）毒素）对对 1000 1000 患者治疗，约患者治疗，约40%40%的到明显的治疗效果的到明显的治疗效果Coley Coley 与他的女儿与他的女儿 Dr.Helen Coley NautsDr.Helen Coley N
3、auts 利用细菌成分活化免疫系统，可以诱导部分晚期肿瘤患者的持续缓解!ColeyColey是肿瘤生物治疗的鼻祖是肿瘤生物治疗的鼻祖 现代肿瘤生物治疗起始于1986年美国食品药品监督管理局（FDA）批准干扰素上市。 抗病毒抗肿瘤 肿瘤的发生 癌基因突变/抑癌基因缺失或基因表达调控失常，肿瘤细胞的信号通路与正常细胞的信号通路存在一定的差异。 生物治疗生物治疗借助肿瘤细胞与正常细胞之间的差异，以核酸、蛋白、细胞和小分子化合物为治疗介质，以肿瘤特异性信号通路为主要作用靶点，发展肿瘤选择性强、毒副反应低、高治疗指数的治疗技术和药物。 有足够的临床证据表明，生物治疗不仅能治疗临床可见的肿瘤，而且能延长肿
4、瘤患者的生存期，改善预后。 这种治疗水平保障了生物治疗成为继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗策略。二、生物治疗技术和药物分类二、生物治疗技术和药物分类 目前已用于临床的生物治疗技术和药物主要包括： 细胞因子 单克隆抗体 免疫效应细胞 免疫刺激剂 基因药物和免疫毒素 作用于特定分子靶点的非细胞毒性小分子药物三、免疫系统在抗肿瘤中的作用三、免疫系统在抗肿瘤中的作用结核菌葡萄球菌流感脊髓灰质炎寄生虫：绦虫疟原虫蠕虫攻击攻击防御防御免疫系统-人体的防御体系 清除细菌、病毒、外来异物； 消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞(有的突变细胞会变成癌细胞)。 对于健康的人来说，其免疫系统的强大足以及时清除突
5、变的癌细胞。机体免疫系统和癌细胞相互作用的结果决定了癌症的最终演变。清除期平衡期逃逸期 对于癌症病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭癌症细胞;另一方面，癌症细胞的大量增殖会进一步抑患者的免疫功能，而且癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤。 1.1.什么是免疫？什么是免疫？ 我们生存在一个充满复杂感染源的、敌对的世界里，我们的机体可以利用许多机制来防御外来微生物的侵袭，保护机体健康，这种防御能力被称为免疫免疫。 免疫的类型 天然免疫反应：天然免疫反应：先天就具备的对某种病原先天就具备的对某种病原体的免疫力体的免疫力, ,具有遗传性，是机体抵御病原具有遗传性，是机体抵御病原
6、体侵袭的第一道防线；体侵袭的第一道防线； 获得性免疫反应获得性免疫反应：后天获得、具有针对性：后天获得、具有针对性、具有免疫记忆性。、具有免疫记忆性。 2.2.免疫系统的组成免疫系统的组成 免疫器官：骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾等； 免疫组织：消化道、 呼吸道粘膜内存在的许多无被膜的淋巴组织； 免疫细胞：淋巴细胞、单核吞噬细胞等 免疫分子：补体、免疫球蛋白、细胞因子等 3.3.免疫系统分布免疫系统分布免疫系统功能免疫系统功能功能功能生理性生理性 ( (有利有利) )病理性病理性 ( (不利不利) )免疫防御免疫防御防御病原微生物侵害防御病原微生物侵害超敏反应超敏反应/
7、 /免疫缺陷免疫缺陷免疫自稳免疫自稳清除损伤或衰老的细胞清除损伤或衰老的细胞自身免疫病自身免疫病免疫监视免疫监视 清除复制错误清除复制错误/ /突变细胞突变细胞 细胞癌变细胞癌变/ /持续感染持续感染4. 发挥免疫应答的成员？免疫细胞免疫细胞免疫分子免疫分子 天然免疫系统： 肥大细胞、单核/巨噬细胞、中性/嗜碱性粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞； 特异性免疫细胞： T细胞、B细胞对细胞残片及病原体进行噬菌（即吞噬以及消化），并激活淋巴细胞或其它免疫细胞，令其对病原体作出反应。在抗肿瘤免疫中，巨噬细胞具有抗原递呈功能，参与调节T细胞的特异性免疫应答。作为清道夫细胞清除机体死亡细胞和细胞碎片。巨噬
8、细胞巨噬细胞（M ）在不同组织中其名称不同细胞名称细胞名称位置位置肺泡巨噬细胞肺泡组织细胞组织细胞结缔组织结缔组织库佛氏细胞肝肝神经胶质细胞神经组织上皮样细胞上皮样细胞肉芽肿肉芽肿蚀骨细胞蚀骨细胞骨骨窦内皮细胞窦内皮细胞脾脾系膜细胞系膜细胞肾粒细胞粒细胞: : 中性粒细胞-吞噬并杀灭病原微生物；嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞-抵抗寄生虫，与过敏反应有关。颗粒中含有多种酶和毒颗粒中含有多种酶和毒性蛋白，在细胞活化时性蛋白，在细胞活化时释放并杀灭病原体。释放并杀灭病原体。DCDC细胞摄取病原体后变为成熟的细胞摄取病原体后变为成熟的DCDC细胞细胞初始初始T T细胞细胞活化的活化的T T细胞细胞 DCD
9、C是天然免疫和获得性免疫应答之间的桥梁是天然免疫和获得性免疫应答之间的桥梁 树突状细胞树突状细胞 (DC)(DC)天然免疫获得性免疫DCDCDC是天然免疫和获得性免疫应答之间的桥梁是天然免疫和获得性免疫应答之间的桥梁 淋巴细胞:T B NK获得性免疫天然免疫红细胞红细胞淋巴细胞淋巴细胞: :小小, ,无特征无特征HE 染色染色 电镜观察电镜观察无功能活性无功能活性-初始淋巴细胞初始淋巴细胞 遇到抗原后,成为活化的淋巴细胞,并进一步分化为全功能的淋巴细胞,即效应淋巴细胞。 B B淋巴细胞淋巴细胞(B(B细胞细胞) T) T淋巴细胞淋巴细胞(T(T细胞细胞) ) B-B-细胞受体细胞受体(BCR)
10、(BCR)抗体抗体- -免疫球蛋白免疫球蛋白膜型免疫球蛋白膜型免疫球蛋白T-T-细胞受体细胞受体 (TCR) (TCR) 杀伤杀伤活化活化调节调节获得性免疫细胞获得性免疫细胞记忆性T细胞记忆性B细胞活化杀伤病毒或胞内病原体感染的细胞-CD8+T细胞辅助性T细胞为其它细胞的活化和功能提供必须的信号-CD4+T细胞调节性T细胞抑制其它淋巴细胞的活性并协助控制免疫应答效应性T细胞调节杀伤自然杀伤细胞自然杀伤细胞（Natural killer cellsNatural killer cells，NKNK） 形态比形态比T T 、B B 细胞大，胞质中有特殊的颗粒，细胞大，胞质中有特殊的颗粒，含有毒性蛋
11、白含有毒性蛋白, ,不需要特异性免疫刺激，即能不需要特异性免疫刺激，即能够在体外杀伤某些肿瘤细胞系。够在体外杀伤某些肿瘤细胞系。 是天然免疫的重要成员是天然免疫的重要成员, , 在获得性免疫应答在获得性免疫应答之前对控制病毒感染非常重要；之前对控制病毒感染非常重要； 在外周血单个核细胞中占在外周血单个核细胞中占10%-15%10%-15%，淋巴结和，淋巴结和组织中较少。组织中较少。不表达抗原特异性受体，也不形成免疫记忆。NK细胞是机体早期抗病毒的重要成员四、抗肿瘤免疫机制四、抗肿瘤免疫机制免疫细胞如何发挥抗肿瘤作用？ 免疫系统识别“自我”与“非我” 肿瘤细胞表达肿瘤抗原1.1.什么是肿瘤抗原？
12、什么是肿瘤抗原？ 肿瘤特异性抗原 (TSA): 仅在肿瘤细胞上表达; 肿瘤相关性抗原 (TAA): 在某些肿瘤细胞上表达，也在某些正常细胞上表达。 泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质。机体产生肿瘤抗原的可能机制为： 基因突变； 细胞癌变过程中使原本不表达的基因被激活； 抗原合成过程的某些环节发生异常（如糖基化异常导致蛋白质特殊降解产物的产生）； 胚胎时期抗原或分化抗原的异常、异位表达； 某些基因产物尤其是信号转导分子的过度表达； 外源性基因（如病毒基因）的表达。 1 1感应阶段：感应阶段： 1 1）抗原递呈细胞（）抗原递呈细胞（APCAPC）对外源性抗原的加工、对外源性抗原的
13、加工、处理、递呈处理、递呈2 2）T T细胞对抗原的识别细胞对抗原的识别2.2.反应阶段反应阶段3.3.效应阶段效应阶段2. 获得性细胞免疫应答的基本过程获得性细胞免疫应答的基本过程APC感应阶段感应阶段反应阶段反应阶段效应阶段效应阶段抗原递呈细胞CD8+T 抗原递呈功能 MHC限制性APCAPCB B细胞细胞浆细胞浆细胞（产生抗体）（产生抗体）T T细胞细胞细胞毒性细胞毒性T T 细胞（细胞（CTLCTL）辅助性辅助性T T细胞细胞 (Th)(Th)感染部位感染部位滞留在淋巴组织滞留在淋巴组织中活化中活化B B细胞细胞骨髓骨髓产生抗体释放产生抗体释放到血液中到血液中效应细胞效应细胞 CTL细
14、胞介导的免疫应答可直接杀伤肿瘤细胞; Th细胞可以活化免疫系统的其它成分，在控制具有免疫原性肿瘤细胞的生长中起重要的作用。（1 1）CTLCTL杀伤靶细胞的机制杀伤靶细胞的机制靶细胞CTL循环凋亡凋亡解离CTL胞外分泌颗粒CTL与靶细胞结合CTL细胞质重排(2)体液免疫 体液免疫为B细胞介导的免疫，B细胞受抗原刺激后活化、增殖、分化，形成浆细胞并分泌抗体，由于主要是血清或血浆中的抗体发挥免疫效应，故称为体液免疫。抗体的抗肿瘤机制?A.激活补体系统溶解肿瘤细胞 跨膜孔道 B.抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC) C.抗体的调理作用 肿瘤细胞巨噬细胞抗体与肿瘤细胞表面的相应抗原结合溶酶体被调
15、理的肿瘤细胞结合到M的FcR上，并被M吞噬形成吞噬体吞噬溶酶体形成，杀伤肿瘤细胞抗体 D.抗体的封闭作用 细胞恶变后其表面可过表达某些受体，这些受体与其相应的配体结合后可刺激肿瘤细胞生长。 针对这些受体的抗体可通过封闭肿瘤细胞表面的受体阻碍其功能，从而抑制肿瘤细胞的增殖。 E.抗体改变肿瘤细胞的粘附特性 抗体与肿瘤细胞膜表面的抗原结合后，可干扰肿瘤细胞的粘附特性，阻止其克隆形成及与血管内皮的粘附，从而有助于控制肿瘤细胞的生长和转移。 抗肿瘤抗体虽然能够通过上述几种方式发挥作用，但一般认为，体液免疫在抗肿瘤免疫中只处于从属地位。 细胞免疫在抗肿瘤免疫中发挥重要作用3.3.天然免疫应答天然免疫应答
16、 （1 1）自然杀伤细胞（）自然杀伤细胞（NKNK） NK是机体重要的免疫细胞，对于抗肿瘤、抗病毒感染非常重要。 NKNK细胞抗肿瘤机制细胞抗肿瘤机制A.A.释放毒性颗粒释放毒性颗粒: : NK细胞含有毒性酶，穿孔蛋白-穿孔素，穿透细胞膜并诱导细胞凋亡。NK靶细胞 B.B.细胞因子介导的肿瘤抑制作用细胞因子介导的肿瘤抑制作用: : 活化的NK细胞释放大量细胞因子,如IFN-,TNF-/,GM-CSF,IL-12。 干扰素(IFN-)抑制细胞增生，引起多种肿瘤细胞凋亡,抗肿瘤新生血管形成，抑制肿瘤转移，是巨噬细胞主要的活化因子。C.C.抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用
17、 (ADCC) (ADCC)（2 2）巨噬细胞（）巨噬细胞（M) 活化的活化的M M 与肿瘤细与肿瘤细胞结合后通过溶酶胞结合后通过溶酶体酶等直接杀伤肿体酶等直接杀伤肿瘤细胞；瘤细胞； 活化的活化的M M 还可分泌还可分泌TNFTNF、NONO等细胞毒性因子而间接等细胞毒性因子而间接杀伤肿瘤细胞；杀伤肿瘤细胞；抗原递呈作用杀伤肿瘤分泌细胞因子IL-1IL-6TNF- IL-8GM-CSF酶溶菌酶酸性水解酶赖氨酸酶酯酶胶原蛋白酶弹性纤维蛋白酶前列腺素补体成分纤维蛋白结合蛋白凝血因子其它因子M M 还可通过还可通过ADCCADCC杀伤肿瘤细胞杀伤肿瘤细胞巨噬细胞活化的巨噬细胞 作为递呈抗原的作为递呈
18、抗原的APCAPC，活化，活化T T细胞；细胞；抗原T细胞受体T淋巴细胞抗原递呈细胞（M）抗原肽T淋巴细胞T细胞受体MHC-抗原肽复合物五、过继性免疫效应细胞治疗五、过继性免疫效应细胞治疗 过继性免疫效应细胞治疗（过继性免疫效应细胞治疗（Adoptive cellular Adoptive cellular immunotherapyimmunotherapy，ACI）是转输体外培养、修饰的效应细胞，如淋巴细胞和其它免疫细胞，治疗疾病。 细胞治疗可以被认为是利用自体或异体细胞，替换、修复或增强受损伤组织的或系统的生物功能的一种策略。 ACIACI治疗肿瘤：治疗肿瘤： 具有抗肿瘤活性的免疫细胞转
19、输给肿瘤患者，清除术后和化疗后的残留肿瘤细胞； 预防复发和转移，根治肿瘤； 毒副作用低，特异性高； 是联合治疗肿瘤的重要部分。I.I.非特异性免疫细胞非特异性免疫细胞 NK NK 细胞细胞 巨噬细胞巨噬细胞 DCsDCs LAKsLAKs CIKsCIKs TLR TLR 激动剂刺激免疫细胞激动剂刺激免疫细胞II.II.抗原特异性抗原特异性 T T 细胞细胞 CTLCTL TIL TILACIACI的类型：的类型：I. 非特异性免疫细胞非特异性免疫细胞1. NK1. NK细胞用于过继转输细胞用于过继转输Science. 2011, 7; 331(6013): 4449.NK细胞被认为是抗肿瘤免
20、疫的关键效应细胞细胞被认为是抗肿瘤免疫的关键效应细胞 肿瘤可以发展多种机制逃逸肿瘤可以发展多种机制逃逸NKNK细胞的攻击或者诱导细胞的攻击或者诱导NKNK细胞功能缺陷细胞功能缺陷 NKNK细胞在肿瘤患者中功能低下细胞在肿瘤患者中功能低下J Biomedicine and Biotechnology,2011免疫监视功能缺陷免疫抑制System administration细胞因子细胞因子 自体自体NK细胞细胞( IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, type I IFNs，免疫调节药物，免疫调节药物 )体内活化体内活化NKNK细胞治疗肿瘤的策略细胞治疗肿瘤的策略
21、抗体抗体(anti-HER-2 MAb;anti-CD20 MAb;anti-EGFR Mab) InfusionADCCNATURE IMMUNOLOGY 2008, 9(5):486 In 1980 Table 2 Clinical trials using strategies to modulate NK cell functions (continued)Table 2 Clinical trials using strategies to modulate NK cell functions (continued)Rituximab: anti-CD20; Trastuzumab:
22、 anti-HER2; Daclizumab: anti-IL-2Ra Ex vivo自体自体 NK细胞细胞单倍体相合的单倍体相合的 NK细胞细胞细胞因子细胞因子 ( IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, type-1 IFNs， 免疫调节药免疫调节药物物 ) 通过细胞因子刺激通过细胞因子刺激, ,肿瘤患者的本身的肿瘤患者的本身的NKNK细胞难于有效回复抗肿瘤功能细胞难于有效回复抗肿瘤功能 自身免疫细胞在体外活化自身免疫细胞在体外活化NKNK细胞的临床应用细胞的临床应用 (1) (1) 原代原代NKNK细胞细胞 通过免疫磁珠的方法纯健康供体NK细胞, 这些NK细胞
23、具有正常的细胞表面标志、胞内细胞因子、穿孔素和颗粒酶B。供者患者 过继转输原代过继转输原代 NK细胞细胞 原代原代NK细胞在体外扩增和活化细胞在体外扩增和活化13-21天天, 大大提高转移的肾细胞癌患者的临床反大大提高转移的肾细胞癌患者的临床反应。应。 NKNK细胞在外周血中的比例低细胞在外周血中的比例低 (1015%) (1015%)，不，不能持续增殖；能持续增殖； 产生高纯度的、大量的自体或异基因活化产生高纯度的、大量的自体或异基因活化NKNK细胞非常难，并费时、费力；细胞非常难，并费时、费力； 每个患者或者供者的每个患者或者供者的NKNK的差异性对临床常规的差异性对临床常规治疗带来困难。
24、治疗带来困难。 障碍障碍/困难困难YT, NK-YS, HANK-1, NK-92, NKL, KHYG-1 ，NKG(2) NK(2) NK细胞系细胞系 Japan EBV-positive Western countries ChinaNK-92 cells NK-92 cell: CD56brightCD16-高效广谱抗肿瘤作用，表达高效广谱抗肿瘤作用，表达大量活化型受体；大量活化型受体；高水平表达与细胞凋亡途径高水平表达与细胞凋亡途径有关的分子及细胞毒效应分有关的分子及细胞毒效应分子；子；对恶性黑色素瘤、前列腺癌、对恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、白血病淋巴瘤等都乳腺癌、白血病淋巴瘤等
25、都具有高效的杀伤活性。具有高效的杀伤活性。 NK-92NK-92细胞容易大量扩增，适合标准化培细胞容易大量扩增，适合标准化培养，已经用于临床试验，是目前最强的、养，已经用于临床试验，是目前最强的、适于临床应用的适于临床应用的NKNK细胞系。细胞系。NK cell line InstrumentCulture mediumCytokine in mediumStarting cell number Culture Time (days)Harvested cell numberViabilityNK-921-L Vuelife culture bag EX-Vivo 10 serum-free
26、media+amino acids and 2.5% human AB plasmaIL-2 (500IU/ml)(2.5105/ml)25ml/bag15-171109/bag80%Controlled stirred bioreactor Optimized clinicl-grade mediaIL-2 (100500IU/ml)1107/ bioreactor11-161010/ bioreactor95%NKG*WAVE Bioreactor-MEM medium10% fetal bovine serum + 10% horse serumIL-2 (100IU/ml)(1105/
27、ml)200ml/bag12-141010/bag90%NKLPlates or FlasksRPMI 1640 medium 10% heat-inactivated human AB serumIL-2 (100 pM)-KHYG-1Plates or FlasksRPMI 1640 medium2% human low-toxicity AB serumIL-2 (450 IU/ml)-大规模培养临床应用大规模培养临床应用NKNK细胞系细胞系2. 2. 淋巴因子活化的杀伤细胞（淋巴因子活化的杀伤细胞（LAKLAK） 19801980年年, Rosenberg , Rosenberg 及其
28、同事建立了一种及其同事建立了一种IL-2IL-2刺刺激产生大量的淋巴细胞的新方法激产生大量的淋巴细胞的新方法, , 这些淋巴细胞这些淋巴细胞可以杀伤新鲜的、没有培养的、原代转移的肿瘤可以杀伤新鲜的、没有培养的、原代转移的肿瘤细胞。细胞。 LAK LAK 细胞是细胞毒性效应淋巴细胞，其细胞毒活细胞是细胞毒性效应淋巴细胞，其细胞毒活性不受性不受 MHC MHC限制，能够杀伤原代肿瘤细胞和限制，能够杀伤原代肿瘤细胞和NKNK抵抵抗的肿瘤细胞系抗的肿瘤细胞系, , 在功能上与在功能上与NKNK细胞不同。细胞不同。 LAKLAK细胞表现出较好的耐受性，以一定的间细胞表现出较好的耐受性，以一定的间隔时间重
29、复输注，以保持一定数量的新鲜隔时间重复输注，以保持一定数量的新鲜的的LAKLAK细胞。细胞。 19841984年年, Rosenberg , Rosenberg 及其同事被及其同事被FDAFDA批准，批准，IL-2IL-2和和 LAK LAK 用于治疗用于治疗2525例肿瘤患者，包括例肿瘤患者，包括肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌或结肠癌。肾细胞癌、黑色素瘤、肺癌或结肠癌。 LAKLAK细胞的制备：细胞的制备： 肿瘤患者的外周血肿瘤患者的外周血单个核细胞（单个核细胞（PBMCsPBMCs）在体外在体外扩增，扩增，IL-2IL-2刺激，培养约刺激，培养约5 5天。天。 培养后的培养后的LAKLAK是异质
30、性的，含有是异质性的，含有CD3-CD56+, CD3-CD56+, CD3+CD56+ CD3+CD56+ 和和 CD3+CD56-CD3+CD56-细胞；细胞； 其中其中 CD3+CD56+ T CD3+CD56+ T和和CD3CD3CD56+NK CD56+NK 细胞发挥细胞细胞发挥细胞杀伤作用。杀伤作用。 临床研究证明临床研究证明, LAK, LAK细胞对转移性肿瘤如肾细胞对转移性肿瘤如肾细胞癌和黑色素瘤有一定疗效。细胞癌和黑色素瘤有一定疗效。 LAK/IL-2 LAK/IL-2 的主要限制是其毒性：的主要限制是其毒性： 全身应用全身应用IL-2 IL-2 通常是造成副作用的主要通常是
31、造成副作用的主要原因，包括烦躁原因，包括烦躁, , 发热发热, , 寒冷寒冷, ,头痛头痛, ,恶恶心心, ,呕吐呕吐, ,皮疹皮疹, ,水肿，水肿，25%25%患者可以发生患者可以发生副反应。男性呼吸道窘迫综合征、肝脏副反应。男性呼吸道窘迫综合征、肝脏毒性和脉管炎有报道。毒性和脉管炎有报道。3. 细胞因子诱导的杀伤细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK） CIK是通过培养外周血淋巴细胞(PBL)，培养第一天在培养基中加入IFN- 1000 u/ml, 24小时后加入抗CD3抗体 50ng/ml和IL-2 300IU/ml。定期加入IL-2,培养基常规性换液，培养2128天。患者淋巴细胞体外患者
32、自体CIK CIK细胞中CD3+ CD4+ (37.4%)、CD3+ CD8+ (64.2%); CD3CD56+ NK 细胞含量小 ( 2%)，培养14天时，37.7% 为CD3+CD8+CD56+的 自然杀伤自然杀伤T T (NKT)(NKT)细胞，是细胞，是CIKCIK中最强的细胞毒性细胞。中最强的细胞毒性细胞。与与LAKLAK细胞相比，细胞相比，CIKCIK细胞的增殖能力和细胞毒活性细胞的增殖能力和细胞毒活性更强；更强；CIK细胞在识别和杀伤靶细胞时是非MHC限制性的。 CIKCIK的第一例临床试验是在的第一例临床试验是在 1999 1999年，由年，由Schmidt-WolfSchm
33、idt-Wolf等在德国进行，自体等在德国进行，自体CIKCIK细细胞转入胞转入IL-2 IL-2 基因，转述给基因，转述给1010例肿瘤患者，例肿瘤患者，包括转移性肾癌、结肠癌和淋巴瘤。其中，包括转移性肾癌、结肠癌和淋巴瘤。其中，1 1例患滤泡性淋巴瘤者完全缓解。除了例患滤泡性淋巴瘤者完全缓解。除了 3 3例患者有发热的症状外，没有严重的副反例患者有发热的症状外，没有严重的副反应。应。 一项来自中国的报道，用一项来自中国的报道，用CIKCIK辅助治疗急性白血病辅助治疗急性白血病, , 1919例接受例接受1414个疗程自体个疗程自体CIKCIK细胞输注联合化疗的细胞输注联合化疗的患者中患者中
34、,73.4%,73.4%在随后的在随后的4 4年中维持持续缓解年中维持持续缓解, ,只作只作化疗的患者仅为化疗的患者仅为27.3%27.3%。 作为免疫治疗方式作为免疫治疗方式, CIK, CIK治疗肿瘤量较小的患者有治疗肿瘤量较小的患者有效或者作为辅助治疗效或者作为辅助治疗, , 不适合用于治疗肿瘤量较不适合用于治疗肿瘤量较大的患者。大的患者。 CIK的机制: 释放炎症因子, 如IFN, TNF, 穿孔素, 颗粒酶B杀伤肿瘤细胞; 通过 Fas-Fas L 途径诱导肿瘤细胞凋亡。 CIK 已经成功用于临床治疗胃癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病等。 II.抗原特异性抗原特异性 T 细胞细胞 T T细
35、胞在抗肿瘤的免疫应答中细胞免细胞在抗肿瘤的免疫应答中细胞免疫起着主要作用，特别是疫起着主要作用，特别是CTLCTL，它是，它是抗肿瘤免疫的主要效应细胞，故也应抗肿瘤免疫的主要效应细胞，故也应是用于过继免疫治疗的最佳细胞。是用于过继免疫治疗的最佳细胞。 T细胞活化抗原递呈细胞肿瘤细胞肿瘤抗原肿瘤抗原表达识别与杀伤肿瘤细胞抗原的识别与递呈淋巴结淋巴结CD8+T 细胞CD8+T 细胞血液循环血液循环肿瘤血管肿瘤血管迁移迁移 Flood发现CTL在体内聚集到肿瘤部位的能力强于LAK和NK，且能特异性地杀伤肿瘤细胞。 实验显示，肿瘤疫苗在体内应用可增加体内的肿瘤特异性CTL的数量，但到一定水平时候，体内
36、的CTL到达平稳期而不再增加，这主要是由于体内存在的特异性及非特异性免疫调节网络限制了CTL的扩增。 所以，利用细胞因子或免疫刺激剂直接活化肿瘤患者体内CTL受到限制。 在体外培养可突破此调节网络，大量扩增免疫效应细胞。转输抗原特异性转输抗原特异性T T细胞细胞 因为肿瘤相关抗原TAA是“自身”抗原，免疫系统难于识别； 肿瘤患者体内难于产生对肿瘤应答的T细胞, 甚至在体外最佳条件下也难于大规模培养。 4. 肿瘤浸润的淋巴细胞肿瘤浸润的淋巴细胞 (TIL) 19861986年年, Rosenberg , Rosenberg 及其同事应用及其同事应用TILTIL在小在小鼠模型中证明鼠模型中证明,
37、, 联合自体联合自体TILTIL和环磷酰胺可和环磷酰胺可以缓解肿瘤转移。以缓解肿瘤转移。 之后很快在之后很快在 1988 1988年首次报道了利用年首次报道了利用TIL TIL 治治疗转移性黑色素瘤能够诱导肿瘤缓解。疗转移性黑色素瘤能够诱导肿瘤缓解。如何制备如何制备TIL?TIL?大约需要大约需要 56 56 周周TILTIL增殖增殖: :粘附粘附的肿瘤细胞死的肿瘤细胞死亡或被淋巴细亡或被淋巴细胞杀死而消失胞杀死而消失生长生长24 24 周周鉴定鉴定TIL TIL 杀伤杀伤肿瘤的活性肿瘤的活性直径大于直径大于2cm2cm的的活检肿瘤组织，活检肿瘤组织，剪碎，培养基中剪碎，培养基中快速扩增快速扩
38、增: : 抗抗CD3 CD3 抗体抗体, , IL-2 IL-2 和灭活的同种异体和灭活的同种异体PBMCsPBMCs饲养细胞，饲养细胞，2 2周周转输患者挑选应答最强的挑选应答最强的细胞克隆细胞克隆维持 TIL的存活，诱导肿瘤消失清除淋巴细胞，减少与 TIL竞争细胞因子,如IL-7和IL-15; 清除内源性Treg. 六、六、TLRTLR配体激活的免疫效应细配体激活的免疫效应细 什么是什么是TLRTLR？ Toll-like receptor，Toll样受体。 是一类模式识别受体，能够识别微生物的特异性成分和某些宿主分子，构成防御很多病原体的第一道防线，在天然免疫系统中起着决定性的作用。此外
39、，TLR连接天然免疫与获得性免疫。已经鉴定的人TLRs有11种细胞膜内体内体 TLR1广泛表达于单核细胞、T和B淋巴细胞、DC细胞、多形核白细胞、NK细胞； TLR2/4/5主要分布于除T、B、NK细胞以外的免疫细胞； TLR3主要表达于未成熟的DC等； TLR7-TLR9主要表达于单核细胞、DC细胞核巨噬细胞。TLRs与肿瘤免疫治疗 肿瘤免疫逃逸的策略肿瘤免疫逃逸的策略12345免疫抑制分子招募Treg共刺激分子缺失促凋亡分子 通过活化TLRs激活免疫系统，打破肿瘤介导的免疫抑制状态，发挥抗肿瘤作用。 作为肿瘤生物治疗的关键问题是打破肿瘤导致的免疫耐受状态！TLRTLR配体已经通过多种途径应
40、用配体已经通过多种途径应用外用乳膏外用乳膏 静脉注射静脉注射 口服口服 瘤内注射瘤内注射 皮下注射皮下注射 TLR3,4,7/8和TLR9激动剂被列入美国国立癌症研究所（NCI）免疫治疗肿瘤药物，具有强大的抗肿瘤潜力。1.TLR-7激动剂(1)天然ssRNA及其衍生物: 通过内吞进入细胞，然后与TLR-7相互作用。 TLR7ssRNA：单链RNADCDC产生产生IL-12IL-12和和I I型型IFNIFN活化活化NKNK细胞，产生细胞，产生IFN-IFN- 并增强并增强细胞毒作用细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长TLR-7 TLR-7 激动剂激动剂ssRNAssR
41、NA机制机制: :(2)合成的TLR7激动剂Imiquimod (咪喹莫特):HPV-相关的皮肤恶性肿瘤 (浅表性基底细胞癌浅表性基底细胞癌 sBCC), III期临床研究表明组织学清除率为7982%；癌变前的光线性角化病治疗。外用乳膏外用乳膏 机制机制: : 诱导细胞因子如 IFN-和 IL-12产生; 增强肿瘤特异性CTLs的活化； 活化具有杀伤活性的mDC亚群的活化。 有20项临床试验在进行, Imiquimod有做疫苗佐剂的临床试验有10项。 PolyI:C PolyI:C( (多聚肌苷酸多聚肌苷酸- -胞苷酸胞苷酸), ), 合成的病毒合成的病毒dsRNAdsRNA类似物类似物 诱导
42、诱导 I I型型 IFNsIFNs的产生的产生 分子式分子式: : (C10H13N4O8P)x.(C9H14N3O8P)x(C10H13N4O8P)x.(C9H14N3O8P)x2.TLR32.TLR3激动剂激动剂dsRNAdsRNA：双链：双链RNARNA 成熟DC, 其活化抗原特异性T细胞的能力增强, CD4+ T细胞向Th1方向分化，分泌大量IFN。Ovarian cancer patients 在人类, TLR9 主要表达于B细胞和pDCs CpG ODNs（人工合成的非甲基化双链寡核苷酸），分为三种类型: CpG-A,NK细胞强刺激剂，诱导pDCs产生; CpG-B,中度IFN-诱
43、导剂,增强抗原特异性免疫应答; CpG-C,兼具CpG-A和CpG-B的免疫刺激能力。只有只有 CpG-BCpG-B 型进入临床型进入临床3.TLR93.TLR9激动剂激动剂 已经对以下人类肿瘤进行评价已经对以下人类肿瘤进行评价: : 肾细胞癌、恶性胶质瘤、黑色素瘤、皮肤性 T淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。 机制机制: : pDC 和 mDC 活化,Th1类细胞因子谱,减少引流淋巴结中的Treg,增强肿瘤特异性T淋巴细胞和NK细胞的免疫应答。 联合治疗联合治疗: : 单克隆抗体 化疗 放疗 细胞因子，包括 GM-CSF,IFN-a,IL-18和IL-21 CpG-ODNs与抗原、抗体或DC细胞 C
44、pG ODN作为疫苗佐剂CpG ODNs CpG ODNs 作为疫苗佐剂作为疫苗佐剂 CpG-ODN CpG-ODN可直接和间接活化可直接和间接活化NKNK、T T和和B B细胞，单核细胞、巨噬细胞和细胞，单核细胞、巨噬细胞和DCDC细胞细胞 CpG-ODNCpG-ODN 活化天然免疫和获得性免疫活化天然免疫和获得性免疫杀伤肿瘤细胞ThCTL障碍障碍 / /困惑困惑 ! !许多肿瘤细胞也表达TLRTLR 许多肿瘤细胞也表达，并利用TLRs利用多种策略促进自身的增殖与生存: 通过产生各种免疫抑制因子抑制免疫应答，促进细胞增殖和肿瘤血管形成, 诱导产生细胞保护和抗凋亡因子。TLRTLR激动剂直接用
45、作抗肿瘤药物是一把激动剂直接用作抗肿瘤药物是一把 “ “双刃剑双刃剑” ” TLR配体激活的免疫效应细胞抽取外周血分离目的细胞：NK、T筛选分离不同细胞进行培养对培养的细胞进行监测分析对所需细胞进行扩增培养可以和化疗药物联合应用将培养好的细胞回输给患者+TLR激动剂 随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，免疫细胞治疗已成为肿瘤患者放、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。过继性免疫治疗主要优点： 1. 免疫细胞在体外处理，可绕过肿瘤患者体内免疫障碍的种种机制。 如新鲜分离的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)往往缺乏抗肿瘤效应，而在体
46、外一定条件下培养一段时间后可恢复特异性抗肿瘤作用。 2. 免疫细胞的活化及效应过程往往由一些细胞因子介导，而目前利用生物技术可大规模生产多种细胞因子、肿瘤抗原或多肽，这使体外大量扩增抗肿瘤免疫细胞成为可能。 3. 免疫细胞的体外活化扩增可避免一些生物制剂在体内大量应用而带来的严重毒副作用. 如IL-2、TNF-、IL-4、IL-7、IL-12等具有抗肿瘤作用，抗CD3mAb的体内应用可激活T淋巴细胞，但这些制剂的作用极其复杂，在体内大量应用可产生严重的副作用，甚至会导致死亡，而在体外操作可避免这些副作用。 过继性免疫治疗的优点决定了它在肿瘤生物治疗中的地位，已有的临床研究也大都提示其具有良好的前景。 通过基因修饰NK、CTL细胞提高过继免疫治疗的特异性和治疗效果。 祝大家工作愉快！祝大家工作愉快！
