1、亲和免疫组化技术亲和免疫组化技术(Affinity cytochemistryhistochemistry technique)亲和的概念亲和的概念 物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、生物素与抗生物素生物素与抗生物素（又称亲和素）、（又称亲和素）、葡萄球菌葡萄球菌A蛋白蛋白与与IgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素与受体之间的结合反应等。与受体之间的结合反应等。第一节第一节 生物素亲和素免疫细胞化学技术生物素亲和素免疫细胞化学技术一、基本原理一、基本原理 （一）生物素（一）生物素（Biotin）与
2、亲和素）与亲和素/卵白素卵白素/抗生物素抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力）之间有很强的亲和力 ； （二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力氧化物酶等相结合的能力 。二、几种经典的抗生物素生物素染色法二、几种经典的抗生物素生物素染色法 （一）（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术）技术 （二）（二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术）技术 （三）（三） LSAB（labeled streptavidin b
3、iotin method ）： S-P（ streptavidin peroxidase）技术）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术技术 （四）（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术）技术 （五）（五）CSA（Catalyzed signal amplification）法）法 （六）（六） Envision技术技术（一）亲和素（一）亲和素-生物素生物素-过氧化物酶过氧化物酶（Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术）技术 1基本原理基本原理2、操作步骤、操作步骤（1）石蜡切片常规脱蜡
4、至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗；洗；（2）用）用3% H2O2甲醇液室温作用甲醇液室温作用20min后，充分水洗后，充分水洗 ；（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ；（4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）加第一抗体（即用型或浓缩型）4过夜或过夜或37 1h ；（5）PBS洗，加生物素化第二抗体洗，加生物素化第二抗体37 30min ；（6）PBS洗，加洗，加ABC复合物（复合物（1 100,使用前使用前30min将等量的亲和素将等量的亲和素 和酶标生物素和酶标生物素 混合，
5、稀释配制成混合，稀释配制成 ABC复合物复合物 ), 37 20min ；（7）PBS洗，经洗，经DAB/H2O2显色显色 ；（8）常规脱水，透明，中性树胶封固。）常规脱水，透明，中性树胶封固。 3、ABC法的优点法的优点（1）敏感性高）敏感性高 :结合力强结合力强,分子量小分子量小;（2）特异性强，背景染色淡）特异性强，背景染色淡 ；（3）方法简便，节约时间）方法简便，节约时间 ；（4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色双重或多重免疫染色 。（二）标记生物素（二）标记生物素-抗生物素技术抗生物素技术
6、 （Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）技术） 1、基本原理、基本原理 以生物素标以生物素标记抗体作第一抗记抗体作第一抗体，酶标记抗生体，酶标记抗生物素作为第二抗物素作为第二抗体，同体，同S-P技术技术 LAB法示意图法示意图2、操作步骤、操作步骤（1）- 步骤与步骤与ABC法相同法相同 ；（5）PBS洗后加生物素标记第一抗体洗后加生物素标记第一抗体37 30min ；（6）PBS洗后加酶标亲和素洗后加酶标亲和素 （如（如HRP-Avidin） 37 30min：（7）以下步骤同）以下步骤同ABC法。法。 （三）（三） LSAB（labeled st
7、reptavidin biotin ）技术）技术： S-P （ streptavidin peroxidase）技术）技术 SABC （streptavidin-biotin complex）技术）技术 1、基本原理、基本原理2、操作步骤、操作步骤（1）常规切片脱蜡至水）常规切片脱蜡至水 ；（2）必要时抗原修复：如高温高压修复；）必要时抗原修复：如高温高压修复；（3）3% H22甲醇液阻断内源性过氧化物酶甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ；（4）水洗，）水洗，PBS洗，洗， 10%牛血清白蛋白牛血清白蛋白20min ；（5）加一抗）加一抗 4过夜或过夜或37孵育孵育1h ；（6）PBS洗，
8、滴加生物素化的二抗洗，滴加生物素化的二抗37 30min ；（7） PBS洗，滴加洗，滴加HRP标记链霉亲和素（标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素生物素复合物）或链霉亲和素生物素 （SABC），），37 孵育孵育20min ；（8）DAB/H22显色，显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。常规脱水、透明、中性树胶封固。 （四）（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术）技术1、原理、原理 以生物素标记抗以生物素标记抗体作第一抗体，抗生体作第一抗体，抗生物素作为第二抗体，物素作为第二抗体，桥接酶标生物素。桥接酶标生物素。 2、操作步骤、操作步骤（1）- 步骤与步骤
9、与ABC法操作相同；法操作相同；（2） 加一抗加一抗4过夜或过夜或37 1h；（3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体洗后加生物素标记的第二抗体 37 30min；（4） PBS洗后加亲和素洗后加亲和素 37 孵育孵育30min；（5） PBS洗后加洗后加HRP酶标记生物素酶标记生物素37 30min；（6） PBS洗后用洗后用DAB/H22显色；显色；（7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。常规脱水、透明、中性树胶封固。（五）（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法）法 1、原理、原理 根据两次生物素根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，
10、聚合示踪物质（反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物催化底物生物素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ，敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。第一步第二步第三步第四步第五步第一步第二步第三步第四步第五步2、操作步骤、操作步骤（1） 常规脱蜡至水，常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理；必要时用抗原修复处理；（2） 3% H22甲醇液甲醇液15min；（3） 正常封闭血清，室温正常封闭血清，室温20min，甩干；，甩干；（
11、4） 滴加特异性一抗滴加特异性一抗4过夜或过夜或37 孵育孵育1h；（5） PBS洗后，滴加生物素化二抗洗后，滴加生物素化二抗37 30min；（6） PBS洗（一定要充分），滴加洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37孵育孵育 20min；（7） PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37孵育孵育 20min；（8） PBS洗（一定要充分），滴加洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37孵育孵育 20min；（9） PBS洗后，洗后，DAB/H22显色；显色；（10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。）苏木素衬染
12、细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。 （六）（六） Envision技术技术、原理、原理 用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体结合成多聚体 ， 具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。敏感，简便。2、操作步骤、操作步骤（1）组织切片常规脱蜡至水，）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗；洗；（2）用）用3% H22甲醇液阻断甲醇液阻断15min，水洗，水洗，PBS洗；洗；（3）抗原修复处理，）抗原修复处理，PBS洗；洗；（4）正常山羊血清封闭）正常山羊血清
13、封闭 15min；（5）滴加第一抗体，）滴加第一抗体，37 孵育孵育1h；（6）PBS洗（一定要充分），滴加洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物聚合物-抗体复合物抗体复合物 37，60min；（7）PBS洗（一定要充分），洗（一定要充分），DAB显色；显色；（8）苏木素衬染，脱水、透明、封固。）苏木素衬染，脱水、透明、封固。 附免疫多染技术附免疫多染技术原理原理用不同来源的抗体和不同的染色同时检测同一标本中用不同来源的抗体和不同的染色同时检测同一标本中的多种抗原标记物。的多种抗原标记物。第二节第二节 葡萄球菌葡萄球菌A蛋白蛋白 （SPA） 的应用的应用葡萄球菌葡萄球菌A蛋白（蛋白（staphy
14、lococal protein A，SPA）一、特性：一、特性： 1、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定、多肽单链蛋白，对热和变性剂十分稳定 ； 2、 能与某些哺乳动物能与某些哺乳动物IgG的的Fc段特异性结合；段特异性结合； 3、可以被各种标记物所结合，形成、可以被各种标记物所结合，形成SPA标记物标记物 。二、应用二、应用 SPA主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物主要在免疫组织化学中替代连接抗体（桥抗体），可不受动物种属限制。种属限制。 三、常见问题及处理三、常见问题及处理 主要是主要是无信号无信号、信号弱信号弱、杂信号杂信号等三种。当免疫组化等三种。当免疫组化染色没有
15、出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。一定设对照，主要是阴性次只能排除一种可能的原因。一定设对照，主要是阴性对照和阳性对照。对照和阳性对照。 （一）（一）无信号无信号染色结果阳性对照染色结果阳性对照/标本均无染色，出现无信号染色现象有两种原因：标本均无染色，出现无信号染色现象有两种原因： 1、真阴性结果真阴性结果：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号；或表达抗原太低，：组织或细胞不表达抗原，无法检测到相关信号；或表达抗原太低，所使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。所使用检测系统不足以达到检测所需要的灵敏度。
16、2、假阴性结果假阴性结果：原因有两种：原因有两种：（1） 染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用染色前错误：切片时选错蜡块和选错切片，这种情况可用H&E染色验证。染色验证。（2） 染色中错误：染色中错误： 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等；确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等； 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间；确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间； 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗
17、匹配，这一点是非常重要的；配，这一点是非常重要的； 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，要求在48条件下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低条件下保存，应避免反复冻融，一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价；抗体的效价； 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适；检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液是否合适； 确定标本的处理及储存条件；确定标本的处理及储存条件； 检查色原检查色原/底物溶液，底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效；底物溶液，底物在制成工作液后
18、应在一定时间内用完，否则会失效； 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠；配的溶液中不应含有叠氮钠； 检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：检查复染剂、脱水、透明和封片剂是否和所使用的色原匹配如：HRP用中性用中性树胶，荧光素用水溶性封片剂，树胶，荧光素用水溶性封片剂，AEC等不能用二甲苯有机溶剂透明。等不能用二甲苯有机溶剂透明。 （二）（二）信号弱信号弱如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了上述因素外，还有：如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，
19、除了上述因素外，还有： 1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高；标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高；2. 抗原修复方式不当抗原修复方式不当 ；3. 抗原位于细胞内，未使用穿孔剂抗原位于细胞内，未使用穿孔剂 如如0.05%TritonX-100或或EDTA，有助于抗，有助于抗体渗透入细胞内，也可降解内源性体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc受体；受体；4. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确时间是否正确 ；5. 切片上遗留了过多的冲洗液，；切片上遗留了过多的冲洗液，；6. 孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。孵育时切
20、片是否放置水平，否则会导致抗体流失。 三、杂信号三、杂信号 由于切片、内源性由于切片、内源性IgG、Fc受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物受体、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素的存在等原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生素的存在等原因，同时组织在处理过程中如高温修复也会使更多的内源性生物素暴露，造成染色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等物素暴露，造成染色组织上会出现非抗原部位的非特异性染色、边缘效应等杂信号。原因分析如下：杂信号。原因分析如下： （一）（一）全片着色全片着色 1.是否有效地去除了内源性酶和生物素是否有效地去除了内源性酶和生物素 ；2.封闭
21、液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清封闭液的使用：是否选择使用了正确的封闭血清 ；3.所选择的抗体是否符合试验要求所选择的抗体是否符合试验要求 ，主要是抗体纯度；，主要是抗体纯度；4.一抗的使用浓度是否过高一抗的使用浓度是否过高 ；5.清洗是否充分清洗是否充分 ，DBA的使用是否正确的使用是否正确 ，边缘效应；，边缘效应；6.检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 ；7.组织抗原弥散等。组织抗原弥散等。（二）（二）部分着色部分着色 1. 灶片装着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气泡，组织局部鼓起。灶片装着色：切片捞片时应一步到位，避免产生气
22、泡，组织局部鼓起。2. 阴阳着色：测试片未放平，滴加试剂偏向一侧。阴阳着色：测试片未放平，滴加试剂偏向一侧。 （三）（三）着色部位改变着色部位改变 1. 间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非间质着色：原因很多：抗体与组织中的蛋白质因疏水基团相互作用形成非特异性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙；特异性的连接造成，血清封闭可避免此中影响因素；靶抗原外溢到组织间隙；抗体不纯或被污染；抗体不纯或被污染；2. 细胞浆着色细胞浆着色 ：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白；：内源性物质残留如酶、生物素或产生非特异性吸附的蛋白；3. 细胞
23、核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、细胞核着色：不适当的组织处理可以出现细胞核着色，如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡时间过长、组织变干、修复液缓冲液中浸泡时间过长、组织变干、修复液pH值和修复时间不当、组织没有值和修复时间不当、组织没有浸没在修复液中等。浸没在修复液中等。 四、石蜡切片免疫组化染色步骤四、石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理：、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用防脱片试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮
24、稀释的APES中，停留2030秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留12分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。2、常用酶消化：、常用酶消化：2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度
25、为0.05%0.1%，消化时间为37、1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37、30180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为210mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复：、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。
26、其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整，常用方法如下： 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：石蜡切片微波炉抗原修复操作方法： 切片脱蜡至水后，3H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在9298之间并持续1015分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却1020分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.2 石蜡切片高压抗原修复
27、操作方法：石蜡切片高压抗原修复操作方法： 切片脱蜡至水。将1500ml3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热56分钟后），计时12分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法： 切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达9298起
28、开始计时1520分钟，然后端离电炉，室温冷却2030分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。五、冰冻切片免疫组化染色步骤五、冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片48m，室温放置30分钟后，入4丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟2。下接免疫组化染色操作步骤。六、细胞贴片免疫组化染色步骤六、细胞贴片免疫组化染色步骤 PBS洗去贴片残余物，入1:1的4丙酮:无水乙醇混合固定液固定10分钟，PBS洗，5分钟3。用3过氧化氢孵育510分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟2。下接免疫组化染色操作步骤。 抗体制
29、备抗体制备第一代第一代 多克隆抗体多克隆抗体第二代第二代 单克隆抗体单克隆抗体-杂交瘤技术杂交瘤技术第三代第三代 基因工程抗体基因工程抗体一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备1、抗源、抗源 免疫动物免疫动物 免疫血清免疫血清 纯化纯化 多克隆抗体多克隆抗体2、鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景、鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景 用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域术中新兴的研究领域 。取材方便、提取方法比较简。取材方便、提取方法比较简单、产量高等优点。单、产量高等优点。 二、单克隆抗二、单克隆抗体制备杂交体制备杂交瘤技
30、术瘤技术三、基因工程抗体三、基因工程抗体 人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫等问题。应用难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫等问题。应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因，尽量减少基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因，尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性，抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体从而创造出新型抗体-基因工程抗体。基因工程抗体。 嵌合抗体和改形抗体嵌合抗体和改形抗体（Chimeric antibodies and reshaped antib
31、ody，RAb ） 从杂交瘤细胞中分离出功能从杂交瘤细胞中分离出功能性可变区基因，与人性可变区基因，与人Ig恒定区的恒定区的基因连接，插入适当质粒，构建基因连接，插入适当质粒，构建鼠鼠-人嵌合的重链和轻链基因质粒人嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞（如骨载体，共同转染宿主细胞（如骨髓瘤细胞），表达鼠髓瘤细胞），表达鼠-人嵌合抗体。人嵌合抗体。它的特点是大大减少鼠源性单克它的特点是大大减少鼠源性单克隆抗体的免疫原性，同时又保留隆抗体的免疫原性，同时又保留了亲本抗体的特异性和亲和力。了亲本抗体的特异性和亲和力。此外，通过连接上不同的人恒定此外，通过连接上不同的人恒定区基因而改变抗体的效应功能。区基因而改变抗体的效应功能。
