1、常用中药的生物鉴定常用中药的生物鉴定 之聚合酶链式反应常用中药的生物鉴定方法常用中药的生物鉴定方法 免疫鉴定法免疫鉴定法 电泳鉴定法电泳鉴定法 生物效价鉴定法生物效价鉴定法 单纯指标鉴定法单纯指标鉴定法 细胞生物学鉴定法细胞生物学鉴定法 DNA遗传标记鉴定法遗传标记鉴定法 mRNA差异显示鉴定法差异显示鉴定法 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。少量DNA 样品快速扩增amplify技术。(invented by Kary Mullis,won a Nobel Pri
2、ze in Chemistry in 1993)原原 理理 PCR 要要 件件模板模板Template 引物引物 Primers:Small pieces of DNA.Made up of 15 to 30 bases.Binds the DNA at a specific region.forward and reverse 正向和逆向正向和逆向酶酶Enzyme:Taq DNA polymerase PCR核酸核酸Nucleotides:Substrate,four deoxyribonucleotides(A,C,G,T)dNTPMDist H2O117 ul10X buffer 15
3、uldNTP12 ulPrimer 13 ulPrimer 23 ulTaq polymerase 0.75 ul200ul tubePipette 上下混合上下混合取出15 ul 剩下的加入剩下的加入3 ul Template DNA用用pipette 上下混合上下混合分装入tube 15ul/支标上1.51234554C 56 58 60 62Run PCRTcTc55 C 不加模板的对照组不加模板的对照组M 加入加入 1 ul 模板模板DNA不加引物但有模板的对照Pc15 ulMTC3 ul template(T)Pipette mixTC15ul/tubepcPC123451 ulte
4、mplateTTCPC1234554 55 56 57 58 60 62oC RNUProgramDenature 95 C 5 minDenaturation变性：变性：双链双链DNA模板在热作用下，模板在热作用下，氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至，一般加热至9095,30 secAnnealing褪火：褪火：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNA模模板结合，形成局部双链，板结合，形成局部双链，5570，固称其为褪，固称其为褪火。火。most important factor in the PCR,45secExtension延伸：延伸：在在Taq酶的作用下，以
5、酶的作用下，以dNTP为为原料，从引物的原料，从引物的5端端3端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补的的DNA链链,温度为温度为7075C,1.5 minFinal extension 72 C,5 min2x106优点优点:need very small amount of sample缺点缺点:amplified product may be contaminated with other samples not related to the one Factors affect to PCRvMg+2 concentration,Mg+2 specificity 0.15mmol/
6、L Mg+2 预实验预实验vPrimer(引物引物)specificityDegenerate primer-to find the target gene in the closely related speciesspecificity ,nonspecific products vAnnealing TemperatureToo high no PCR productToo low much nonspecific product gradient Temp PCR machine find the suitable Temp vTaq polymerase quality vTempl
7、ate(模板模板)DNA quality PCR产物鉴定产物鉴定Agarose gel electrophoresis to check product1.5%Agarose in TAE buffer(17 ml)boilPour into the tray(assembled gel apparatus)After PCR amplificationAgarose gel electrophoresis to check product1.5%agarose in 17 ml TAE(4mm thick)5 ul product add 1 ul 6X loading dye mix1Kb
8、 marker 2.5 ul100 V run 25-30 minEB stain 10 min(EB致癌物致癌物,戴手套戴手套),photograph1.51.00.50.2Kb 10 gamma primer Mismatch 3 base10 gamma primer complete matchPCR的应用的应用 1.detection genetically modification organism (GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片检测转基因生物，找出特异的基因或片段段find specific gene or fragment(promoter)2.unculture
9、d microorganism 3.pathogen identification 4.detection insertion sequence(cloning)提取模板反应体系配置PCR扩增电 泳引物设计 乌梢蛇为中国药典(2019版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、半身不遂、抽搐痉挛、瘰疠恶疮。商品流通中多以红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等来混作正品药材进行销售，这些品种多数与乌梢蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，
10、要进行干燥熏黑处理，皮上的花纹特征、颜色几近消失，难以辨认，而且其大小、形态特征与乌梢蛇相近，这是造成其性状鉴别困难的另一重要原因。鉴于乌梢蛇作为中药的临床功效确切，但商品来源复杂、药材性状鉴别困难的现状，为满足目前市场常见混伪品的鉴别要求，寻找经济实用、准确便捷、稳定性高的方法，应用高特异性PCR方法对乌梢蛇药材及其混淆品的原动物和炮制品进行鉴别。高特异性高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品方法鉴别乌梢蛇及其混淆品功效：功效：祛风、通络、止痉。祛风、通络、止痉。市售混淆品：市售混淆品：红点锦蛇、黑眉锦蛇、红点锦蛇、黑眉锦蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等玉斑锦蛇、王锦蛇、灰鼠蛇等乌梢蛇高特异性
11、乌梢蛇高特异性PCR鉴别引物的设计鉴别引物的设计 从从GenBank下载正品原动物乌梢蛇及混下载正品原动物乌梢蛇及混伪品线粒体伪品线粒体12S rRNA基因序列基因序列 经经DNAMAN软件对位排列分析正、混品软件对位排列分析正、混品间间DNA序列差异，设计出一对能特异性序列差异，设计出一对能特异性扩增乌梢蛇扩增乌梢蛇12S rRNA基因片段的特异基因片段的特异性鉴别引物性鉴别引物HWL-1和和HWH-1 （上海生工生物合成公司）（上海生工生物合成公司）模板模板DNA的提取的提取 基本要求是除去杂质，并部分纯化基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过标本中的核酸。多数样品需
12、要经过SDS和蛋白酶和蛋白酶K处理。所得到的粗制处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作乙醇沉淀后用作PCR反应模板。反应模板。特异性特异性PCR鉴别鉴别 反应体系：反应体系：Tris-HCl 10mmol/L 氯化钾氯化钾 50mmol/L Mg2+1.5mmol/L dNTP 0.15mol/L Taq 1U(40ml)引物引物 0.15mol/L 模板模板DNA 50ng 25cys琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 取取5l反应液经反应液经1.8%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 EB染色染色 紫外凝胶分析检测紫外凝胶分析检测 成像成像结结 果果 模板质量研究模板质量研究（1234为正品）为正品）高特异性高特异性PCR鉴别的研究鉴别的研究 个体差异的研究个体差异的研究 炮制品特异性的研究炮制品特异性的研究PCR在其他中药中领域的应用在其他中药中领域的应用 中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究-南京师范大学遗传资源研究所-王义权教授 中药材蛤蟆油PCR鉴定-王义权 鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究-王义权
