1、 一、一、微生物发酵微生物发酵 二、发酵工程概述二、发酵工程概述 三、应用举例三、应用举例 丙酮丁醇发酵丙酮丁醇发酵 发酵发酵(fermentation)(fermentation)没有空气的生活（没有空气的生活（life without air）-巴斯巴斯德德 细胞在厌氧条件下代谢营养物获得能量的生细胞在厌氧条件下代谢营养物获得能量的生化反应化反应 微生物生长并进行生物转化的过程微生物生长并进行生物转化的过程 获得生物量获得生物量 获得目的产物获得目的产物 保藏菌种保藏菌种 斜面（试管、茄子瓶）斜面（试管、茄子瓶）摇瓶（摇瓶（12级）级）种子发酵（种子发酵（1级或多级）级或多级）主发酵主发酵
2、 后处理后处理 接种间接种间 辐射灭菌辐射灭菌 化学灭菌化学灭菌 空气过滤空气过滤 发酵罐发酵罐 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 通气系统通气系统 过滤灭菌过滤灭菌TC 发酵温度 t hr连续灭菌间歇灭菌 现象现象：发酵不正常，产量、糖耗、：发酵不正常，产量、糖耗、pH、粘、粘度、泡沫等度、泡沫等 镜检镜检：溶菌现象：溶菌现象 防治防治：定期检查定期检查 设备、管道管件、过滤器等设备、管道管件、过滤器等 环境环境 药物药物：鳌合剂、抗生素：鳌合剂、抗生素 菌株菌株：抗性菌株、菌株轮换：抗性菌株、菌株轮换 温度温度 pH 营养营养 溶氧溶氧 通气量通气量 搅拌速度搅拌速度 压力压力 I:产物是初级能量
3、代谢的结果，一般是糖的直接氧化产物。产物是初级能量代谢的结果，一般是糖的直接氧化产物。A P or A B C P 例：乙醇发酵、乳酸发酵例：乙醇发酵、乳酸发酵 II:产物通过能量代谢的间接途径得到。产物通过能量代谢的间接途径得到。A B C D E P 例：柠檬酸发酵、氨基酸发酵例：柠檬酸发酵、氨基酸发酵 III:产物不是初级代谢形成的，与微生物细胞的物质代谢无产物不是初级代谢形成的，与微生物细胞的物质代谢无关。关。例：抗生素发酵例：抗生素发酵 批式批式(batch)发酵发酵 补料流加补料流加(fed batch)发酵发酵 连续连续(continous)发酵发酵 生长结合型生长结合型(gro
4、wth associated)：产物形成与生长的限制因：产物形成与生长的限制因子相同子相同 非生长结合型非生长结合型(growth unassociated)：产物形成速度取决于微生物浓度产物形成速度取决于微生物浓度产物形成速度由与比生长速度无关的其它因素决定，不能用动力学方程产物形成速度由与比生长速度无关的其它因素决定，不能用动力学方程描述，但可对具体的发酵过程简化一些条件后建立数学方程描述，但可对具体的发酵过程简化一些条件后建立数学方程 产乳酸发酵：产乳酸发酵：后处理在发酵工业中的地位：后处理在发酵工业中的地位：普通发酵产品，后处理成本普通发酵产品，后处理成本 60%基因工程发酵产品，后处
5、理成本基因工程发酵产品，后处理成本 80%后处理的一般流程：后处理的一般流程：发酵液发酵液 分离细胞分离细胞 浓缩浓缩 粗分离粗分离 精分离精分离 制成品制成品 后处理工艺的设计原则：后处理工艺的设计原则：产品的性质产品的性质 产品的要求产品的要求 经济经济 环保环保 稳定稳定 细胞的分离细胞的分离 过滤（压滤、抽滤、膜分离）过滤（压滤、抽滤、膜分离）沉降（重力、离心）沉降（重力、离心）絮凝絮凝 细胞的破碎细胞的破碎 物理（超声、机械）物理（超声、机械）化学化学 生物生物 微滤（微滤（0.1 -10 ）超滤（超滤（MW1000-100000）固态发酵固态发酵：微生物在没有或很少游离水的：微生物
6、在没有或很少游离水的潮湿固体培养基上生长与代谢的过程潮湿固体培养基上生长与代谢的过程 特点特点：投资少、能耗低、原料廉价：投资少、能耗低、原料廉价 传热传质差、效率低传热传质差、效率低 应用应用：生物农药、饲料、粗酶、食品等：生物农药、饲料、粗酶、食品等 确定优化目标确定优化目标 T S P+B+s 产率产率:P (g/L)转化率转化率:P/(S s)(%,g/g)生产强度生产强度:P/T (g/L.h)其他其他 确定影响因素确定影响因素 种子：种龄、接种量种子：种龄、接种量 培养基：组分、培养基：组分、pH、灭菌条件、灭菌条件 环境：温度、环境：温度、pH、通气、搅拌、压力、设备、通气、搅拌
7、、压力、设备发酵现象酿造食品工业非食品工业青霉素抗菌素发酵工业氨基酸,核酸发酵（代谢控制发酵）基因工程菌动物细胞大规模培养植物细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物 发酵工业的第一个转折点：非食品工业 发酵工业的第二个转折点：青霉素抗菌素发酵工业 发酵工业的第三个转折点：切断支路代谢转折点:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节,特殊调节控制的利用突变株的应用,前体、终产物、副产物等 发酵工业的近代转折点：基因、动物、海洋 好氧发酵技术：好氧发酵技术：速酿法从乙醇生产醋酸，速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代通气法大量繁殖酵母，用米曲
8、霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。生产干酪。19331933年等人发明了年等人发明了摇瓶培养法摇瓶培养法代替了代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。短。细胞大规模培养的优化技术对当前生物技术细胞大规模培养的优化技术对当前生物技术产业以及今后的潜在发展具有重要影响。产业以及今后的潜在发展具有重要影响。效益与意义抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保等行业医药、轻工、食品、农业、环保等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品基因工
9、程菌发酵基因工程菌发酵 特点：恒定的生理状态（比生长速率恒定），有利于微生 物生理特性和遗传特性的研究-动力学和最适培养条件的研究；基质在发酵罐中停留时间短，原材料转化率低，只能适用在生长快的微生物菌体；在长时间培养过程中菌种易变异，有可能产生适应特殊环境的负变异菌株，而且易于染菌。纯种发酵与无菌技术：纯种发酵与无菌技术：培养基灭菌、无菌空气、密闭设备与罐压、无污染接种种子扩大培养：种子扩大培养：一级或多级种子制备、种子质量控制发酵工艺控制：发酵工艺控制：温度、通气量、搅拌、消泡沫、pH、DO、培养基配比、菌丝形态、放罐时间、接种量、其他各种操作发酵罐与计算机控制：发酵罐与计算机控制：通气、搅
10、拌、密闭、各种高级控制 车间设计：平面与立面布置、管路设针 厂区设计：风向、绿化、人流与物流、生活区与工厂区 人员岗位与运行管理设计：基建及施工设计：背景背景 发酵工程控制发酵工程控制 “内部控制内部控制”：如何改变细胞的遗传组成和“发酵工程控制”细胞的代谢生理特性 “外部控制外部控制”：物理和化学环境条件控制外部控制是基于内部控制调节，但是在研究和过渡的方法上又是不同的。生化工程所面临的任务生化工程所面临的任务 就是在已已提供高产菌株提供高产菌株的基础上，如何把这些高产菌种在培养过程中进一步考察它的生理生化特性生理生化特性，稳定或改进微生物反应工艺过程，这里不仅要求对生物物性的动态有详尽的了
11、解，对生化反应做定量的和动力学方面的考察，还需具有工程学的技巧工程学的技巧，才能充分发掘和利用生物体系的潜力。另一方面，计算机技术的高度发展也在客观上为分析和优化控制这种复杂的发酵过程提供基础，因此，借助于计算机系统计算机系统对发酵过程进行数据处理，分析和控制就愈来愈成为人们的迫切要求。热力学研究只强调系统的起始态和终止态，给出反应可能进行到的最大程度。在发酵工程中常以得率系数概念Yi/j对各种基质形成菌体或产物的潜力进行评价 提出了许多数学模型：经验模型、机理模型；统计模型和非统计模型；结构模型和非结构模型 实际发酵过程是在生物反应器中进行，这就是宏观动力学研究，逐渐发展成生物反应工程背景因
12、次分析法因次分析法经验法则法经验法则法数学模拟法数学模拟法时间常数法时间常数法几何相似几何相似流体运动学相似流体运动学相似流体动力学相似流体动力学相似 同时满足这些相似条件是不可能的同时满足这些相似条件是不可能的 当在小试研究时某一个对生产产生影响的重当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素设有被观察到，而这个因素恰恰在放大时要因素设有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。背景微生物学生物化学分子生物学发酵工艺学化学工程现代控制理论各种工程开发参数检测(自动或手工检测)综合性研究：定性和定量的措述工业生产生化
13、工程传感器与计算机数据处理作为一个独立的技术领域被人们重视在线计算机多学科发展与综合多学科发展与综合 仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度、pHpH、DODO等等 缺乏微观的实时的代谢调控缺乏微观的实时的代谢调控代谢调控研究代谢工程研究发酵过程酶学研究的困难过程数据采集和处理的困难发酵工艺优化研究发酵工艺优化研究的基本思路的基本思路发酵罐背景和原理发酵过程优化与放大仍是发酵过程优化与放大仍是一个令人困惑的问题一个令人困惑的问题？对于活体细胞调控来说，采用传统的对于活体细胞调控来说，采用传统的生物学方法或化学工程的生物学方法或化学工程的调控调控方法，存在方法，
14、存在很大的问题，国内外都没有很好解决很大的问题，国内外都没有很好解决。背景 制造微生物生物量制造微生物生物量 PHB发酵发酵 黄原胶发酵黄原胶发酵 二元酸发酵二元酸发酵 丙酮酸发酵丙酮酸发酵 乙醇发酵乙醇发酵 Vc发酵发酵 单细胞蛋白单细胞蛋白 假丝酵母假丝酵母(Candida sp.)等等 面包酵母面包酵母 酿酒酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)微生物肥料微生物肥料 根瘤菌根瘤菌(Rizobium sp.)微生物农药微生物农药 苏云金杆菌苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)三次采油三次采油 解烃棒杆菌解烃棒杆菌(C.hydrocarbocl
15、astus)等等 环境治理环境治理 芽孢杆菌芽孢杆菌(Bacillus sp.)等等 卡介苗卡介苗 无毒结核分枝菌无毒结核分枝菌(Mycobacterium tuberculosis)(glycolysis)Glucose pyruvate acetyl-CoA TCA 3-ketothiolase acetate acetoacetyl-CoA reductase R-(-)-3-hydroxybutyryl-CoA PHA synthesis 氮源限制氮源限制 PHB 野油菜黄单胞菌（野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）产）产生的胞外多糖，发酵液粘度可达生的胞外多
16、糖，发酵液粘度可达7000cp 非牛顿型发酵非牛顿型发酵CH3(CH2)nCH3 -oxidationCH3(CH2)nCOOH CH3(CH2)n-2COOH -oxidationHOOC(CH2)nCOOH水、油、气、固多相反应水、油、气、固多相反应-氧化与氧化与-氧化氧化 Glu Lat Pyr EtOH TCA 营养（维生素、氨基酸）限制营养（维生素、氨基酸）限制 溶氧控制溶氧控制 产物抑制问题产物抑制问题 原料成本问题原料成本问题 弱氧化醋杆菌弱氧化醋杆菌 “大、小大、小”菌混合菌混合山梨醇山梨醇 山梨糖山梨糖 2-酮基酮基-L-古龙酸古龙酸 丙酮丁醇是良好的有机溶剂机合成工业的重要
17、原料。1861年巴斯德发现细菌能产生丁醇。1866年英国最早用丁二烯作为合成橡胶的原料加速了丙酮丁醇工业的商品化生产。19081911年汽车工业需要橡胶，制造人造橡胶的丙酮丁醇需要量大增。1914年Chain Weizmann分离到丙酮丁醇菌，丙酮丁醇产量提高4倍，使该行业开始进入工业发酵生产阶段。1916年在第一次世界大战期间，丙酮用于制造无烟火药，需量剧增，于是着手研究发酵法生产的改进，直到1930年完成生产工艺。发酵法生产丙酮丁醇一直是当时的主要方法。1960年后，由于以石油为原料的化学合成丙酮丁醇更经济，美国和其它一些国家相继停止了发酵生产。我国现在是两种方法并用。(一)合成法 例如，
18、用稀酒精催化制丙酮，用石油气中的丙烯制成异丙醇，再经氧化脱氢制丙酮；用丙烯与苯制成异丙苯，再氧化制丙酮及苯酚。丁醇的合成有乙醛缩合加氢、丙烯羧化加氢和乙醇直接合成丁醇等。（如下式）(二)发酵法 和酒精发酵样，以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和野生植物等为原料，利用丙酮丁醇菌所分泌的酶来分解淀粉成糖类再经过复杂的生物化学变化，生成丙酮、丁醇和乙醇等产物，同时还产生大量的CO2棚H2等副产品。丙酮丁醇菌在广义上属于丁酸菌族。丁酸菌是嫌气性的，有鞭毛，能运动的杆菌在产生孢子时成为纺锤状或鼓槌状。细胞内含有淀粉拉，能被碘液染成深蓝色。丙酮丁醇菌除具有丁酸菌的通性外，还具有能发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能力。
19、在中性培养基中发酵时，一般丁酸菌和丙酮菌均能产生丁酸和醛酸、当培养基的酸度增加到一定数值后，一般丁酸菌即停止发酵，并且菌体的繁殖也停止但是丙醇丁醇菌则不然，当培养基的酸度达到最高点后，由于有脱羧能力，酸度反而下降，并且产生中性的产品-丙酮、丁醇、乙醇等(图31)。由于丙酮丁醇菌的上述持性，为区别于般丁酸菌，将能引起丙酮、丁醇发酵的细菌命名为丙酮丁醇菌。几种与丙酮丁醇茵类似的梭菌简述如表31。(1)丙酮丁梭菌：能发酵玉米、马铃薯等淀粉质原料和蔗糖等糖质原料而产生溶剂，CO2，H2和少量有机酸。溶剂的比例为：6份丁醇3份丙酮：1份乙醇，即B：A：E6:3:1，不同的变异株有不同的比例数。发酵温度为
20、35-36用玉米发酵时玉米浓度为5一8，用马铃薯时，发酵醪中鲜马铃薯量为20，在4860 h就可以发酵结束。(一)丙酮丁醇菌的分离与纯化方法 在土壤、细泥、粪便中及新鲜果实、蔬菜的表面上均有丙酮丁醇菌存在。利用它的孢子的嫌气性和耐热性，可以采用热淘汰法和单细胞分离法以获得优良的菌种。由于丙酮、丁醇发酵时，易受杂菌侵染而导致酸败所以，丙酮丁醇工厂须经常进行菌种的分离与纯化工作，以保证正常生产。所谓热淘汰法，即将含有丙酮丁醇菌的试样接入5的玉米醪试管内再放在沸水浴中1-15min，杀死不耐热的杂菌和热抵抗力较差的孢子，而保留对热抵抗力较强的丙酮丁醇菌孢子，然后在爆气状态下培养。培养液产生大量气体，
21、这时可转接到新鲜培养基试管内，同法进行热淘汰和嫌气培养，如此反复多次，即可获得较好的菌株。欲获得纯培养或者需从发酵醪中选取优良菌株，可用嫌气平板进行单菌落分离。如用有明胶或碳酸钙的培养基，则可能出现溶解圈。然后接入玉米醪中测定气体产生量和丙酮产量。获得的优良菌种用沙土管保存。1 试管菌种的培养：选取优良菌种的砂土孢子12g，接入10 m l 5浓度的玉米醪中，并将此管在100 C沸水中热处理12 min，急速冷却至37然后置于真空干燥器内进行培养(2666 Pa以下温度保持在3739)。2种母瓶培养：将一支试管菌种接种到盛有5浓度的玉米醪液的种母瓶中，在常压下培养24h，即可接入第一种母瓶。一
22、船丙酮丁醇菌孢子萌发时，要求嫌气条件较高，营养体繁殖时，由于本身产生的H2和CO2已能满足嫌气条件。3第一种母罐：其中盛有6浓度的玉米醪接入种母瓶的醪液培养12一15h后，即可按入第二种母罐。4第二种母罐：其中盛有8浓度的玉米酵，接入第一种母罐酵液，培养20 h左右，然后将总量l3一12送入发酵罐。制备种醪的方法有间歇调制种醪法，半连续调制种酵法，利用部分发酵醪制种醪法。(一)发酵醪制备 目前国内都以8玉米粉作发酵酵。原料经粉碎蒸煮即可。蒸煮发酵醪时常加入一定量的废醪(10-25%)，这不仅增加部分营养，而且降低粘度。蒸煮过程也是灭菌 过程，因而蒸煮多以高温连续蒸煮为主(方法同酒精发酵)然后
23、冷却进入发酵罐，制备好的种醪也从种母罐同时流入发酵罐。(二)发酵过程生化变化 发酵过程通常经过三个阶段，即前发酵期、主发酵期和后发酵期，整个发酵过程经40一72h结束。1前发酵期：主要为种菌繁殖期。细胞数激增，酸度增加，所以又称为增酸期，由于丙酮丁醇菌细胞活动的结果，也产生少量的溶剂，主要的发酵产品为醛酸、丁酸、氢气、二氧化碳等。此时淀粉的消耗量为30左右，丙酮丁醇菌和其它细菌不同，它所需的诱发期很短，很快即可增殖，通常前发酵期为开始发酵后的1518h。2主发酵期：丙酮丁醇菌已能旺盛发挥它的发酵特性，将前一阶段产生的醋酸、丁酸等变为丙酮、丁醇等溶剂的阶段 在此阶段气体发生量达到最高蜂，溶剂生成
24、很快，酸度下降至原有酸度的12左右，所以又称减酸期，此时期在1840 h后。3后发酵期：酸度达最低后，又稍为上升，维持定水平至发酵结束，所以又称酸度复升期。此时所积聚的酸主要为不挥发酸，挥发酸量和溶剂也稍有增加，但是由于丙酮丁醇菌在此时期开始自溶，以及部分丙酮丁醇菌产生孢子所以活动的丙酮丁醇菌逐渐减少，发酵逐渐衰弱以至结束。此时期在40一70 h。有间歇发酵法(包括一次加料法、分次流加法)串联式发酵法相连续发酵法，目前多采用串联法和连续发酵法。1温度：最适发育温度为3637。正常生长时期最高温度为40 左右，有试验表明，当发酵温度增高时溶剂产量降低，残余糖量增加。2培养基的PH值：培养基中性时
25、，丙酮丁醇菌具有使淀粉发酵成丁酸、醋酸等的能力，而使pH下降，而在酸性培养基中具有将醋酸、丁酸变为丙酮丁醇的能力，丙酮丁醇菌繁殖的最适pH值为5.57.0。3培养基的氧化还原值：丙酮丁醇菌是嫌气菌。氧对它有毒害作用。嫌气条件不仅和氧有关，而且更和培养基的氧化还原值有关。通常rH279能正常发酵，当rH2向氧化方面变动为102时则不能进入第二阶段发酵；当rH2再大时，菌种不仅不能发育而且逐渐死亡。当PH低于4或高于8时，细菌的繁殖完全停止，不同的生长阶段有所不同，第一阶段pH值可以较高，如果开始pH过低，丙酮丁醇菌会生长不良，在发酵第二阶段，最适PH值下降为4353较适合。丙酮丁醇菌因为发酵时能
26、产生氢气、CO2，所以，只要开始发酵时能建立嫌气状态，以后则由于培养基继续为放出的氢和CO2所饱和，就能阻止空气中氧气入内，并且醪液是胶状物，培养基的粘度和固体颗粒对造成嫌气条件也有帮助。4醪液与发酵产物浓度：丙酮丁醇菌虽然能产生丙酮丁醇，但如果醪液中丙酮丁醇量过高时，对菌本身有毒害。所以丙酮丁醇发酵时所采用的醪液浓度般为8一10。在发酵醪内溶剂的最高浓度只能达到25g/L(25)。其中包括丙酮0.85丁醇1.5，乙醇0.15。发酵醪中丁醇量如超过15，对丙酮丁醇菌则有抑制作用因此丙酮丁醇发酵时，醪液的浓度需要配合菌种能忍耐溶剂的浓度来决定。其它如发酵时产生的糠醛，原料中的单宁等对发酵都有一定
27、影响。为了增强发酵法的竞争力，提高溶剂产量是根本任务。1菌种选育。由于菌本身受溶剂的影响很大，特别是丁醇的浓度，在发酵液中一般达到1%时，即为致命的水平(丙酮的毒性较低，一般菌能耐2.9的浓度)因此，溶剂产量的高低往往与菌株对丁醇的耐力有关。在丁醇的存在下，采用常规的诱变手段(如亚硝基胍)，可以获得一定量的高产菌株。现发现耐丁醇的突变株与野生型菌株的细胞膜类脂成分有所不同。当野生型菌株的生长进入稳定期时，不饱和脂肪酸的百分率与饱和脂肪酸百分率比值的增加是一致的，可是耐丁醇菌株，在同一时期在这比率上呈现出明显的变化，即不饱和脂肪酸的比例随时间延长而增加。这表明，通过合成不饱和脂肪酸，耐丁醇的突变
28、株可建立起一种补偿由丁醇引起膜流动效应的机制，它使得微生物维持在种等粘度的膜状态。Westhuizem等人曾报道丙酮丁醇梭菌(1yt-1）的不产自溶素突变株比亲本菌株(P262)更抗丁醇，说明耐丁醇和自溶素活力间有一定的相关性对于丙酮丁羧菌的基因转移系统也做了各种基础研究，尚有很多难点未能突破，如外源DNA难于进入丙酮丁醇菌内，没有合适的用于转导的克隆载体等。2发酵过程中，加入乙酸和丁酸的作用。有一试验表明，在正常的培养基中，于接种后和培养24h后加入2g/L和5g/L或2g/L的乙酸和丁酸，其效果见表32。从表32中可以看出，接种后加入2g/L的乙酸，可增加丙酮的形成总溶剂达234，并使糖的
29、转化率从324提高到341。加入2gL丁酸，则增加总的溶剂量，糖转化率达351。同时加入合适浓度的乙酸和丁酸，总溶剂达到24.7gL，丁醇与丙酮的比为2。3消除培养液内还原性化合物，如用真空法、通氯法等消除氢气，有利于提高产量。4培养液适当的碳氮比是获得正常的溶剂产量的关键，高与低的比例均非适宜。5消除溶剂对菌的抑制作用，如加蓖麻油活性炭、多种聚合树脂等的吸附发酵；加入油醇等的萃取发酵；不断的移去产生的溶剂，不断的补加碳源(见图32)。7固定化细胞的溶剂生产。例如，可以用海藻酸钙固定菌细胞或孢子以N2维持嫌气和无菌。固定的营养细胞如果处于溶剂产生期，在整个延续期间，溶剂会连续产生。固定化孢子可
30、以避免细胞代谢活动的干扰。在胶体内的活性细胞充分生长后，能够恢复高生产能力，结果表明连续生产完全可能。固定化细胞的丁醇产率比常规的分批工艺要高得多。最近实验的结果有助于更好理解培养基组成对丙酮丁醇菌的影响。未解离的丁酸似乎是调节溶剂产生的主要因子，图33推断菌体生长和代谢受本身代谢物调节的示意图。未解离的丁酸抑制细胞生长和产酸，同时启动丁醇的产生。NH4+激活细胞生长和产酸，但过剩的氮抑制溶剂的产生。分批发酵中，未解离的丁酸浓度在0.2-0.4g/L，即出现抑制生长和产酸。未解离酸浓度达0515g/L时，自然的会启动溶剂的产生。如达不到临界酸浓度(可能pH太高或初糖浓度太低)溶剂就不会形成。连续发酵处于平稳状态时，即使很低的酸浓度，溶剂也能产生。
