1、高效液相层析法高效液相层析法 及其在生化研究中的应用及其在生化研究中的应用 高效液相层析法（HPLC,high performance liquid chromatography）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高,选择性高，分析速度快，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。层析法的本质层析法的本质 色谱柱高选择性的高效能的分离作用与高色谱柱高选择性
2、的高效能的分离作用与高检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中检测技术的结合。混合组分的样品在色谱柱中分离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分离的依据是：同一时刻进入色谱柱中的各组分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或分，由于在流动相和固定相之间溶解，吸附或离子交换等作用的不同，随流动相在色普柱中离子交换等作用的不同，随流动相在色普柱中运行时，在两相间进行重复多次（运行时，在两相间进行重复多次（103103106106）的分配过程，使原来分配系数具有微小差别的的分配过程，使原来分配系数具有微小差别的各组分产生了保留能力明显差别的效果。各组分产生了保留能力明显差别的效果。进而进而各组分在色普
3、柱中移动速度不同，经过一定长各组分在色普柱中移动速度不同，经过一定长度的色普柱后，彼此分离开，最后按顺序进入度的色普柱后，彼此分离开，最后按顺序进入信号检测器，在记录仪上或色普数据机上显示信号检测器，在记录仪上或色普数据机上显示出各组分的色普行为和谱峰数值。出各组分的色普行为和谱峰数值。层析法可用于定性，半定量，定量层析法可用于定性，半定量，定量的测定。其定性分析的依据是出峰的时的测定。其定性分析的依据是出峰的时间。而定量的依据是；组分重量或在在间。而定量的依据是；组分重量或在在载气中的浓度与检测器的响应信号成正载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。此响应信号指峰面积或峰高，表示比。此响应信号
4、指峰面积或峰高，表示为为w wi i=f=fi iA Ai i,w,wi i为欲测组分为欲测组分i i的量，的量，A Ai i为组分为组分i i的峰面积，的峰面积，f fi i为比例系数为比例系数 （称校正因子）（称校正因子）高效液相层析法的基本概念和分离理论与高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。析。高效液相层析仪高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用
5、一高压泵输入。柱与检测系统三部分。流动相用一高压泵输入。这种高压泵应满足以下条件：这种高压泵应满足以下条件：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂腐蚀。能抗溶剂腐蚀。有较高的输出压力，一般要达到有较高的输出压力，一般要达到1515300kg/c300kg/c，也有的高达，也有的高达800kg/c800kg/c。泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两泵的死体积要小。梯度洗脱装置必须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改
6、变流动相的组成，以改善分离效果。改变流动相的组成，以改善分离效果。一般用微量注射器直接进样，也可采用六一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。通阀门进样。HPLCHPLC中所用的检测器最多应用的中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测是紫外吸收检测(UV)(UV)，灵敏度可达，灵敏度可达ngng水平。此水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。学检测器等。高效液相层析仪的结构简图高效液相层析仪的结构简图 HPLC HPLC的类型与应用的类型与应用 液液-固吸附层析固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的固定相是具有吸附活性
7、的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。液等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为用不同，分为“底剂底剂”和洗脱剂两类，底剂起和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已
8、烷、环已烷、般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。液液-液分配层析液分配层析：固定相为单体固定液构：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的
9、液液-液层析称为化学键合相层析。另一种利用液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。液分配层析为离子对层析。化学键合层析分化学键合层析分：极性键合相层析极性键合相层析：固定固定相为极性基团，氰相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为的后出峰，这称为正相层析正相层析法法，适用于分离，适用于分离极性化合物。极性化合物。非极性键合相层析非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基固定相为非极性基团，
10、如十八烷基（C C1818）、辛烷基（）、辛烷基（C C8 8）、甲基与苯基等，）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称好与正相法相反，故称反相层析反相层析。本法。本法适用于小分子物质的分离，如
11、肽、核苷适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。酸、糖类、氨基酸的衍生物等。离子交换层析：离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交原理与普通离子交换相同。在离子交换换HPLCHPLC中，固定相多用离子性键合相，中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相故本法又称离子性键合相层析。流动相 主要是水溶液，主要是水溶液，pHpH值最好在被分离酸、值最好在被分离酸、碱的碱的pKpK值附近。值附近。应用应用 高效液相层析法适用于分析沸点高，分高效液相层析法适用于分析沸点高，分子量大，热稳定性差的物质，它们约占子量大，热稳定性差的物质，它们约占全部有机化合物
12、的全部有机化合物的8080，现在高效液相，现在高效液相层析法已经在生物化学，生物工程，医层析法已经在生物化学，生物工程，医药研究，食品分析，环境污染分析和精药研究，食品分析，环境污染分析和精细化工分析中广泛应用。细化工分析中广泛应用。下面举几个例子下面举几个例子核苷，核苷酸和核酸的分析研究 在高效液相层析法发展中一直处于在高效液相层析法发展中一直处于核心地位。嘧啶和嘌呤皆为含有核心地位。嘧啶和嘌呤皆为含有N N原子的原子的杂环化合物，五种核碱皆在杂环化合物，五种核碱皆在240240280nm280nm呈现强的紫外吸收特性，适于用呈现强的紫外吸收特性，适于用UVDUVD检测。检测。反相键合相色谱
13、作为检测反相键合相色谱作为检测DNADNA合成的有效合成的有效手段，已用于分析人工合成手段，已用于分析人工合成DNADNA碎片的组碎片的组成。成。在反相键合柱上核苷和核碱的分离在反相键合柱上核苷和核碱的分离abc(a)核苷的分离 (b)核碱的分离(C)核苷与核碱混合物的分离1-胞苷；2-尿苷；3-黄苷；4-肌苷(次黄嘌呤核苷)；5-鸟苷；6-胸苷；7-腺苷；8-胞嘧啶；9-尿嘧啶；10-次黄嘌呤；11-鸟嘌呤；12-黄嘌呤；13-胸腺嘧啶；14-腺嘌呤在在C18C18柱上分离核苷酸和核苷柱上分离核苷酸和核苷1-CDP；2-CMP；3-UMP；4-GDP；5-GMP；6-C；7-ATP；8-U；
14、9-AMP；10-G生物胺（Bioamine）的分析研究 生物胺是生物机体新陈代谢过程产生物胺是生物机体新陈代谢过程产生的胺类化合物，它们是由肾上腺髓质生的胺类化合物，它们是由肾上腺髓质分泌的，既属于激素，又是神经递质。分泌的，既属于激素，又是神经递质。此类化合物的紫外吸收弱不适于生物样此类化合物的紫外吸收弱不适于生物样品的微量或痕量检测，现多利用柱前或品的微量或痕量检测，现多利用柱前或柱后的荧光衍生法，使用荧光检测器检柱后的荧光衍生法，使用荧光检测器检测。一般用反向色谱，反向离子对色谱测。一般用反向色谱，反向离子对色谱或阳离子交换色谱来实现分离。或阳离子交换色谱来实现分离。在胺基键合相柱分离甾体药物在胺基键合相柱分离甾体药物S-溶剂；i-溶质1-孕甾酮；2-雄甾烯二酮；34-娠烯-20-醇酮；4-17-羟基孕甾酮；5-肾上腺甾酮；6-乙酸可的松；7-可的松；8-氢化可的松
